Costruzione del plasmide

Ogni scFv chimerico anti-HA testato in questo studio è stato costruito innestando sei loop CDR di un anticorpo anti-HA 12CA5 su ogni scaffold scFv selezionato. Il plasmide \chi _{15{mathrm{F}}11}^{mathrm{HA}}}}\) è stato costruito in due fasi: (1) un CDR-loop innestato scFv gblock e un vettore H4K20me1 mintbody 15F1138 linearizzato da siti di restrizione EcoRI sono stati legati tramite assemblaggio Gibson (Casa preparato master mix); (2) il linker che collega la scFv e EGFP, così come EGFP, è stato sostituito da un gblock che codifica un flessibile (G4S) × 5 linker e il mEGFP da Gibson assembly attraverso siti di restrizione NotI. Per gli altri quattro plasmidi scFv chimerici, ogni CDR-loop innestato scFv gblock è stato ligato nel vettore \(\chi _{15{mathrm{F}}11}^{{mathrm{HA}}}}\) linearizzato da siti di restrizione EcoRI tramite assemblaggio Gibson.

Il plasmide target 1 × HA-mCh-H2B è stato costruito sostituendo il sfGFP di un plasmide Addgene sfGFP-H2B (plasmide # 56367) con un 1 × HA epitopo taggato mCherry gblock in cui un sito di restrizione NotI è stato inserito tra il 1 × HA epitopo e il mCherry per il seguente clonaggio. Il 4 × HA-mCh-H2B è stato costruito sostituendo il tag 1 × HA del costrutto 1 × HA-mCh-H2B con un gblock 4 × HA-epitopo attraverso i siti di restrizione AgeI e NotI. Il 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) è stato costruito sostituendo il tag 1 × HA del costrutto 1 × HA-mCh-H2B con l’smHA amplificato da un plasmide Addgene smHA-KDM5B-MS2 (plasmide # 81085) utilizzando i primer NZ-098 e 099 (tutte le sequenze di primer sono riportate nella tabella 1 supplementare). Il smHA-H2B è stato costruito sostituendo il 1 × HA-mCh del costrutto 1 × HA-mCh-H2B con smHA amplificato dal plasmide smHA-KDM5B-MS2 usando i primer NZ-098 e 100.

Un altro plasmide bersaglio 4 × HA-mCh-β-actin è stato costruito sostituendo il H2B del 4 × HA-mCh-H2B con un amplicon di β-actina attraverso i siti di restrizione BglII e BamHI. L’amplicone di β-actina è stato amplificato da un plasmide Addgene smFlag-ActinB-MS2 (plasmide # 81083) utilizzando i primer NZ-073 e NZ-074.

Il plasmide 4 × HA-mRuby-Kv2.1 è stato generato amplificando prima il tag 4 × HA da 4 × HA-mCh-H2B utilizzando i primer NZ-105 e 106. Poi l’amplicone 4 × HA è stato introdotto in un plasmide pubblicato pCMV-mRuby2-Kv2.161 (un dono del Dr. Michael Tamkun), che era stato linearizzato da una digestione di restrizione con AgeI, utilizzando Gibson assembly. Il plasmide smHA-Kv2.1 è stato generato mediante amplificazione PCR della sequenza codificante di Kv2.1 del ratto da pBK-Kv2.140 e successiva legatura nei siti di restrizione AsiSI e PmeI sul plasmide smHA-KDM5B-MS2 usando i primer Kv2.1-1 e 2.

L’H2B-mCh-1 × HA è stato costruito in due fasi: (1) sostituire il tag 1 × HA del 1 × HA-mCh-H2B con H2B attraverso i siti AgeI e NotI, in cui l’H2B è stato amplificato dal 1 × HA-mCh-H2B utilizzando i primer NZ-092 e 093; (2) sostituire l’H2B al C-terminale di mCherry con un tag 1 × HA attraverso i siti BglII e BamHI, in cui il tag 1 × HA è stato sintetizzato dalla sovrapposizione PCR con i primer NZ-094 e 095. Il Mito-mCh-1 × HA è stato costruito sostituendo l’H2B in H2B-mCh-1 × HA con Mito gblock23 attraverso i siti AgeI e NotI. Il Mito-mCh-smHA è stato costruito sostituendo il tag 1 × HA di Mito-mCh-1 × HA con smHA amplificato dal smHA-KDM5B-MS2 usando i primer NZ-096 e 097. Il mCh-H2B è stato generato sostituendo il sfGFP del plasmide sfGFP-H2B con un gblock mCherry utilizzando l’assemblaggio Gibson.

I plasmidi FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP sono stati costruiti sostituendo il mEGFP di \(\chi _15{mathrm{F}}11}^{{mathrm{HA}}}}\) con gblocchi mCherry, HaloTag, e SNAP-tag, rispettivamente.

pET23b-FB-GFP, il plasmide per l’espressione e la purificazione del frankenbody ricombinante, è stato assemblato da Gibson con un amplicone FB-GFP e un plasmide pubblicato pET23b-Sso7d62,63 linearizzato dai siti di restrizione NdeI e NotI. L’amplicone FB-GFP è stato amplificato da \(\chi _{15{mathrm{F}}11}^{{mathrm{HA}}}}\) tramite PCR con i primer NZ-075 e 077.

Per il saggio di traduzione, il costrutto reporter smHA-KDM5B-MS2 e SunTag-kif18b sono stati ottenuti da Addgene (plasmide # 81085 e # 74928), e il plasmide SunTag scFv (plasmide # 60907) è stato modificato rimuovendo l’epitopo HA codificato nel linker. L’epitopo HA è stato rimosso mediante mutagenesi sito-diretta con QuikChange Lightning (Agilent Technologies) secondo le istruzioni del produttore utilizzando primer HAout-1 e 2.

I blocchi g sono stati sintetizzati da Integrated DNA Technologies e i plasmidi ricombinanti sono stati verificati in sequenza da Quintara Biosciences. Le sequenze dei primer sono riportate nella tabella 1 supplementare. Tutti i plasmidi utilizzati per la traduzione delle immagini sono stati preparati da NucleoBond Xtra Midi EF kit (Macherey-Nagel) con una concentrazione finale di circa 1 mg mL-1.

Cultura cellulare U2OS

Le cellule U2OS (ATCC HTB-96) sono state coltivate in un incubatore a 37 °C, umidificato, con 5% CO2 in terreno DMEM (Thermo Scientific) integrato con 10% (v/v) siero fetale bovino (Altas Biologicals), 1 mM l-glutamina (Gibco) e 1% (v/v) penicillina-streptomicina (Gibco o Invitrogen).

Trasfezione e caricamento delle microsfere

Per il monitoraggio della localizzazione delle proteine, le cellule sono state placcate in una camera MatTek 35 mm (MatTek) 2 giorni prima dell’imaging e sono state trasfettate transitoriamente con il reagente LipofectamineTM LTX con reagente PLUS (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore 18-24 ore prima dell’imaging.

Per l’imaging di traduzione con mRNA etichettato dalla proteina MCP-Halo, le cellule sono state placcate in una camera MatTek 35 mm (MatTek) il giorno prima dell’imaging. Il giorno dell’imaging, prima del caricamento del bead, il mezzo nella camera MatTek è stato cambiato in Opti-MEM (Thermo Scientific) con 10% di siero fetale bovino. Una miscela di plasmidi (smHA-KDM5B-MS2/FB) e purificato MCP-HaloTag protein17 sono stati caricati tallone come precedentemente descritto 6,17,26. Brevemente, dopo aver rimosso l’Opti-medium dalla camera MatTek, 4 µL di una miscela di plasmidi (1 µg ciascuno) e MCP-HaloTag (130 ng) in PBS è stato pipettato sopra le cellule e ~ 106 µm perline di vetro (Sigma Aldrich) sono stati distribuiti uniformemente sulla parte superiore. La camera è stata poi picchiettata fermamente sette volte, e Opti-medium è stato aggiunto di nuovo alle cellule. 3 ore dopo il caricamento delle perline, le cellule sono state colorate in 1 mL di 0,2 nM di JF646-HaloTag ligando48 diluito in fenolo-rosso DMEM completo. Dopo un’incubazione di 20 minuti, le cellule sono state lavate tre volte in fenolo rosso senza DMEM completo per rimuovere le perle di vetro e coloranti unliganded. Le cellule erano quindi pronti per l’imaging.

Per la traduzione di imaging senza etichettatura mRNA, le cellule placcate su MatTek camera sono stati transitoriamente trasfettati con i plasmidi necessari, smHA-KDM5B-MS2/FB con o senza SunTag-kif18b/Sun (con l’epitopo HA rimosso), utilizzando LipofectamineTM LTX reagente con il reagente PLUS (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore il giorno di imaging. 3 ore dopo la trasfezione, il mezzo è stato cambiato in DMEM completo senza fenolo. Le cellule erano quindi pronte per l’imaging.

Purificazione di FB-GFP

Le cellule E. coli BL21 (DE3) pLysS trasformate con pET23b-FB-GFP sono state coltivate a 37 °C ad una densità di OD600 0,6 in terreno 2xYT contenente ampicillina (100 mg L-1) e cloramfenicolo (25 mg L-1) con agitazione. Isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG) è stato aggiunto per indurre l’espressione proteica ad una concentrazione finale di 0,4 mM, e la temperatura è stata abbassata a 18 °C. Le cellule sono state raccolte dopo 16 ore per centrifugazione e risospese in tampone PBS integrato con 300 mM NaCl, inibitori della proteasi (ThermoFisher), 0,2 mM AEBSF (20 mL L-1 cultura) e lisato mediante sonicazione. Il lisato è stato chiarito mediante centrifugazione. Il surnatante è stato caricato su due colonne HisTrap HP 5 mL collegate (GE Healthcare), lavate ed eluite da un gradiente lineare di imidazolo 0-500 mM. Le frazioni contenenti il POI sono stati raggruppati, concentrati utilizzando Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO unità filtro centrifugo (EMD Millipore) e caricati su un size-exclusion HiLoad Superdex 200 PG colonna (GE healthcare) in HEPES-based buffer (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP40, 10% glicerolo, e 1 mM DTT). Le frazioni contenenti la proteina FB-GFP sono state raccolte, concentrate e conservate a -80 °C dopo il congelamento rapido con azoto liquido.

Immunostaining

Le cellule U2OS sono state trasfettate transitoriamente con 4 × HA-mCh-H2B o 4 × HA-mCh-β-actin con il reagente LipofectamineTM LTX con il reagente PLUS (Invitrogen). 26 h dopo la trasfezione, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% (Electron Microscopy Sciences) per 10 min a temperatura ambiente, permeabilizzate in 1% Triton 100 in PBS, pH 7.4 per 20 min, bloccate in Blocking One-P (Nacalai Tesque) per 20 min, e colorate a 4 °C durante la notte con proteina FB-GFP purificata (0,5 µg mL-1 in 10% di tampone di bloccaggio). La mattina seguente, le cellule sono state lavate con PBS, e il POI è stato ripreso da un microscopio confocale Olympus IX81 a disco rotante (testa CSU22) utilizzando un obiettivo a immersione in olio ×100 (NA 1.40) nelle seguenti condizioni: 488 nm (0.77 mW; misurato al piano focale posteriore dell’obiettivo; qui tutte le misure di potenza laser corrispondono al piano focale posteriore dell’obiettivo) e 561 nm (0.42 mW) imaging sequenziale per 50 punti di tempo senza ritardo, 2 × 2 tasso di rotazione, 100 ms tempo di esposizione. Le immagini sono state acquisite con una fotocamera Photometrics Cascade II CCD utilizzando il software SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Le immagini di immunostaining sono state generate facendo la media delle immagini di 50 punti di tempo per ogni canale con Fiji64.

Western blot

Le cellule U2OS sono state trasfettate transitoriamente con 4 × HA-mCh-H2B o 4 × HA-mCh-β-actin con il reagente LipofectamineTM LTX con il reagente PLUS. 10 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e lisate in 120 µL di tampone RIPA con cOmplete Protease Inhibitor (Roche). 6,5 µL di ogni lisato cellulare sono stati caricati su un gel proteico NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) ed eseguito per 60 min a 100 V e 25 min a 200 V. Le proteine sono state trasferite su una membrana PVDF (Invitrogen), bloccate in un tampone di bloccaggio (5% di latte in polvere in 0,05% TBS-Tween 20) per 1 h, e colorate durante la notte con la proteina FB-GFP purificata (0,5 µg mL-1 in tampone di bloccaggio) o l’anticorpo primario anti-HA 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat #11583816001; diluizione 2000 volte con concentrazione finale 0,5 µg mL-1 in tampone di bloccaggio). Per l’anticorpo primario 12CA5, è stata fatta un’ulteriore incubazione per 1 ora con l’anticorpo anti-topo/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; diluizione 5000 volte in tampone bloccante). Il POI è stato rilevato dalla fluorescenza GFP per FB-GFP o Alexa 488 per l’anticorpo anti-HA utilizzando un Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) con le seguenti condizioni: lunghezza d’onda di eccitazione 473 nm, filtro LPB (≥510 nm), tubo fotomoltiplicatore 300 V e dimensione del pixel 10 µm. I western blot non tagliati e non processati sono forniti nella Fig. 3.

Recupero della fluorescenza dopo il photobleaching

Per studiare l’affinità di legame di FB agli epitopi HA in cellule viventi, sono stati eseguiti esperimenti FRAP su cellule trasfettate transitoriamente con 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) e FB-GFP (1,25 µg) 24 ore prima della FRAP. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a disco rotante Olympus IX81 (testa CSU22) accoppiato a un’unità di fotomanipolazione Phasor (Intelligent Imaging Innovations) con un obiettivo a immersione in olio ×100 (NA 1.40). Prima del photobleaching, 20 o 10 fotogrammi sono stati acquisiti con 1 o 5 s intervallo di tempo. Le immagini sono state catturate utilizzando un laser 488 nm (0,77 mW) con 100 ms di tempo di esposizione seguito da 561 nm (0,42 mW) laser con 15 ms di tempo di esposizione. Il disco rotante è stato impostato a 1 × 1 tasso di rotazione. Dopo l’acquisizione di immagini pre-FRAP, il laser p488 nm (dall’unità Phasor per photobleaching) a 17 mW con 100 ms tempo di esposizione, o 4 mW con 500 ms di esposizione, è stato utilizzato per photobleach una regione circolare nel nucleo. Dopo il photobleaching, 30 immagini sono state acquisite senza ritardo o con 500 ms di ritardo, e poi 100 immagini con un ritardo di 1 s e 100 immagini con un ritardo di 5 s sono stati acquisiti utilizzando le stesse impostazioni di imaging come le immagini pre-FRAP. L’intensità fluorescente attraverso il tempo del punto photobleached sono stati esportati utilizzando il software Slidebook. L’intensità fluorescente del nucleo e lo sfondo sono stati ottenuti da Fiji64 dopo aver corretto per il movimento delle cellule utilizzando il plugin StackReg Fiji65. La curva FRAP e metà sono stati ottenuti utilizzando easyFRAP-web66, secondo le istruzioni del sito web. Figura 4b, d sono stati generati da Mathematica (Wolfram Research).

MCP purificazione

MCP-HaloTag è stato purificato dalla cromatografia di affinità metallo immobilizzato 17. Brevemente, il suo-tagged MCP-HaloTag è stato purificato attraverso un Ni-NTA-agarosio (Qiagen) colonna confezionata secondo le istruzioni del produttore, con piccole modifiche. E. coli che esprime la proteina interessata è stato lisato in un tampone PBS con un set completo di inibitori della proteasi (Roche) e 10 mM imidazolo. La resina è stata lavata con un buffer a base di PBS contenente 20 e 50 mM di imidazolo. La proteina è stata poi eluita in un buffer PBS con 300 mM imidazolo. L’eluito His-tagged MCP è stato dializzato in un tampone a base di HEPES (10% glicerolo, 25 mM HEPES pH 7.9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP-40 detergente, e 1 mM DTT), snap-congelato in azoto liquido, e poi conservati a -80 ° C.

Preparazione delle cellule per il monitoraggio della catena nascente

Il plasmide reporter smHA-KDM5B-MS2 (Addgene plasmide # 81085) e il costrutto FB sono stati trasfettati transitoriamente senza la proteina MCP-HaloTag o perlina caricata con MCP-HaloTag proteina in cellule U2OS piastrate su un 35 mm MatTek camere 4-6 ore prima di imaging. 3 ore dopo, se MCP-HaloTag proteina è stata caricata tallone, le cellule sono state colorate con il JF646-HaloTag ligando, poi lavato con fenolo-rosso medio DMEM completo. Se non MCP-HaloTag proteina era necessario, il mezzo delle cellule è stato cambiato in fenolo-rosso-free completo mezzo DMEM 3 ore dopo la trasfezione. Le cellule erano quindi pronti per l’imaging.

Per l’imaging multiplexed, due plasmidi reporter, smHA-KDM5B-MS2 e SunTag-kif18b, così come due sonde, FB-mCh e Sun-GFP (con l’epitopo HA rimosso), sono stati transitoriamente trasfettati in cellule U2OS placcato su una camera MatTek 4-6 ore prima di imaging. 3 ore dopo, il mezzo delle cellule è stato cambiato in fenolo-rosso completo DMEM medio. Le cellule erano quindi pronti per imaging.

condizione di imaging per la traduzione e saggi di colocalizzazione

Per immagine mRNA singoli e il loro stato di traduzione con FB, un custom-built microscopio a fluorescenza a largo campo basato su una illuminazione inclinata (HILO) schema è stato utilizzato 17,67. Brevemente, i fasci di eccitazione, 488, 561, 637 nm laser a stato solido (Vortran), sono stati accoppiati e focalizzati fuori asse sul piano focale posteriore della lente obiettivo (APON 60XOTIRF, Olympus). Tutte le potenze laser riportate sono state misurate sul piano retro-focale dell’obiettivo. I segnali di emissione sono stati divisi da un grado di imaging, specchio dicroico ultrapiatto (T660lpxr, Chroma). I segnali di emissione più lunghi (rosso lontano) dopo la divisione sono stati passati attraverso un filtro passabanda (FF01-731/137-25, Semrock). I segnali di emissione più corti (rosso e verde) dopo la scissione sono stati passati attraverso un filtro passa-banda per il rosso (FF01-593/46-25, Semrock) o un filtro passa-banda per il verde (FF01-510/42-25, Semrock) installato in una ruota di filtri (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). I segnali di emissione più lunghi (rosso lontano) e più corti (rosso e verde) sono stati rilevati da due telecamere EM-CCD separate (iXon Ultra 888, Andor) mettendo a fuoco con un doppio obiettivo acromatico da 300 mm (AC254-300-A-ML, Thorlabs). La combinazione di obiettivo ×60 da Olympus, obiettivo 300 mm tubo, e iXon Ultra 888 produce ×100 immagini con 130 nm pixel-1. Un incubatore per la temperatura (37 °C), l’umidità e il 5% di CO2 (Okolab) è dotato di un palco piezoelettrico (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) per l’imaging delle cellule vive. I laser, le telecamere, il palco piezoelettrico, e la ruota filtro sono stati sincronizzati da un microcontrollore open source, Arduino Mega board (Arduino). Acquisizione di immagini è stata eseguita utilizzando il software open source Micro-Manager (1.4.22)68.

La dimensione dell’immagine è stata impostata sul centro 512 × 512 pixel2 (66.6 × 66.6 µm2), e il tempo di integrazione della fotocamera è stato impostato su 53.64 ms. Il tempo di lettura delle telecamere dalla combinazione delle nostre dimensioni di imaging, la modalità di lettura (30 MHz) e la velocità di spostamento verticale (1,13 µs) era 23,36 ms, risultando nella nostra velocità di imaging di 13 Hz (70 ms per immagine). I segnali rossi e verdi sono stati ripresi alternativamente. La posizione del filtro di emissione è stata cambiata durante il tempo di lettura della telecamera. Per ridurre al minimo il bleed-through, il segnale rosso lontano è stato contemporaneamente imaged con il segnale verde. Per catturare l’intero spessore delle cellule, 13 z-stacks con una dimensione di passo di 500 nm (6 µm in totale) sono stati ripresi utilizzando il palco piezoelettrico. Questo ha portato al nostro tasso totale di imaging cellulare di 1 Hz per l’imaging di segnali rossi o verdi, e 0,5 Hz per l’imaging di entrambi i segnali rossi e verdi indipendentemente dal far-red imaging.

Per le Figg. 1c, d, 2a, e, un singolo piano delle cellule è stato imaged continuamente a 6,5 Hz per 100 punti di tempo e la media durante il tempo (laser: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (Fig. 1c), 90 µW (Fig. 1d), 19 µW (Fig. 2a), 155 µW (Fig. 2e); 637 nm, 220 µW). Per la Fig. 2b (a sinistra), la cellula è stata ripresa continuamente a 0,5 Hz, 488 nm (100 µW) e 561 nm (10 µW) laser con 13 z-stacks ogni punto di tempo e mediati durante il tempo. I 13 z-stacks medi acquisiti sono stati deconvolti usando Fiji. Per le Fig. 6b, c, e e f, le cellule sono state fotografate ogni 10 s con 13 z-stacks per punto temporale (laser: 488 nm, 13 µW (Fig. 6b), 18 µW (Fig. 6c); 561 nm, 172 µW (Fig. 6f); 637 nm, 150 µW (Fig. 6b, c), 35 µW (Fig. 6e)). Per la Fig. 7b, la cellula è stata ripresa continuamente a 0,5 Hz con 13 z-stacks ogni punto temporale (laser: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). Per la Fig. 8b, le cellule sono state fotografate ogni 14 s con 13 z-stacks ogni punto temporale (laser: 488 nm, 70 µW). Per la Fig. 8c, le cellule sono state fotografate ogni 40 s con 13 z-stacks ogni punto temporale (laser: 488 nm, 130 µW). Per la determinazione della velocità dei punti di traslazione motorizzata (Fig. 8e), i neuroni sono stati ripresi continuamente a 1 Hz con 13 z-stacks ogni punto di tempo.

Per la Fig. 2b (a destra) e 2c, la co-localizzazione è stato ripreso dal microscopio confocale Olympus IX81 spinning disk (CSU22 testa) descritto prima utilizzando un obiettivo ×100 immersione in olio (NA 1.40) nelle seguenti condizioni: 488 nm (0.77 mW) e 561 nm (0.42 mW) imaging sequenziale per cinque punti di tempo senza ritardo con fette z multiple per coprire l’intero corpo cellulare per ogni punto di tempo, 1 × 1 tasso di rotazione, tempo di esposizione regolata dalla luminosità delle cellule. Le immagini sono state acquisite con una fotocamera Photometrics Cascade II CCD utilizzando il software SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Le immagini visualizzate nelle figure sono stati generati dalla media di cinque punti di tempo e poi un max-proiezione di tutte le z-slices è stata eseguita da Fiji64.

Particella monitoraggio dei siti di traduzione

Singolo sito di rilevamento e di traduzione è stata eseguita su immagini di proiezione massima intensità con Mathematica personalizzato (Wolfram Research) codice 17. Brevemente, le immagini sono state elaborate con un filtro passa-banda per evidenziare le particelle, e poi binarized per rilevare la loro intensità-centroidi come posizioni utilizzando il built-in Mathematica routine ComponentMeasurements. Le particelle rilevate sono state tracciate e collegate nel tempo tramite una ricerca del vicino più vicino. Le coordinate precise (super-risolto posizioni) di mRNA e siti di traduzione sono stati determinati adattando (utilizzando il built-in routine Mathematica NonlinearModelFit) le immagini originali per 2D Gaussiane della seguente forma:

dove IBG è la fluorescenza di fondo, I l’intensità della particella, (x0, y0) la posizione della particella, e (σx, σy) gli spread della particella. L’offset tra le due telecamere è stato registrato utilizzando il built-in Mathematica routine FindGeometricTransform per trovare la funzione di trasformazione che meglio allineato le posizioni montate di 100 nm di diametro Tetraspeck perline uniformemente distribuiti in tutto il campo di vista dell’immagine.

Per le figure 6c, e, f, 7c, 8b, d, le particelle sono stati tracciati da codice Mathematica personalizzato e ulteriormente tracciati con Mathematica. Per la Fig. 7c, gli spostamenti medi al quadrato sono stati calcolati dalle coordinate adattate da Gaussiana (da immagini 2D di proiezione della massima intensità). La costante di diffusione è stata ottenuta adattando i primi cinque punti di tempo ad una linea con pendenza m = 4D, dove D è il coefficiente di diffusione. Le singole macchie di traslazione motorizzati (Fig. 8e) sono stati tracciati dal TrackMate Fiji plugin69 dopo max-proiezione e ulteriormente tracciati con Mathematica. Tutto il codice Mathematica è disponibile su richiesta.

Tracciamento singola molecola di 1 × HA-tagged proteine in cellule

Il giorno prima di imaging, le cellule sono state placcate su MatTek camera e trasfettate transitoriamente con il 1 × HA-mCh-H2B e FB-Halo utilizzando LipofectamineTM LTX reagente con il reagente PLUS (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. 3 ore dopo la trasfezione, il mezzo è stato cambiato in DMEM completo. Prima di imaging, le cellule sono state colorate con boroidride di sodio (NaBH4) trattati Halo ligando TMR (Promega) 45. Brevemente, 1 µL di 1 mM Halo ligando TMR colorante è stato ridotto per 10 min in 200 µL di 50 mM soluzione NaBH4 (pre-dissolto in PBS per 10 min, pH 7,4). Successivamente, 200 µL del TMR ridotto sono stati diluiti con 800 µL di DMEM senza fenolo-rosso per produrre 1 mL di media ridotto-TMR. I media delle cellule trasfettate sono stati sostituiti dai media TMR ridotti e le cellule sono state poste in un incubatore (5% CO2, 37 °C) per 30 minuti per la colorazione. Le cellule sono state poi lavate tre volte con DMEM senza fenolo. Tra i lavaggi, le cellule sono state incubate per 5 min in un incubatore (5% CO2, 37 ° C).

Le cellule sono state imaged utilizzando un custom-built microscopio a fluorescenza a largo campo basato su una illuminazione inclinata (HILO) schema 17,67. Il campo visivo di imaging è stato impostato su 256 × 256 pixel2 (33,3 × 33,3 µm2), e il tempo di integrazione della fotocamera è stato impostato su 30 ms. Le cellule sono state fotografate con un laser da 7.7 mW 561 nm ad una velocità di imaging di 43.8 ms per immagine per un totale di 10.000 punti di tempo (7.3 min). Durante l’imaging, un 6,2 mW 405 nm laser è stato pulsato per 50 ms una volta ogni 10 s per fotoattivare il Halo-TMR ligando ridotto. Singole molecole sono stati monitorati utilizzando il plugin Fiji TrackMate69. Per garantire le tracce rappresentano FB-Halo legato a 1 × HA-mCh-H2B, le tracce sono state ulteriormente filtrate in Mathematica. Il filtro ha eliminato le tracce di lunghezza inferiore a 16 fotogrammi. Inoltre, tutti i salti tra i fotogrammi dovevano essere inferiori a 220 nm. Questo criterio è stato utilizzato da altri per distinguere i fattori di trascrizione che sono legati alla cromatina da quelli che sono unbound46. Infine, in Mathematica, tracce sono stati colorati in base al tempo in cui sono stati acquisiti (come in Fig. 5 supplementare) o la dimensione media salto tra i fotogrammi (come in Fig. 5).

Trattamento con puromicina

Cellule U2OS transitoriamente trasfettati con smHA-KDM5B-MS2 e FB o tallone caricato con smHA-KDM5B-MS2, FB e MCP-HaloTag sono stati imaged come sopra con intervalli di 10 s tra i frame. Dopo aver acquisito 5 o 10 punti di tempo come immagini di pre-trattamento, le cellule sono state trattate con una concentrazione finale di 0,1 mg mL-1 puromicina proprio prima di acquisire il 6° o 11° punto di tempo. Dopo l’aggiunta della puromicina, le cellule sono state fotografate nelle stesse condizioni utilizzate per le immagini di pretrattamento fino a quando le macchie di traslazione sono scomparse.

Cultura dei neuroni e trasfezione

I neuroni corticali di ratto sono stati ottenuti dalle cortecce scartate dei feti del giorno embrionale (E)18 che sono stati precedentemente sezionati per ottenere l’ippocampo, e congelati in mezzo Neurobasal (ThermoFisher Scientific) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS, Atlas Biologicals) e 10% di dimetilsulfossido (Sigma-Aldrich, D8418) in azoto liquido. I neuroni corticali di ratto crioconservati sono stati placcati ad una densità di ∼15.000-30.000 cellule per cm2 su piatti MatTek (MatTek) e coltivati in terreno Neurobasal contenente 2% di supplemento B27 (ThermoFisher Scientific), 2 mM l-alanina/l-glutamina e 1% FBS (Atlas Biologicals). Trasfezioni sono state eseguite dopo 5-7 giorni in cultura utilizzando Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore. Neuroni co-esprimere 4 × HA-mRuby-Kv2.1 e FB-GFP sono stati ripresi 1-2 giorni dopo la trasfezione (Fig. 2b). Neuroni co-esprimere smHA-Kv2.1 e FB-GFP sono stati ripresi 1-7 giorni dopo la trasfezione (Fig. supplementare 2 sinistra). Per i saggi di traduzione, i neuroni sono stati ripresi 4-12 ore dopo la trasfezione. Tutti gli esperimenti di imaging neuronale sono stati eseguiti in una temperatura controllata (37 ° C), umidificato, 5% ambiente CO2 in mezzo Neurobasal senza rosso fenolo (ThermoFisher Scientific). Identità neuronale è stata confermata seguendo i processi che emanano dal corpo cellulare di essere imaged per centinaia di micron per garantire che fossero veri neuriti.

Monitoraggio sviluppo Zebrafish

Tutti gli esperimenti di zebrafish sono stati approvati dal Comitato per la sicurezza genetica Tokyo Tech Experiment (I2018001) e il trattamento degli animali è gestito secondo le linee guida. Per visualizzare FB-GFP in embrione di zebrafish, mRNA per FB-GFP e N × HA-mCh-H2B sono stati preparati. Frammenti di DNA che codificano FB-GFP e N × HA-mCh-H2B sono stati inseriti in un plasmide contenente il promotore T7 e poly A70. I plasmidi successivi (T7-FB-GFP e T7-N × HA-mCh-H2B) sono stati linearizzati con il sito di restrizione XbaI per la trascrizione in vitro utilizzando mMESSAGE mMACHINE kit (ThermoFisher Scientific). RNA è stato purificato utilizzando RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN) e risospeso in acqua. Prima di microiniezione, zebrafish (AB) uova sono state dechorionated da ammollo in 2 mg mL-1 pronase (Sigma Aldrich; P5147) in 0,03% di sale marino per 10 min. Una miscela (~ 0,5 nL) contenente mRNA (200 pg ciascuno per FB-GFP e N × HA-mCh-H2B) è stato iniettato nel tuorlo (vicino alla parte cellulare) di 1-cell stadio embrioni. Per un controllo negativo, HA-mCh-H2B mRNA è stato omesso. 5-10 min dopo l’iniezione mRNA, Cy5-marcato Fab specifico per endogeno istone H3 Lys9 acetilazione (CMA310) 25 è stato iniettato (100 pg in ~ 0,5 nL). Embrioni iniettati sono stati incubati a 28 ° C fino alla fase di quattro cellule e incorporato in 0,5% agarosio (Sigma Aldrich, A0701) in 0,03% di sale marino con il polo animale verso il basso su un 35-mm piatto fondo di vetro (MatTek). Le immagini di fluorescenza sono state raccolte utilizzando un microscopio confocale (Olympus; FV1000) dotato di un palco riscaldato (Tokai Hit) impostato a 28 ° C e una lente UPLSAPO ×30 silicone olio immersione (NA 1.05), gestito dal built-in FV1000 software FLUOVIEW ver.4.2. Tre immagini a colori sono stati acquisiti in sequenza ogni 5 min utilizzando 488, 543, e 633 nm laser (640 × 640 pixel; 0.662 µm pixel-1, pinhole 800 μm; 2.0 μs pixel-1) senza media. Proiezioni di massima intensità sono stati creati da 20 z-stacks con 5 μm.

Nuclei all’interno di embrioni di zebrafish sono stati monitorati in 4D utilizzando il plugin Fiji TrackMate69. I risultati sono stati post-elaborati e tracciati con Mathematica. Per quantificare il numero e l’area dei nuclei e la media nucleare, citoplasmatica, e nucleare: intensità citoplasmatica attraverso il tempo, l’intensità di tutti i nuclei in proiezioni di massima intensità è stata misurata utilizzando il built-in Mathematica funzione ComponentMeasurements. ComponentMeasurements richiede maschere binarie degli oggetti da misurare. Maschere binarie dei nuclei sono stati fatti utilizzando il built-in Mathematica funzione Binarize con una soglia di intensità appropriata per evidenziare solo nuclei in immagini da Cy5-marcato Fab (specifico per endogeno istone H3 Lys9 acetilazione). Maschere del citoplasma intorno a ciascun nucleo sono state fatte dilatando le maschere nucleari di 4 pixel (utilizzando il comando incorporato Dilation) e poi sottraendo dalla maschera dilatata le maschere originali nucleari dilatate di 1 pixel. Questo crea maschere ad anello intorno ad ogni nucleo, da cui è stata misurata l’intensità media citoplasmatica.

Risonanza plasmonica di superficie

La cinetica di legame di FB purificato al tag epitopo HA è stata misurata dalla risonanza plasmonica di superficie (OpenSPR, Nicoyalife). Dopo che il peptide HA marcato con biotina è stato catturato da un chip sensore Streptavidin (Nicoyalife), FB-GFP purificato diluito in tampone PBS, pH 7.4, è stato fatto scorrere lentamente sul chip sensore per 5 minuti per consentire l’interazione. Il tampone in esecuzione è stato poi lasciato scorrere per 10 minuti per raccogliere i dati di dissociazione. La curva di legame non specifico è stata ottenuta facendo scorrere la stessa concentrazione di FB-GFP nello stesso tampone di esecuzione su un diverso chip sensore Streptavidin (Nicoyalife). I dati del controllo sono stati raccolti esattamente come nell’esperimento. Per 100 e 30 nM di FB-GFP, la risposta di legame era significativamente più alto rispetto al controllo, con trascurabile non-specifica interazione di legame. Pertanto, abbiamo scelto queste due concentrazioni per il montaggio della cinetica di legame. Dopo aver sottratto il controllo, la risposta del segnale vs. curva del tempo è stato ottenuto, come mostrato nella Fig. 4 supplementare. Legame parametri cinetici sono stati ottenuti adattando la curva ad un uno-a-uno modello di legame utilizzando TraceDrawer (Nicoyalife) software (Supplementary Fig. 4).

Reporting sintesi

Più informazioni sulla progettazione della ricerca è disponibile nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.