MUCUS HYPERSECRETION AND CHRONIC RESPIRATORY DISEASE

気道への粘液分泌過多は、慢性肺閉鎖疾患（COPD）やぜんそく、嚢胞性線維症など重度の慢性肺疾患の多くの患者で病的状態と死亡率への重要な一因になっています35。 気道の過剰な粘液は空気の流れを制限し、その存在は、胸部感染症を起こしやすいCOPD患者にとって特に危険因子となります。 COPDは、慢性気管支炎（長期にわたる気道粘液分泌過多）、小気道疾患、肺気腫の3つの疾患からなる気道の重症慢性炎症性疾患です36。COPDは、世界的に有病率と経済的負担が増加しています37、38。COPDにおいて、慢性粘液分泌過多の患者は、顕著な気管支炎成分を持たない患者と比較して入院と死亡のリスクが著しく高くなります39、40。 COPDの現在の治療法は緩和的であり、病気の進行を止めるものではありません41。COPDの病態生理のどの側面に対しても有効な治療法がないため、粘液分泌過多に対する治療法の開発が望まれています42。 気道繊毛運動によって肺から粘液を除去する能力は、その粘性と弾力性に依存する。 MUC5ACとMUC5Bは、正常および病的なヒトの気道分泌物における主要なムチンである44。 COPD患者では、呼吸器粘液中のMUC5ACとMUC5Bのレベルが上昇しているが、比例してMUC5Bが多く分泌されている45。ムチンは、上皮の杯細胞および粘膜下層の粘液腺から気道に分泌される43。 粘液分泌を阻害する一つの可能性は、クロストリジウム神経毒エンドペプチダーゼの小胞融合に対する阻害活性を利用し、適切なターゲティングリガンドを用いて気道のムチン分泌細胞に標的化することである。

適切な標的化クロストリジウムエンドペプチダーゼがヒト呼吸器上皮細胞のSNAREタンパク質を切断し、それによって粘液分泌を阻害するかどうかを調べるために、BoNT/CのLHNドメインをコードする遺伝子とEGFから融合タンパク質を作り、ムチン分泌細胞のEGF受容体を標的にし、EGF-LHN/Cと名付けた34。 EGF は、ヒト呼吸器上皮細胞46,47 に存在し、喘息や COPD48 の患者や喫煙者の気道上皮で発現が増加していることから、このような融合タンパク質を作成するためのプロトタイプリガンドとして選択された49。 34 H292 細胞を EGF-LHN/C で前処理すると、EGF と腫瘍壊死因子α （TNFα）の複合刺激に対するムチンの放出を濃度依存的に阻害し、IC50 は約 0.4 nM であった（図 28-1）。 これは、以前に報告された別の呼吸器上皮細胞株、ヒトII型肺胞細胞株A549からの同じ刺激に対するEGF-LHN/Cの阻害効果と非常によく比較される34。両細胞型において、ムチン分泌の基礎レベルに対するEGF-LHN/Cの検出可能な効果はなかった。 EGF-LHN/Cによるムチン分泌の抑制は、EGF受容体を介したエンドペプチダーゼ活性の標的化送達によるものであり、細胞の細胞毒性や受容体の拮抗作用やダウンレギュレーションの結果ではない34。 EGF-LHN/C は、1 ng/mL のインターフェロン (IFN)-γ, TNFα, インターロイキン (IL)-1β を組み合わせたサイトミックスと呼ばれるサイトカインの刺激カクテルに反応した A549 細胞からの刺激性ムチン放出を抑制することもできる（図 28-2）。 したがって、呼吸器上皮細胞からの刺激されたムチン放出に対するEGF-LHN/Cの効果は、使用された刺激の正確な性質とは無関係である。 組織学的な検査では、ムチンが処理された細胞の内部に保持されていることが示された（Fig.） 対照細胞は細胞内ムチンを染色しているが、刺激された細胞は染色が著しく減少しており、ムチンが分泌されていることを示している。 EGF-LHN/Cで前処理した刺激細胞は、細胞内の染色が保持されており、EGF-LHN/Cによる分泌の抑制を示す。 このような細胞内ムチンの保持に対する細胞の反応を評価するために、ムチン合成の指標としてMUC5AC mRNAレベルに対するEGF-LHN/C前処置の効果を測定した。 EGF-LHN/C前処理は、EGF-TNFα誘導のMUC5AC mRNA発現を濃度依存的に抑制し、IC50値は約0.1 nMである（Fig.28-4）。 EGF-LHN/Cのこの効果は、細胞からの刺激されたムチンの放出抑制と同様に、EGF受容体を介したエンドペプチダーゼ活性の標的送達によるものである。なぜなら、EGF受容体を標的とするEGFリガンドを欠いたLHN/Cや触媒領域の3残基の変化によってエンドペプチダーゼ領域を不活性化した融合タンパク質の変異型（EGF-TE-LHN/C）は、MUC5AC mRNA発現を阻害しないのに対して、EGF-LHN/CはEGFの受容体を介して、その活性を制御することができるからである。 このEGF-LHN/CのMUC5AC mRNA発現抑制効果は、呼吸器上皮細胞におけるムチン放出とムチン合成の間の負のフィードバック機構の可能性の存在と、組換えクロストリジウムエンドペプチダーゼによる分泌抑制に応答して遺伝子発現がダウンすることを示唆するものであった。

EGF-LHN/Cに代表される粘液分泌を抑制できる組換えクロストリジウムエンドペプチダーゼ融合タンパク質は、COPD、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、および気道粘液の過剰分泌を伴う他の慢性呼吸器疾患の治療タンパク質として開発する可能性がある。 タンパク質の活性が長く持続するため、製品はまれにしか吸入する必要がなく、この種の慢性呼吸器疾患の治療に適していると考えられます

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