Junction Melting

ホリデイ接合のバルク熱力学特性を予測する3SPN.2モデルの適用性を評価する最初のステップとして、3SPN.2モデルのシミュレーションから接合溶融特性を評価し、我々の吸収実験と比較した。 我々は、部分溶融状態のサンプリングを改善するために、レプリカ交換分子動力学（REMD、方法参照）により接合溶融のシミュレーションを行った。

図2は3SPN.2モデルと吸光度の両方について、塩濃度の範囲における一本鎖割合αをTの関数として示したものである。 シミュレーションにおけるαの定義については方法を参照。 シミュレーションと実験との間の類似性は顕著である。 シミュレーションと実験の両方が、塩濃度の増加とともに融解温度が上昇し、転移がますます鋭くなること、すなわち「協力的」であることを示している。 このデータは質量作用の法則、またはvan’t Hoff関係によってよく記述できる46,

J34接合部の溶融特性

(a)simulation and (b)experiments からの1ストランド率αを比較した結果。 実線で示したvan’t Hoffの式（式1）を用いてデータをフィットさせた。 慣例に従い、α=0.5となる温度をTMと定義する。

ここで、Kは接合融解の平衡定数、ΔHとΔSはこの温度範囲で一定と仮定した融解した接合部と無傷接合部のエンタルピーとエントロピー差、Cは全鎖濃度（各鎖濃度はC／4）である。 なお、ΔSは融解転移の鋭さを制御する。 以下、ΔHとΔSの挙動について述べる。ΔHは0.1<α<0.9

の範囲でフィッティングデータから決定される。2005>融解温度TMは接合安定性の熱力学的指標として有用で、α=1/2となる温度と一般に定義される。 図3は、塩濃度の関数として、実験とシミュレーションのTM値を示している。 融解曲線から予想されるように、シミュレーションはTMの実験依存性を忠実に反映している。 また、量的な類似性も顕著である。 シミュレーション結果は一貫して5～8 K高い温度へとシフトしており、その差は3%未満である。 実験とシミュレーションの両方で、融解温度は200 mM以上では塩濃度にほとんど依存しなかった。 この独立性は、高塩濃度における静電相互作用の遮蔽に関係している。したがって、図3は、静電相互作用のデバイ-ヒュッケル近似に3SPN.2モデルで使用したデバイ遮蔽長も示している。 高塩濃度では＜6152＞6Åであり、静電反発は重要でないことがわかる。 実験とシミュレーションのTM値の対応は、3SPN.2モデルにおける静電の近似的な取り扱いを検証するものである。 3SPN.2モデルは二重鎖B-DNAの融解を模倣するようにしかパラメータ化されていなかったことを考えると、接合融解のデータは3SPN.2モデルがより複雑なDNA構造の熱力学に転用可能であることを示唆するものであった。 同時に、各アームの融解は通常の二重鎖DNAの融解と非常に似ているはずなので、この発見は全く予期していなかったというわけではありません。

接合融点TMの塩濃度依存性

すべての濃度で、TMは3SPN.2の間で6152>3％違っている。 シミュレーション(緑丸)と吸収実験(赤菱形)の間でTMは<3%異なっている。 線はあくまで目分量である。 図には、3SPN.2モデルが静電相互作用のDebye-Hückel近似で用いたDebye遮蔽長も示されている。 融解温度のプラトーは静電相互作用の強いスクリーニングと一致する。

van’t Hoff関係（式1）を用いてデータをフィットすると、融解のエンタルピーとエントロピーの推定値が得られる。 このフィットから得られるΔHとΔSの値は、SantaLuciaと共同研究者47,48によって決定された熱力学的パラメータに基づいて予想される正しい大きさのオーダーであった。 図4の挿入図は、シミュレーションがΔHとΔSを実験よりやや過大評価し、ΔHがΔSとほぼ直線的に変化していることを示している。 この線形関係は、「補償」関係と呼ばれることもある。 実際、van’t Hoff方程式はΔHとΔSの間の特定の関係を意味している

接合溶融のサーモダイナミックス.

実験（赤菱形）とシミュレーション（緑丸）をvan’t Hoffの式（式1）にフィットさせて得られた融解のエントロピーΔSとエンタルピーΔH。 内線は近似的な線形エントロピ-エンタルピ補償関係を示す。 実験値、シミュレーション値ともにTMで評価したvan’t Hoff式（式2、青線）とよく一致している

これはTMでα=1/2とすることにより式1より導かれる。 図4はこの関係との整合性を示し、ΔHとΔSの線形補償が近似的なものに過ぎないことを明らかにした。もしTM値が濃度によってより大きく変化すれば、ΔHとΔSの線形性からのずれはより明確になるが、式2は引き続き有効であると思われる。 より重要なことは、これらの結果が3SPN.2モデルが実験データとほぼ一致する接合部のエネルギー的、熱力学的特性を再現するのに有効であることを示していることです。 実験的に、低塩濃度では開いた平面型が優勢であり、高塩濃度では接合は積層型になることが知られている（図1）。 比較的高濃度の50 mMとT = 298 Kでは、スタックドアイソフォームI/IIがそれぞれ23/77%の相対的存在比を示すことが実験的に示されている15。 ここでは、3SPN.2モデルを用いて、T = 300 Kで広範囲の塩濃度を調べ、モデルを検証し、接合集団の塩濃度依存性の全体像を予測する。

Thirumalaiらが強調したように26，四方接合の時間平均とアンサンブル平均（エルゴード性）の間の対応は，接合構造間の変換速度のため，かなり大きな観測時間スケールで崩れる可能性がある． したがって、積層コンフォーマーの相対的なポピュレーションを推定するためには、かなりのシミュレーションのアンサンブルが必要です。 そこで、各塩濃度について、100回の独立したシミュレーションを行った。各シミュレーションは開放配置から始まり、この配置はiso-Iまたはiso-IIのいずれかに迅速かつランダムに変換されるため、この配置から始めた。 各シミュレーションは2μs実行され、各塩濃度について合計200μsの軌道データが得られ、100の独立したサンプルに分割されます。 これにより、各コンフォメーションの相対的な母集団を初期に推定することができます。 この推定値に基づいて、開状態、iso-I、iso-IIの初期配座の比率で100回のシミュレーションを行い、開状態からの開始が結果に影響を与えるかどうかを確認しました。 その結果、母集団推定値は統計的な不確かさの範囲内で安定しており、開放状態から開始することによる大きな影響は認められませんでした。

接合集団の評価には、3つの主要な接合コンフォメーションを正確に区別する指標を特定することが必要である。 実験的には、FRET研究は一般的に選択腕の端間の距離（二重鎖間角度を定義する）を用いてコンフォーメーション状態を区別する。 我々は当初、二重鎖間角度を調べたが、後述するように、IDAは各アイソフォームで大きく変動し、コンフォメーションを明確に区別することが困難であることを見出した。 その代わりに、ジャンクションの中心付近の塩基間距離が、ジャンクションのコンフォメーションについてより信頼できる指標となることを見出した。 これらの距離は、6-メチルイソキサントプテリン（6-MI）や2-アミノプリンなどの一対の蛍光性塩基アナログを用いて、接合部中心付近に注意深く配置することで実験的にアクセスすることも可能であるはずである。 図1の下段は、接合部の中心にある8つの塩基をiso-I、iso-IIコンフォーマー、および開いた状態で示したものである。 iso-Iコンフォーマーでは、T塩基（XおよびH鎖上）の距離dTTとC塩基（同じくXおよびH鎖上）の距離dCCは、AおよびG塩基（BおよびR鎖上）の距離dAGよりはるかに小さく、iso-IIコンフォーマーでは、逆スタッキングにより相対距離は逆の挙動となる。 開放型では、これらの距離はすべて似ているが、積層型のiso-IとIIコンフォーマーの距離より大きい。

したがって、これらの塩基間距離に基づいてiso-IとIIを区別することができるはずである。 これを確かめるために、図5に塩基間距離P(dTT∪dCC)とP(dAG)の正規化頻度分布をプロットすると、50 mM以上のすべての濃度で2つの異なるピークの存在が確認される。 P(dAG) (Fig. 5a)では、分離の小さいピークはiso-IIコンフォマー状態を示し、分離の大きいピークはiso-Iまたはオープンコンフォメーションに起因していることがわかった。 P(dTT∪dCC) (Fig. 5b)では、小さい距離にあるピークはiso-I状態、大きい距離にあるピークはiso-IIまたはopenコンフォメーションによるものであることがわかった。 我々は、分布の最小値の近似的な位置である12Åの距離のカットオフを採用し、接合部を積層型iso-Iまたはiso-IIコンフォーマーのいずれかとして区別しています。 iso-IでもIIでもないコンフォーメーションはオープン・コンフォーマーとして分類された。 図5

Criterion for distinguishing junction conformations.の図。

接合部中央の塩基間距離の分布。(a)AG塩基は距離が小さいとアイソIIコンフォーマー、(b)TTまたはCC対は距離が小さいとアイソIコンフォーマーと識別される。 低塩濃度での長い距離のピークはオープンコンフォメーションによるもので、高塩濃度では主に相補的なスタック型に起因する。 縦の点線は、その後、個々の配座のコンフォメーション状態を識別するために用いたカットオフ基準を示す。

これらのコンフォーマーを区別する基準を用いて、個々の配座を3つのアイソマーのいずれかと識別し、300 mMにおける5つのシミュレーションの接合コンフォメーションの代表的時系列を図6aに示す。 図7aは、これらのコンフォーマーの代表的な配置を示したものである。 この時系列データから、開放型コンフォーメーションは極めて短命で、長命なiso-Iとiso-IIコンフォーマーの間の遷移状態として働くことが定性的に示された。 このことは、これまでにも1分子実験から推測されていたが8,15,16,50、本研究では平衡コンフォーマー状態間の遷移機構を明示的に観測し、確認することができた。 3つのコンフォーマー間の9つの遷移確率（同一コンフォーマーへの遷移を含む）を評価することにより、中間体としての開放型コンフォメーションの役割を定量的に示しました。 図6bは、Iso I→IIとII→Iの遷移確率が、これらのプロットのスケールでは驚くほど小さいことを示しています（ゼロ、我々の計算の不確かさの範囲内）。 その結果、積層コンフォーマー間の唯一の経路は、オープンコンフォーマーを経由することになり、遷移状態として確立されます。 図6cは、積層型コンフォーマーと開型コンフォーマーの間の遷移確率が塩濃度によってどのように変化するかを示しており、低塩濃度では開型コンフォーマーへの遷移が支配的であることがわかる。 また、図6aの5つの時系列は、データの時間平均がサンプルごとに異なることを示している。 明らかに2μsはコンフォーメーションアバンダンスのエルゴードサンプリングには不十分であり、シミュレーションのアンサンブルを使用する我々のアプローチが必要である。 このアプローチは粗視化モデルでは可能ですが、全原子モデルでは現在の計算機資源では無理です。 この「壊れたエルゴード性」は、コンフォメーションサンプリングが大きな時間スケールで非エルゴード的であるという実験的知見と同様である26。 しかし、この壊れたエルゴード性は、コンフォメーションサンプリングの確率的性質によるものであり、文献26の実験では、個々の接合へのイオンの結合のばらつきも役割を果たしていることを指摘しておく必要がある。

Molecule-to-molecule variations in conformational sampling and conformational transition probabilities.

(a)example time series of junction conformation for five of the 100 ensemble members at = 300 mM. (100人のメンバーのうち5人のコンフォメーションの例を示す)。 オープンアイソフォームは短寿命で、iso-Iとiso-IIの間の遷移状態として作用する。 (b) 300mMにおける、ある開始状態から最終状態への遷移確率のマトリックス。 同じ状態への遷移確率（対角要素）は示していない。なぜなら、現在の状態に留まる傾向が他の遷移確率の尺度に支配的だからである49。 iso I→II (およびその逆) の遷移確率はほぼゼロであることに注意されたい。 (c)4つの重要な遷移確率の塩濃度依存性

Junction Conformations, abundance and structure.の図。

(a) シミュレーションで観察された代表的なコンフォメーション。簡略化のためDNAバックボーンのみを示す。 (b)塩濃度の関数としての一次アイソフォームの相対的存在量。 アイソフォームの識別は、本文で説明したように、接合部内部での塩基の間隔によって定義される。 (c) 各コンフォメーションの二重鎖間角度(IDA)。 開放型平面コンフォメーションは低塩濃度でのみ優勢であることに注意。

ジャンクションのコンフォメーションの時系列データに基づいて、オープン、アイソI、アイソIIのコンフォメーションの割合が塩濃度の関数として直接評価された（図7b）。 予想通り、低塩濃度(= 10 mM)では、正方形の形状をした平面的なオープン状態のみが観察された。 さらに高い塩濃度では、積層コンフォマーが優先され、iso-IIでは平均58%、iso-Iでは36%であった（200 mM以上の場合）。 我々のシミュレーションでは、かなり低い塩濃度を除いて、コンフォーマーの相対的な割合は塩に大きく依存しないことが予測される。 高塩濃度では、溶融温度の塩濃度依存性と同様に、静電相互作用の強いスクリーニングにより、積層型コンフォメーションが優勢であることが予想される。 しかし、このスクリーニングは積層型iso-IIコンフォメーションへの偏りを説明することはできない。 異性体集団の違いは、実験的に観察されたように、接合部コア近傍の塩基配列効果によって生じるに違いない16,17。 このモデルが実験的に知られているiso-IIへの偏りを再現することは、粗視化モデルが配列依存構造を捉えることに成功していることを示している。 また、高塩濃度において、6%というわずかな割合ではあるが、開口状態にある接合配置も見いだされた。 上述したように、これらのコンフォーメーションは短命であり、積層コンフォーメーション間の変換を促進する。 Haらの実験15と比較すると，3SPN.2モデルはiso-IIへのバイアスを約15%低く予測した。 この違いは、アイソフォームを定義するための実験と計算の基準の違いに起因していると思われる。具体的には、我々は接合部内部の塩基間隔を調べているが、FRET実験では接合部のRとXアームの端（実質的にはIDA）の間隔に敏感なラベルを使用している。 エンドヌクレアーゼの存在下で実験的に観察された、接合中心が開いたH様コンフォメーション12では、これらの代替アプローチは系統的にその分類が異なるだろう。 (i)接合端に基づくと、Hコンフォメーションはiso-IまたはIIに分類されるだろう。(ii)逆に、接合核での分離に基づくと、Hコンフォメーションはオープンに分類されるだろうから、我々の基準は常に小さい積層割合をもたらす。

我々の基準によって個々の接合配置のコンフォメーションが分類できるので、これらのコンフォメーションそれぞれの平均構造も直接評価できるようになる。 我々は接合構造を二重鎖間角度(IDA)で特徴付ける。IDAはXRアームとRHアームが接合頂点と成す角度で定義される51。 したがって、iso-IIのIDAはiso-Iのそれよりも大幅に小さくなるはずである。 図7cはこの予想を裏付けており、高塩濃度においてiso-IIのIDAは90°に近づき、iso-IのIDAは140°近辺となった。 iso-IIの90°という値は、平衡FRET測定に基づく40-60°のオーダーである実験的推定値と比較して大きく、この点についてはまた後ほど述べる。 また、iso-II の 90 度は平面的な配置を意味するわけではなく、Fig. 7a に示した代表的な配置で視覚的に明らかなように、三次元構造のため、積層構造でさえ 90 度に近い角度をとることができることを明確にしておく必要がある。 最も低い塩濃度では、積層構造は基本的にサンプリングされないため、角度を推定することはできない。 10 mMでは、開いた接合のIDAは95°であり、ほぼ平面的な接合と一致することがわかった（これは図7aでも視覚的に明らかである）。 塩濃度が高い場合、ごく一部の開いた構成は、≈105°というやや大きな角度を採用した。 この大きな角度は、ほぼ四面体の配置と一致し（図7a）、おそらく低塩濃度での平面的な開口配置とは区別して考えるべきだろう。 したがって、この結果は、積層型コンフォーマー間の遷移状態は、平面型ではなく、主に四面体の開いたコンフォメーションであることを示唆している。 このような四面体型の中間体は、以前にもシミュレーションで観測されている23。 実際、1分子データの解析から多数の接合コンフォメーションの可能性が推測されている26。

Junction Structure Comparisons

最後の比較として、3SPN.2モデルから評価したIDAと実験値および我々のAMBER全原子シミュレーションから推定したIDAを比較してみることにする。 FRET測定により、T = 283 K、塩濃度 = 200 mM45におけるiso-IIのIDAは43 ± 8°と推定された。 そこで、AMBERと3SPN.2の両モデルを、IDAが43°のiso-II初期配置から開始し、一致した条件でシミュレーションを行いました（図1b参照）。 3SPN.2モデル、AMBERモデルともに、接合はより大きなIDAで開き、≈50 ns後に定常値に落ち着く(挿入図8)。 Fig.8のメインパネルには、定常状態において各モデルがサンプリングしたIDAの値を示している。 3SPN.2モデルはAMBERモデルよりもIDAの揺らぎが大きいが、平均IDAは両モデルでほぼ同じである。 定量的には、AMBERの場合、平均IDAは85.3°、標準偏差は12.3°、3SPN.2, 図8

シミュレーションは両方ともFRET測定と結晶学的研究から予想されるよりも大幅に大きなIDAを示している45,52。 これは、どちらのモデルもIDAを正確に推定していないこと、あるいは、FRETデータからIDAを推定するために行わなければならない近似がIDAを過小評価していることを示唆しているのかもしれない。 確かに、バルクFRET実験では、外部色素の存在、関連するリンカー、およびそれらの相対的な配向が、距離の決定にかなりの誤差をもたらす可能性がある。 現在のIDAの決定と結晶学による測定の違いは、おそらく結晶格子の制約から生じていると思われる。 全原子モデルと粗視化モデルを比較すると、標準偏差がほぼ2倍になっていることから、粗視化モデルでは接合部のアームがより柔軟であることが明らかである。 これは溶媒が明示されていないことも一因であろう。全原子モデルでは溶媒である水が必然的に接合腕の柔軟性を妨げてしまうからである

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