Types of hemocytes in crickets
図1Aは、コオロギ血球の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡画像で、様々なサイズと形状の細胞を示しています。 これらの血球を正確に識別するために、約1,000個の細胞をその大きさと形態（データは示さず）により6つのタイプに分類した（図1B~G）。 Fig. 1Bに示すように、典型的な顆粒球が血球内に観察された。 顆粒球は通常円形か楕円形で、細胞質内には多くの多型の顆粒が観察された。 顆粒球の細胞膜には小さな仮足や糸状虫が観察された（Fig.1B、白矢印で示す）。 図1Cに示す細胞は、典型的な紡錘形で、形質膜の両端に長い毛状の構造が観察されたため、形質細胞と考えられた（白い矢印で示す）。 図1Dは、昆虫の血球中に観察される最小の丸い細胞である前血球である。 核は細胞の大きさに比べて大きく、細胞の中央に位置していた（図1D）。 そのため、前血球の細胞質と核は見分けがつかないことが多かった。 図1Eは、様々な細胞質顆粒を含む凝固球を描いたものである。 凝固細胞の細胞膜は滑らかで、何の構造もなく、その核は大きく、容易に観察できた。 卵丘細胞は、観察される血球の中で最も大きなタイプで、血リンパ中にほとんど存在しなかった（Fig.1F）。 卵丘細胞は通常、丸い目玉焼き状で、多数の細胞質顆粒を有していた。 図1Gは球形細胞で、丸くて中くらいの大きさであり、細胞質には多数の小さな暗色または輝く顆粒があった。 図1D~Gに示すように、前血球、凝固球、卵球、球状球の細胞膜には構造は見られず、光学的に非常に滑らかであった。
コオロギの血液中で観察される6種類の血球細胞。 血球の全体的な形と相対的な大きさ(A)。 G. bimaculatusに見られる6種類の血球を大きさと形態から顆粒球（B ; GR）、形質細胞（C ; PL）、前血球（D ; PR）、凝固球（E ; CO）、卵球（F ; OE）、球状細胞（G ; AD）に分類した。 顆粒球と形質細胞の細胞膜上の扇状またはアメーバ状の構造を白矢印で示す（BおよびC）。 スケールバー＝25μm（A）または10μm（B〜G）。
血球細胞による結節とカプセル化
昆虫では、結節、カプセル化、貪食などの細胞性免疫応答は顆粒球や形質細胞などの免疫血球によって行われている。 病原体にさらされた後、これらの血球は形を変え、その細胞膜に大きなアメーバ状や扇状の構造を形成する。 このような急速な形態変化をリアルタイムで観察するために、昆虫血球を生理活性を保ったまま7日間培養できる技術を開発した（材料と方法について記載）。 数年間継代できる安定な血球系を確立することはできなかったが、病原体に応答する血球の形態をin vitroで観察することができるようになった。 補足動画Cは、12時間培養後の血球のみを示したものである。 ほとんどの培養細胞は活発に動いていた。 一部の細胞は培養中に細胞膜の周囲に網目を示し、培養スライドに付着しているのが確認された。 血球が凝集したり、大きなクラスターを形成することはほとんどなかった。
図2Aは大腸菌と培養した血球を示す（補足動画1も参照のこと）。 一部の血球はより凝集して動いていることが観察された。 培養時間が長くなると、特定の血球から網（アメーバ状毛または細胞外トラップ）が生じ、この網によって様々な血球が集まり、大きなクラスターを形成した（図2A-1〜A-6；アメーバ状毛または細胞外トラップは黒い矢印で示す）。 図2A-1に示すように、3つの血球群（黒丸で示す）が最終的に網によって1つのクラスターに引き込まれた（図2A-5、A-6）。
大腸菌またはセファデックスビーズに感染したクリケット血球のライブセル画像。 (A)大腸菌で培養した血球を示す光学顕微鏡画像。 培養時間が長くなるにつれて、特定の血球からネット（アメーバ状の毛または細胞外トラップ；黒矢印で示す）が生成された。 6種類の血球はすべてこのネットによって大きなクラスターを形成していた（A-1〜A-6；黒枠で示す）。 動画はMovie 1として利用可能（時間は接種後数分）。 (B)Sephadexビーズで培養した血球を示す光学顕微鏡写真。 血球の周囲のSephadexビーズには、SP1、SP2、SP3、SP4、SP5とランダムにラベルを付けた。 時間とともに、Sephadexビーズ（SP1、SP2、SP3、SP4）は血球に囲まれ、様々な種類のネットに包まれた（B-1~B-9；黒い矢印で示す）。 動画は動画2として公開（時間は接種後数分）。 スケールバー＝25μm(A,B)。 動画Cは、Sephadexビーズを使用せず、血球のみを培養したものである。 ほとんどの血球は活発に動いていた。 数個の細胞は、細胞膜ネットによって培養スライドに付着していた。 しかし、血球の大きなクラスターは観察されなかった。
しかしながら、上記の血球の集まりが大腸菌によって引き起こされたのかどうかを判断することは不可能であった。 この疑問を解決するために、DIC顕微鏡で容易に観察できるSephadexビーズ（直径120μm）で血球を活性化した（図2B、Supplement Movie 2）。 図2Aに示すように、Sephadexビーズは特定の血球が生成するネットに捕捉された（図2B；黄色枠内に黒矢印で示したネット）。 血球の周りにあるSephadexビーズには、ランダムにSP1、SP2、SP3、SP4、SP5とラベルを付けた。 図2B-2と図B-3を比較するとわかるように、SP1、SP2、SP3は一緒に、黄色い箱で示した領域に引き込まれていることがわかる。 また、SP1は、最終的に様々な血球に完全に囲まれるようになった（図2B-9）。 SP4と書かれたビーズも、SP1、SP2、SP3とともにクラスターに取り込まれた（図2B-4〜B-9；黄色のボックスで示す）。 時間の経過とともに、すべてのSephadexビーズ（SP1、SP2、SP3、SP4）は、多くの血球に取り囲まれるようになった。 一方、SP5については、個々の血球が接触している様子が観察されたが、SP1と同様の位置にあるにもかかわらず、黄色枠で示した領域には引き込まれなかった。
カルボキシレート修飾ポリスチレンラテックスビーズによる顆粒球の活性化
次に、どの血球がネットを作り、カプセル化、結節など免疫反応の様々なステップに関与しているかを調査した。 そのために、DIC顕微鏡で容易に観察できるカルボキシレート修飾ポリスチレンラテックスビーズを病原体の代わりに用い、血球のリアルタイム画像を収集した。 図3Aは、カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックスビーズで12時間刺激した血球の様子である（Supplement Movie 3）。 血球細胞（黒矢印で示す）が作り出す網は、ラテックスビーズ（赤矢印で示す）の周りを活発に動いている（図3A-1）。 ビーズは網に飲み込まれ、やがて血球の細胞質内に現れるようになった（図3A-2~A-4）。 しかし、ネットに遭遇したすべてのカルボキシル基修飾ポリスチレンラテックスビーズが貪食されたわけではなかった。 図3
カルボキシレート修飾ポリスチレンラテックスビーズで刺激した顆粒球の生細胞画像。 (A）カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックスビーズで12時間培養した血球の光学顕微鏡像。A-1~A-4は12~18分後に培養した血球である。 血球細胞（黒矢印）が作り出す網がラテックスビーズ（赤矢印で示す）の周りに形成されているのが確認できる。 ラテックスビーズはネットに飲み込まれ、最終的には血球の細胞質内に捕捉された（A-4）。 動画3として利用可能（時間は刺激後数分）。 スケールバー＝40μm。 (B) 拡大画像。 (B-1) 4時間後、多くのカルボキシル基修飾ポリスチレンラテックスビーズが血球に捕捉された（ラテックスビーズ、赤矢印；および特異的血球、白丸）。 (B-2~B-6) 刺激後0, 2, 4, 12, 48時間での培養顆粒球。 (B-2）安静時の顆粒球は、円形または楕円形である。 (B-3）刺激後2時間で、顆粒球は形態変化を示し始め、扇状またはアメーバ状の細胞膜構造（白矢印）を見ることができる。 (B-4、-5）感染後4時間および12時間には、顆粒球の細胞質内に多数のラテックスビーズが蓄積されていた。 (B-6）感染後48時間では、顆粒球の細胞質内に多くのラテックスビーズが蓄積していたが、ネットは観察されなくなり、多くの顆粒球は不活性化したようである。 スケールバー＝15μm（B-1）または10μm（B-2〜B-6）。
高倍率共焦点顕微鏡を用いて、詳細な観察を行った（図3B）。 感染後4時間で、カルボキシレート修飾ポリスチレンラテックスビーズが特定の血球内に観察できた（図3B-1；ビーズは赤矢印で、特定の血球は白丸で示す）。 次に、どの細胞がラテックスビーズを取り込むかを詳細に観察した（図3B-2~B-6）。 図3B-2は安静時の顆粒球で、通常円形か楕円形で、細胞質内に多くの多形暗色顆粒を有していた。 カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックスビーズで刺激した2時間後、顆粒球は、細胞膜の扇状またはアメーバ状の突出を含む形態変化を示し始めた（図3B-3；白い矢印で示す）。 カルボキシル基で修飾したポリスチレンラテックスビーズは、刺激後4時間で顆粒球の細胞質内に観察され、刺激後12時間までに多くの顆粒球の細胞質内に多数のラテックスビーズが蓄積した（図3B-4およびB-5；ビーズは赤矢印、網は白矢印で示す）。 また、ネットは時間の経過とともに大きくなり、幅も広くなることが観察された（図3B-4、図B-5）。 刺激後48時間では、顆粒球の細胞質内に多くのラテックスビーズが蓄積していたが、ネットはもはや見ることができず、多くの顆粒球は不活性であるように見えた（図3B-6；赤矢印で示したビーズ）
図2に示したように、顆粒球はこのネットを使って他の顆粒球のみならず、異なる種類の血球にも付着するように思われた。 少数の形質細胞以外の他の細胞型では貪食は観察されなかった（データは示さず）。 さらに、顆粒球と少数の形質細胞以外の細胞タイプでは、免疫学的活性や形態学的変化は観察されなかった
顆粒球のリソソームは、E.M.A.の注入により活性化された。 大腸菌粒子
顆粒球内に観察された空胞が病原体に関連したファゴソームかどうかを調べるため、コオロギに主に貪食のマーカーとして用いられ、細胞内リソソームなどの酸性化した小器官に到達すると緑色に蛍光を発する大腸菌粒子を注射した。 同時に、全血球を、リソソームを標識するLysoTracker Redで染色した。 図4A-1に示すように、粒子を注入した直後の顆粒球の細胞質には、緑色の蛍光シグナル（貪食された大腸菌粒子）が観察されました。 同時に、活性化されたリソソーム形成を示す赤色蛍光シグナルも観察された（Fig. 4A-2）。 注入後4時間では、多くの顆粒球で多形性の高い空胞が観察された（Fig. 4A-4, A-5）。 緑色蛍光シグナル（貪食された大腸菌粒子）と赤色蛍光シグナル（活性化したリソソーム）のマージ画像を示す（Fig. 4A-6）。 注入後12時間で、緑色の蛍光シグナルは暗くなり始め、赤色の蛍光シグナルは残った（Fig. 4A-7~A-9）。 注入後24時間では、両方の蛍光シグナルが暗くなった（Fig. 4A-10~A-12）。 しかし、注入後48時間では、顆粒球の赤色蛍光シグナルが再び観察された（Fig. 4A-13~A-15）。 図4Aa~Aoは、パネルA-1~A-15のインセット（白枠で示す）をより高倍率で示したものである。 PBSバッファーのみを注入したコオロギは、注入後のすべての時点において赤色および緑色蛍光が陰性であった（図4B）。
LysoTracker Redによる緑色蛍光大腸菌粒子を注入したコオロギにおける顆粒球リソソームのラベル化。 (A)大腸菌粒子注入後0時間、4時間、12時間、24時間、48時間における顆粒球ライソゾームの発達。 (A-1, A-4, A-7, A-10, A-13) 貪食のマーカーとなる大腸菌粒子は、細胞内リソソームなどの酸性化した小器官に到達すると緑色に蛍光を発する。 (A-2、A-5、A-8、A-11、A-14）LysoTracker Red（リソソームマーカー）で染色した顆粒球の共焦点蛍光顕微鏡画像。 (A-1、A-2）注入後1時間から顆粒球の細胞質で緑色と赤色の蛍光シグナルが観察できた。 (A-4, A-5)注入後4時間の時点で、多くの顆粒球が、多形性の高い顆粒球の空胞に緑色と赤色の蛍光を示した。 (A-7、-8）注入後12時間では、緑色の蛍光シグナルは弱まったが、赤色の蛍光シグナルは残っていた。 (A-10、A-11）注入後24時間では、緑色と赤色の蛍光シグナルは共にほぼ消失している。 (A-13、A-14）注入後48時間では、緑色の蛍光シグナルは完全に消失しているが、赤色の蛍光シグナルが再び観察された。 緑色蛍光シグナルと赤色蛍光シグナルの合成画像を示す（A-3, A-6, A-9, A-12, and A-15）。 (a~o) パネルA-1 ~A-15 の挿入部分（白枠で示す）を高倍率で示した。 (B）PBSを注射したコオロギの顆粒球における赤色蛍光シグナル（ネガティブコントロール）。 (C) 注入後1時間~48時間におけるフローサイトメトリー解析。 (C-1、C-2）緑色蛍光シグナルは、注入後1時間で2.08％、注入後4時間で24.6％に増加した。 (C-3~C-5) 緑色蛍光シグナルは徐々に減少し、12 時間後に 10.87%、24 時間後に 3.98%、48 時間後に 1.74%となった。 (C-1-1~C-4-1) 赤色蛍光シグナルは注入後 12 時間で 69.54% に増加、注入後 24 時間で 5.78% に減 少した。 (C-5-1）赤色蛍光シグナルは、注入後48時間で30.25%まで再び増加した。 (C-1-2~C-5-2) PBSバッファーのみを注入したコオロギの顆粒球の赤色蛍光シグナルを示した。 (D) フローサイトメトリー分析を3回繰り返した。
PBSまたは大腸菌を接種したコオロギの緑色および赤色蛍光シグナルを定量するために、注入後0~48時間の血液細胞をフローサイトメトリーによって分析した（図4C）。 注入後0時間では、血球の2.08%が緑色蛍光を陽性とし、注入後4時間では24.36%まで増加した（図4C-1および図C-2）。 その後、緑色蛍光シグナルは徐々に減少し、12時間後には10.87%、24時間後には3.98%、48時間後には1.74%となった（Fig. 4C-3~C-5）。 これらの結果から、大腸菌粒子は顆粒球に積極的に取り込まれ、消化され、注入後48時間までに完全に除去されたことが示された。 注入後12時間では69.54%が赤色蛍光陽性であり、注入後24時間では血球の5.78%までシグナルが減少した（図4C-1-1~C-4-1）。 顕微鏡観察と一致するように、赤色蛍光シグナルは注入後48時間で血球の30.25%まで増加した。 一方、PBSを注入したコオロギは、すべての時点において緑色および赤色蛍光が陰性であった(Fig. 4C-1-2~C-5-2)。 フローサイトメトリー解析は3回繰り返した（図4D）。
感染後48時間の顆粒球リソソームの再活性化
さらに、感染後48時間の顆粒球リソソームの再活性化を顕微鏡観察により調べた（図5AおよびB）。 図4Aに示すように、注入後4時間で緑色の蛍光シグナル（貪食された大腸菌粒子）と赤色の蛍光シグナル（活性化したリソソーム）が確認された（図5A-1~A-3）。 注入後24時間では蛍光シグナルは弱くなっていた（Fig.） また、感染後24時間では、顆粒球の細胞質内に細胞が確認された（図5A-4~A-6；白矢印で示す）。 この現象は、感染後48時間でより顕著になった（図5A-7〜A-9；白い矢印で示す）。 また、感染後48時間では、これらの巻き込まれた細胞の周囲のリソソームが活性化されていた（図5A-8）。 図4A-14, 4C-5-1に示すように、これらの顕微鏡観察は、感染後48時間における赤色蛍光シグナルの増加を説明するものと思われる。 これを確認するために、感染後48時間で、顆粒球の核を4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色した。 図5B-1に示すように、2つの核を持つ顆粒球が頻繁に観察された。 時折、2つ以上の核を含む顆粒球、または変形した核も観察された（図5B-2およびB-3；白い矢印で示す）＜9391＞＜638＞＜942＞＜2735＞図5＜2032＞＜638＞＜5539＞＜3714＞＜638＞＜5099＞注射後48時間の顆粒球リソゾームの再活性化。 (A）注入後4時間、24時間、48時間における顆粒球の蛍光顕微鏡写真。 (A-1, A-2)顆粒球は注入後4時間で、高度に多形化した液胞に緑色と赤色の蛍光シグナルを示した。 (A-4、A-5）注入後12時間では、緑色の蛍光シグナルは弱まったが、赤色の蛍光シグナルは残っていた。 また、顆粒球の細胞質内には、いくつかの細胞が観察された（白矢印）。 (A-7、A-8）この現象は注入後 48 時間でより多く観察された。 また、これらの呑み込まれた細胞を取り囲むリソソームが活性化していた（A-8）。 緑色蛍光シグナルと赤色蛍光シグナルのマージ画像を示す（A-3、A-6、A-9）。 (B) 注入後48時間におけるDAPIで染色した顆粒球。 (B-1）顆粒球の細胞質内に2つの核が観察された。 (B-2、B-3）顆粒球細胞質内に2個以上の核、または変形した核が観察されることがある（白矢印で示す）。 スケールバー＝10μm（A）または20μm（B）。
感染後48時間の壊死関連顆粒球細胞死
図3B-6および5A-8に示すように、顆粒球におけるファゴソームの蓄積は、その形を変えて細胞死を誘導した。 感染後48時間に、血球をフルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識アネキシンVとヨウ化プロピジウム（PI）で染色し、アポトーシスまたはネクロシス細胞死を確認した（Fig.6A）。 緑色の蛍光シグナル（アネキシンV）は12時間と48時間の間でわずかに増加しただけであったが（図A-10、A-7、A-10）、赤色の蛍光シグナル（PI）は感染後12時間で強い染まりを示した（図6A-5）。 感染後24時間および48時間では、赤色蛍光シグナルは持続した（図6A-8、A-11）。 赤色蛍光シグナル（PI）とDIC画像のマージ画像を示す（図6A-3、A-6、A-9、およびA-12）。 図6A-3、A-6、A-9、およびA-12パネルのボックスで示されたインセットを高倍率で示したのが図6A-A~Adである。 これらの結果は、顆粒球におけるファゴソームの蓄積は、典型的なアポトーシス細胞死ではなく、ネクローシス関連の細胞死を誘導することを示す。 PI染色を定量化するために、感染後0時間、12時間、24時間、48時間に血球を染色し、フローサイトメトリーで検討した。 感染後12時間では、顆粒球の71.29%がPIで染色されたのに対し、0時間では13.52%であった（図6B-1およびB-2）。 感染後24時間では、PI染色は45.97％とわずかに減少したが、48時間では76.24％と再び増加した（図6B-3、B-4）。 フローサイトメトリー解析は3回繰り返した（図6C）
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