Hereditary nonpolyposis colorectal cancer（HNPCC）は、いくつかのMMR遺伝子の一つにおける生殖細胞変異によって起こる遺伝的に不均質な疾患である（Jiricny． 1998a,b）、現在のところ、hMSH2とhMLH1の生殖細胞突然変異がHNPCC症例の大部分を占めることを示唆している（PeltomäkiとVasen, 1997）。 HNPCC遺伝子保有者は、MMR遺伝子をコードする対立遺伝子の1つに突然変異を受け継ぎ、2番目のコピーは腫瘍の発生における初期の出来事として変異または消失する。 この2つ目の事象により、細胞はDNAミスマッチ修復（MMR）ができなくなり、おそらく腫瘍の発生を促す突然変異の急激な蓄積を引き起こすと思われる。 HNPCC患者の大腸がん素因が何であるかは、まだ解明されていない。 ヒトのMMR複合体は、ゲノムの完全性を維持するために、正確なアセンブリが必須であることが示されている（Drummondら、1997）。 これらのデータは、MMR遺伝子の変異の性質とその発現によって、DNA修復複合体の組成とそれに伴う活性がHNPCC個体間で異なることを示唆している。 また、少なくともhMLH1とhMSH2が、DNA組み換えや細胞周期チェックポイント制御など、ゲノムの安定性を制御する他の細胞内経路に関与していること（Jiricny, 1998a、b）が、hMLH1、hMSH2遺伝子の変異により影響を受ける可能性がある。 したがって、腫瘍の発生や病気の経過はHNPCC家系によって異なる可能性がある(Jäger et al., 1997)。 修復複合体におけるタンパク質間相互作用の重要性は、hMSH2がhMSH6（hMutSα）またはhMSH3（hMutSβ）のいずれかとの複合体で存在し、hMLH1タンパク質がhPMS2（hMutLα）、hPMS1（hMutLβ）またはhMLH3のいずれかとの複合体で存在しているという発見によって裏付けられる（Drummondら,, 1995；LiおよびModrich、1995；Lipkinら、2000；Palomboら、1995；Papadopoulosら、1995；Räschleら、1999）。 hMSH2タンパク質はまた、ヒトエキソヌクレアーゼ1（hEXO1）と相互作用することが示されている（Rasmussenら、2000；Schmutteら、1998）。 hEXO1がMMRに関与しているかどうかは不明であるが、エキソヌクレアーゼ1活性を欠損した酵母株は、ヘテロ二重鎖中間体が塩基ミスマッチや小さなループを含む場合に自然変異率の上昇と組換えの小さな増加を示す（Nicholsonら、2000；Tischkoffら、1997、98）。 エクソヌクレアーゼ1（EXO1）とMMRタンパク質の両方が相同組換えに関与することが知られている（Fiorentini et al, 1997; Saparbaev et al, 1996; Sugawara et al, 8117>

HNPCCに関する多くの研究は、hMLH1およびhMSH2遺伝子における変異の同定に焦点を合わせている。 しかし、これらの遺伝子の変異解析では、本疾患の根底にある分子的・生化学的な欠陥は明らかにされていない。 hMLH1遺伝子の機能喪失とHNPCCの関係の理解を深めるために、HNPCC患者に見られるhMLH1の変異体を使って、hMutLαおよびhMLH1-hEXO1複合体の特定のタンパク質-タンパク質相互作用を特徴づけました。 8117>

hMLH1 タンパク質は hPMS2 と主に複合体として存在し、hMutLαヘテロダイマーとして知られています (Li and Modrich, 1995)。 hMutLα複合体の形成はMMR活性に必須であり（Bakerら、1995、1996；Edelmannら、1996）、したがって、HNPCC-hMLH1タンパク質がhPMS2と複合体を形成できないことは、HNPCC個体のMMR活性を非効率的にする可能性がある。 HNPCCの根底にある潜在的な原因を調べるため、デンマークのHNPCC患者（図1）で同定された3つのhMLH1変異体がhPMS2と相互作用できるかどうかを調べた。 これらの変異は、hMLH1のコドン117におけるスレオニンからメチオニンへのミスセンス変異（T117M）と、コドン426におけるナンセンス変異（CAGからTAG）（Q426X）およびコドン609における早期停止をもたらすフレームシフト変異（1813におけるAの挿入）（1813insA）の2つの新しいHNPCC変異を含んでいました（図1）。 組換えGSTタグ付きHNPCCタンパク質とin vitro transcribed and translated (IVTT) hPMS2を用いたプルダウンアッセイでは、予想通りhMLH1とhPMS2が複合体を形成していた（図2a、5と10レーン）。 さらに、HNPCC-hMLH1（T117M）とhPMS2の複合体形成が検出された（図2a、レーン11）。 HNPCC-hMLH1 (T117M) タンパク質は真核生物NIH3T3細胞で発現していることがわかったが（データなし）、酵母ツーハイブリッドアッセイではhPMS2との相互作用を再現することができなかった（図3a）。 この不一致の1つの説明は、ホスホイメージャーで定量されたhPMS2とhMLH1タンパク質（データ示さず）と比較して、hPMS2とHNPCC-hMLH1（T117M）変異タンパク質の間の複合体形成が3倍減少したことかもしれない（図2a、レーン10と11）。 一方、hMLH1タンパク質切断体、HNPCC-hMLH1（Q426X）およびHNPCC-hMLH1（1813insA）とhPMS2との間の複合体形成は、いずれのアッセイにおいても検出されなかった（図2a、レーン12、13および図3a）。 HNPCC-hMLH1（1813insA）とhPMS2を含むプルダウン反応においてかすかなバンドが見られたが（図2a、レーン13）、その強度はhPMS2タンパク質のみを含む反応で得られたバンド（図2a、レーン3）と同様であり、したがって、それはHNPCC-hMLH1（1813insA）とhPMS2間の真の複合体を表しているとは考え難い。

（a）MutLファミリーの配列アライメント。 hMLH1：ヒトMutLホームログhMLH1、yMLH1：Saccharomyces cerevisiae MutLホームログ MLH1、MutL：Escherichia coli MutL。 保存残基は太字で示した。 配列のアラインメントは、ClustalW Multiple Sequence Alignment を用いて行った。 (b) hPMS2、hMLH1、HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X), HNPCC-hMLH1 (1813insA), hEXO1a/HEX1, hEXO1b, hEXO1a/HEX1-N-terminal, hEXO1a/C-terminal および hEXO1b-C-terminal (Y5) のタンパク質立体構造図。 HNPCCと診断されたデンマーク人3家族が、Danish HNPCC registerを通じて同定された。 2つの新しいHNPCC変異、コドン426におけるナンセンス変異（CAGからTAGへ）（Q426X）およびhMLH1のコドン609における早期停止（1813insA）をもたらすフレームシフト変異（塩基番号1813におけるAの挿入）が、Amsterdam基準を満たす家族で同定されました。 3番目の突然変異は、hMLH1のコドン117（T117M）におけるスレオニンからメチオニンへのミスセンス変異で、以前に報告されている（www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm）。 hMLH1コード領域をpcDNA3のEcoRI部位にクローニングし、プライマー媒介変異誘発の鋳型として用いて、hMLH1の3種類のHNPCC変異、T117M、Q426X、および1813insAを構築した。 すべての合成変異とPCR増幅断片のDNA配列は、DNAシークエンスによって確認された。 本研究で用いた他のコンストラクトは、hPMS2（全長cDNA）、HEX1-N（HEX1/hEXO1aの1355 bp N末端領域）、HEX1-C（HEX1/hEXO1aの1182 bp C末端領域）、hEXO1b-C (Y5) (hEXO1b の1952 bp C末端)で、これらは、HEXO1aのN末端領域がHEXO2、C末端はY5、そして、HEXO1bはY6である。 すべてのhEXO1コンストラクトはRasmussenら、2000に詳細に記載されている）

hMLH1タンパク質とhEXO1bまたはhPMS2間の相互作用を調べるためのGST融合タンパクアッセイ。 (a）レーン1、標識IVTT hPMS2タンパク質；レーン2，＋GSTビーズ；レーン3，＋BL21溶解物；レーン4，＋精製GSTタンパク質；レーン5，＋精製GST-hMLH1タンパク質；レーン6、精製GST-hMLH1タンパク質と標識IVTTベクター。 レーン7、精製GST-HNPCC-hMLH1（T117M）タンパク質および標識IVTTベクター；レーン8、精製GST-HNPCC-hMLH1（Q426X）タンパク質および標識IVTTベクター。 レーン9、精製GST-HNPCC-hMLH1（1813insA）タンパク質および標識IVTTベクター；レーン10、精製GST-hMLH1タンパク質および標識IVTT hPMS2タンパク質；レーン11、精製GST-HNPCC-hMLH1（T117M）タンパク質および標識IVTT hPMS2 タンパク質。 レーン12、精製GST-HNPCC-hMLH1（Q426X）タンパク質および標識IVTT hPMS2タンパク質；およびレーン13、精製GST-HNPCC-hMLH1（1813insA）タンパク質および標識IVTT hPMS2タンパク質を示す。 (b）レーン1、IVTT hEXO1bタンパク質；レーン2、＋GSTビーズ；レーン3、＋BL21溶解物；レーン4、＋精製GSTタンパク質；レーン5、＋精製GST-hMLH1タンパク質；レーン6、精製GST-hMLH1タンパク質およびラベル化IVTTベクター；レーン7、精製GST-hMSH2タンパク質およびラベル化IVTT hEXO1b タンパク質。 レーン8、精製GST-hMLH1タンパク質および標識IVTT hEXO1bタンパク質；レーン9、精製GST-HNPCC-hMLH1 (T117M)タンパク質および標識IVTT hEXO1b タンパク質。 レーン10、精製GST-HNPCC-hMLH1（Q426X）タンパク質および標識IVTT hEXO1bタンパク質；およびレーン11、精製GST-HNPCC-hMLH1（1813insA）タンパク質および標識IVTT hEXO1b タンパク質。 全てのin vitro転写翻訳反応は、TNT結合網状赤血球ライセートシステム（Promega）を用いて実施した。 簡単に言えば、ライセートは、製造者の指示に従って、1μgのDNA、システインを欠くアミノ酸ミックス、35S-システインおよびT9 RNAポリメラーゼとともに、30℃で90分間インキュベートされた。 GST-hMLH1, GST-hMLH1 (T117M), GST-hMLH1 (Q426X), GST-hMLH1 (1813insA), GST-hMSH2 の構築にはpGEX vector (Pharmacia-Amersham) を使用した． pGEXコンストラクトはすべてN末端GST融合タンパク質である。 完全なコード領域のDNA配列決定により、すべてのコンストラクトが確認された。 融合タンパク質は、非誘導大腸菌培養物を使用する以外は、Guerretteら(1998)の記載に従って精製された。 プルダウンアッセイは、Guerretteら（1998）によって記載されたように行った。 (1998)の記載に従って行った。ただし、反応混合物をゲルにロードする前に、タンパク質を30℃で2時間インキュベートした

のないツーハイブリッドベクターとの相互作用を示さず、hMLH1とhPMS2の相互作用がhMLH1のC末端部分（アミノ酸506〜756）およびhPMS2のC末端部分（アミノ酸675〜850）を介して介在することは、以前に欠失突然変異誘発により示されている（図1b）（Guerrette et al, 1999). HNPCC-hMLH1（T117M）変異は、世界の異なる地域からの9つの無関係なHNPCC家族において報告されており（www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm、データは示されていない）、酵母（Shcherbakova and Kunkel, 1999; Shimodaira et al., 1998）において既に実証されたように、変異は連結多型ではないことが示唆される。 HNPCC-hMLH1（T117M）変異は、ATPの結合および／または加水分解に直接関与すると考えられている保存配列（図1）にマップされている（Banら、1999）。 したがって、HNPCC-hMLH1 (T117M) のミスセンス変異は、この変異タンパク質のATPとの結合や加水分解、および他のMMRタンパク質との複合体形成の能力を変化させることによってMMR活性を不活性化すると思われる。 この仮説に一致して、HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) および HNPCC-hMLH1 (1813insA) 変異を持つHNPCC患者は、hMutLαヘテロダイマーの形成に障害があり、2番目のhMLH1アリルが失われるか不活化されるとMMR活性に障害が生じることが示されました。

組織特異的なMMR関連因子を同定する試みとして、我々等は最近、hMSH2と相互作用するヒトエキソヌクレアーゼ（Rasmussen et al, 2000; Schmutteら、1998; Tishkoffら、1998; Wilson IIIら、1998)。 我々は、hMSH2がhEXO1bとhEXO1a/HEX1の両方の形態のhEXO1と相互作用し、この相互作用がそれらのC末端ドメインを介して行われることを証明した。 一方、ツーハイブリッドシステムでは、hMSH6とhEXO1の間の相互作用は検出されなかった（Rasmussen et al.、2000）。 hEXO1がMMRに関与しているのか、あるいはhMSH2との相互作用が組換えに重要であるかは不明である。 我々は、hMLH1タンパク質がhMSH2のように、hEXO1の両方の形態（hEXO1bとhEXO1a/HEX1）と相互作用し、この相互作用がエキソヌクレアーゼのC末端ドメインを介して行われることを示す（図2b、レーン5と8、図3）。 hPMS2とhEXO1との間の相互作用は検出されなかった（図3a,c）。 我々の予備的データは、hMLH1とhPMS2タンパク質の両方が存在しても、hEXO1がhMLH1に結合するのを妨げないことを示唆している（データは示していない）。 したがって、hMutLαの形成が必ずしもhEXO1のhMLH1への結合を阻害するわけではないと思われる。 hMLH1とhEXO1の相互作用をさらに明らかにするために、hMLH1とhEXO1の両方の蛍光タンパク質融合体を構築し、NIH3T3細胞に導入しました（図4）。 その結果、CFP-hMLH1は主に核に存在するが、細胞質にもこのタンパク質の一部が検出されることが明らかになった（図4、パネル1）。 一方、YFP-hEXO1は核にのみ検出されました（図4、パネル2）。 しかしながら、YFP-hEXO1とコトランスフェクションすると、CFP-hMLH1は完全に核内にあった（図4、パネル3および4）。

CFP-hMLH1 および YFP-hEXO1b の融合蛋白質の核局在化。 処理の日に、マウスNIH3T3細胞を、3.5μg CFP-hMLH1（パネル1）またはYFP-hEXO1b（パネル2）または両方の構築物（パネル3および4）で一過性にトランスフェクトさせた。 細胞を一晩インキュベートし、翌日、融合タンパク質の細胞内局在を共焦点レーザー走査顕微鏡で調べた。 トランスフェクトされた細胞はさらに、対応するノマルスキー画像で示されている。 hMLH1 cDNAはpECFP-C2ベクター（CLONTECH）のEcoRIとBamHIサイトに、hEXO1b cDNAはpEYFP-C1ベクター（CLONTECH）のBamHIとSalIサイトにクローニングされた。 両方の蛍光タンパク質コンストラクトはN末端融合である

これらの結果は、少なくとも2つのMMRタンパク質、すなわちhMSH2およびhMLH1がヒトエクソヌクレアーゼ1と相互作用し、他の2つのMMRタンパク質、hPMS2およびhMSH6がin vivoツーハイブリッドアッセイで評価するとhEXO1相互作用に直接関与しないことが実証される。

HNPCC患者においてhMLH1とhEXO1の相互作用が影響を受けているかどうかを調べるために、上記の3つのhMLH1変異タンパク質とhEXO1との関連を解析した。 HNPCC-hMLH1（T117M）と全長hEXO1bタンパク質との間にのみ、in vitro pull-down assayで正の相互作用が示された（図2b、レーン9）。 しかしながら、in vivoツーハイブリッドアッセイを用いて、HNPCC-hMLH1タンパク質と試験したエキソヌクレアーゼ1構築物との間のタンパク質-タンパク質相互作用は検出されなかった（図3）。 GAL4活性化ドメインに融合した完全長hEXO1とhMLH1タンパク質との間の相互作用は、これらの構築物が酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて非機能的であるので、調べることができなかった（Rasmussenら、2000）。 同様に、GAL4活性化ドメインに融合したhMLH1およびhMLH1誘導体は、ツーハイブリッドアッセイにおいて非機能的な融合タンパク質をもたらすことがわかった（図3およびデータは示されていない）。

結論として、我々の結果は、HNPCC患者における癌への感受性と共働することが知られている3つの新しいHNPCC-hMLH1突然変異が、MMR活性の低下をもたらし得るhMutLαヘテロダイマーの組み立てにおける不具合をもたらすことが明らかである。 同様に、HNPCC-hMLH1変異体タンパク質は、新たに同定されたhEXO1タンパク質（hMLH1とhMSH2とは相互作用するが、hMSH6とhPMS2とは相互作用しないと思われるタンパク質）とも相互作用できなくなった。 現在、これらの相互作用の正確な生物学的経路や全体的な貢献は不明なままであるが、これはhMLH1がMMRと組換えの両方に関与していることが判明したことが主な理由である。 タンパク質複合体における相互作用を定量化するために設計された機能アッセイで病原性MMRタンパク質を調べることによってHNPCCの分子欠陥を解明することは、突然変異スクリーニング、免疫組織化学およびマイクロサテライト分析とともに、HNPCCキャリアの診断と治療の戦略開発に役立つはずである

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