DDRGK1 è richiesto per l’omeostasi ER

Per capire la funzione cellulare di DDRGK1, abbiamo esaminato gli effetti della riduzione di DDRGK1 usando una miscela di due siRNA come descritto precedentemente21. Abbiamo trovato che il knockdown di DDRGK1 ha indotto la morte cellulare apoptotica in entrambe le cellule MCF7 e HepG2, caratterizzata dalla colorazione di Annexin V/PI (Fig. 1a), dall’attivazione della caspasi-3 e dalla scissione di PARP (Fig. 1b). Va notato che possiamo rilevare la scissione della caspasi-3 nelle cellule HepG2 indotte dal knockdown di DDRGK1 ma non nelle cellule MCF7, perché le cellule MCF7 sono carenti di caspasi-322. L’analisi PCR quantitativa in tempo reale (Q-PCR) ha mostrato che il knockdown di DDRGK1 ha aumentato l’espressione dei geni pro-apoptotici BAX, BAK, NOXA, DR5 e Bid, mentre l’espressione del gene anti-apoptotico Bcl-2 è diminuita (Fig. 1c,d). È importante notare che l’abbattimento di DDRGK1 nelle cellule MCF7 e HepG2 ha indotto risposte di stress ER, con un aumento dell’espressione genica specifica per lo stress ER di BiP, HSPA8 e CHOP (Fig. 1e,f).

(a) Le cellule MCF7 e HepG2 sono state trasfettate con siRNA di controllo o siRNA mirato a DDRGK1 per 72 ore. Le cellule sono state successivamente colorate con Annexin V e PI e sottoposte ad analisi citometrica di flusso seguita dalla quantificazione delle cellule apoptotiche (Annexin V+). (b) Analisi Western blot di PARP e caspasi scissa-3 nelle cellule MCF7 e HepG2 di controllo e DDRGK1-knockdown descritte in a. (c,d) Analisi Q-PCR dei livelli di espressione relativa di mRNA di BAX, BAK, NOXA, Bid, DR-5 e Bcl-2 nelle cellule MCF7 e HepG2 di controllo e DDRGK1-knockdown. (e,f) Analisi Q-PCR dei livelli di espressione relativa dell’mRNA di BiP, HSPA8 e CHOP nelle cellule MCF7 e HepG2 di controllo e DDRGK1-knockdown. Tutti i dati sono presentati come media±s.d. di tre esperimenti. *P<0.05, **P<0.01 e ***P<0.001 con il test t di Student.

Per confermare ulteriormente che DDRGK1 è coinvolto nella risposta allo stress ER, abbiamo determinato l’effetto di DDRGK1 sulla sopravvivenza cellulare dopo il trattamento con gli induttori di stress ER tapsigargina (Tg) e tunicamicina (Tm). L’abbattimento di DDRGK1 ha migliorato l’apoptosi indotta dallo stress ER dal trattamento con Tg sia nelle cellule HepG2 che MCF7, come valutato dalla colorazione Annexin V/PI e dalla scissione della caspasi-3 e PARP (Fig. 2a-c e Fig. 1A-C supplementare). Al contrario, la sovraespressione di DDRGK1 ha ridotto la morte cellulare indotta dallo stress ER nelle cellule HepG2 (Fig. 2d-f). Inoltre, la vitalità delle cellule MCF7 è stata valutata con il test MTT, e i risultati hanno mostrato che l’abbattimento di DDRGK1 ha reso le cellule più sensibili al trattamento Tg o Tm, con una ridotta vitalità cellulare (Fig. 1D supplementare), mentre la sovraespressione di DDRGK1 ha promosso la sopravvivenza cellulare dopo il trattamento Tg o Tm (Fig. 1E supplementare). Presi insieme, i nostri risultati suggeriscono che DDRGK1 gioca un ruolo vitale nella regolazione dell’omeostasi ER.

(a). Le cellule HepG2 sono state trasfettate con siRNA di controllo o con siRNA contro DDRGK1 per 72 ore, e poi le cellule sono state trattate con DMSO (controllo veicolo) o Tg (2,5 μM) per 24 ore prima della raccolta. Le cellule sono state colorate con Annexin V e PI, seguite da un’analisi citometrica a flusso. (b). Quantificazione delle cellule apoptotiche (Annexin V+) in a. (c) Analisi Western blot di PARP e caspasi scissa-3 nelle cellule HepG2 descritte in a. (d) Le cellule HepG2 sono state trasfettate con il vettore di controllo o DDRGK1 per 36 h, e le cellule sono state trattate con DMSO o Tg (2,5 μM) per 24 h prima della raccolta. Le cellule sono state colorate con Annexin V e PI, seguite da analisi citometrica a flusso. (e) Quantificazione delle cellule apoptotiche (Annexin V +) in d. (f) analisi Western blot di PARP e scissione della caspasi-3 nelle cellule HepG2 descritto in d. Tutti i dati sono presentati come media ± s.d. da tre esperimenti. **P<0.01 e ***P<0.001 con il test t di Student.

DDRGK1 modula la UPR

Per capire come DDRGK1 regola l’omeostasi ER, abbiamo prima analizzato i cambiamenti nei livelli proteici di tre sensori UPR e i loro obiettivi a valle nelle cellule private di DDRGK1. I risultati hanno mostrato che l’eliminazione di DDRGK1 nelle cellule MCF7 e HepG2 ha ridotto significativamente i livelli di IRE1α totale ma ha diminuito debolmente IRE1α fosforilato (p-IRE1α), il che potrebbe essere dovuto ai ridotti livelli di IRE1α totale (Fig. 3a). I livelli di ATF6 e di ATF6 scisso non sono stati influenzati (Fig. 3a). È interessante notare che il knockdown di DDRGK1 non ha influenzato i livelli di PERK totale, ma i livelli di PERK fosforilata (p-PERK) e BiP sono stati significativamente aumentati (Fig. 3a). Abbiamo poi esaminato gli effetti della deplezione di DDRGK1 sul substrato IRE1α XBP1. I risultati hanno mostrato che XBP1s, una forma spliced di XBP1, era significativamente diminuita nelle cellule MCF7 DDRGK1-knockdown in modo dipendente dal tempo (Fig. 3b), che era correlato ai cambiamenti nei livelli di proteina IRE1α (Fig. 2A supplementare). Inoltre, la deplezione di DDRGK1 ha aumentato i livelli di fosforilazione di eIF2α (p-eIF2α) e l’espressione di CHOP in entrambe le cellule MCF7 e HepG2 (Fig. 2B supplementare). Questi risultati indicano che la deplezione di DDRGK1 reprime la segnalazione UPR-IRE1α e attiva la via apoptotica UPR-PERK, che di conseguenza innesca l’apoptosi, come osservato nelle Figg. 1 e 2. Tuttavia, il livello di IRE1α è stato aumentato nelle cellule che sovraesprimevano DDRGK1 in modo dose-dipendente (Fig. 3c), mentre i livelli di p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP e la forma spliced di XBP1 non erano significativamente cambiati (Fig. 3c; Fig. 2C e D supplementari). Per esplorare la relazione funzionale tra DDRGK1 e la UPR, abbiamo valutato i cambiamenti dinamici di IRE1α e PERK nelle cellule MCF7 DDRGK1-knockdown e nelle cellule di controllo dopo il trattamento con Tg in diversi momenti. Il trattamento con Tg ha aumentato i livelli di IRE1α e p-IRE1α, p-PERK e BiP nelle cellule di controllo, come previsto. Tuttavia, i livelli totali di IRE1α erano significativamente diminuiti (0-24 ore), mentre i livelli p-IRE1α erano modestamente diminuiti (4-24 ore) nelle cellule private di DDRGK1 rispetto alle cellule di controllo (Fig. 3d). Contemporaneamente il livello di XBP1s era diminuito nelle cellule private di DDRGK1 rispetto alle cellule di controllo (4-12 h) (Fig. 3e). I livelli di PERK totale non sono stati modificati, ma p-PERK è stato significativamente aumentato nelle cellule private di DDRGK1 (0-12 h) (Fig. 3d). Risultati simili sono stati ottenuti in cellule HepG2 (Fig. 2E e F supplementari). Presi insieme, i nostri risultati suggeriscono che la deplezione di DDRGK1 causa la degradazione di IRE1α e l’attivazione di PERK.

(a) Le cellule MCF7 e HepG2 sono state trasfettate con siRNA di controllo o siRNA mirato a DDRGK1 per 72 ore. I livelli proteici di p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK, ATF6 e BiP sono stati determinati tramite western blot. (b) Le cellule MCF7 sono state trasfettate con siRNA di controllo o siRNA contro DDRGK1, e le cellule sono state raccolte ai tempi indicati per l’analisi RT-PCR dello splicing di XBP-1. (c) Le cellule MCF7 e HepG2 sono state trasfettate con vettori di controllo o DDRGK1 a varie dosi per 36 ore. I livelli proteici di p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK e ATF6 sono stati determinati tramite western blot. (d) Le cellule MCF7 sono state trasfettate con controllo siRNA o siRNA mirato a DDRGK1 per 72 ore. Le cellule sono state raccolte per il western blot dopo il trattamento con 2,5 μM Tg ai tempi indicati. (e) Analisi RT-PCR dello splicing XBP-1 in d. *Rappresenta una banda non specifica.

DDRGK1 regola l’UPR puntando IRE1α

L’UPR è innescata da sensori di stress ER su stress ER per regolare l’omeostasi ER8. È stato riportato che la delezione specifica per gli epatociti di IRE1α nei topi ha portato all’attivazione della via UPR-PERK23. Per affrontare se l’induzione di p-PERK osservata nelle cellule DDRGK1-deplete fosse mediata da una diminuzione dei livelli di IRE1α, abbiamo esaminato i livelli di p-PERK, PERK e i suoi obiettivi a valle nelle cellule IRE1α-deplete. I risultati hanno mostrato che l’abbattimento di IRE1α ha aumentato significativamente i livelli proteici di p-PERK e p-eIF2α in entrambe le cellule MCF7 e HepG2 (Fig. 4a), simili a quelli osservati nelle cellule private di DDRGK1 (Fig. 3a; Fig. 2B supplementare). Questi risultati indicano che DDRGK1 regola l’UPR prendendo di mira IRE1α. Abbiamo poi studiato come DDRGK1 regola IRE1α. I nostri risultati hanno mostrato che i livelli di proteina IRE1α, ma non i livelli di mRNA (Fig. 3A), erano drammaticamente diminuiti nelle cellule DDRGK1-knockdown (Fig. 3a). Il trattamento delle cellule con l’inibitore del proteasoma MG132 ha bloccato la riduzione mediata da DDRGK1 della proteina IRE1α (Fig. 4b; Fig. 3B supplementare). Inoltre, abbiamo osservato che la deplezione di DDRGK1 ha ridotto drammaticamente l’emivita di IRE1α in un saggio di inseguimento con cicloeximide (Fig. 4c). In accordo con queste osservazioni, abbiamo trovato che l’espressione ectopica di IRE1α ha migliorato la sopravvivenza cellulare in entrambe le cellule MCF7 e HepG2 depauperate da DDRGK1 rispetto alle cellule di controllo, caratterizzate dalla colorazione con Annexin V/PI e dall’attivazione della caspasi-3 (Fig. 4d,e; Fig. 3C e D supplementari). Complessivamente, questi risultati suggeriscono che DDRGK1 regola la stabilità di IRE1α e quindi regola la UPR.

(a). Le cellule MCF7 e HepG2 sono state trasfettate con siRNA di controllo o siRNA mirato a IRE1α per 72 ore. I livelli proteici di p-PERK, PERK, p-eIF2α ed eIF2α sono stati determinati tramite western blot. (b). Analisi Western blot di IRE1α in cellule MCF7 di controllo e DDRGK1-knockdown trattate con o senza MG132 (20 μM, 8 h). (c). Analisi Western blot del decadimento di IRE1α nelle cellule MCF7 di controllo e DDRGK1-knockdown dopo il trattamento con 100 μg ml-1 di cicloeximide per i tempi indicati. Il grafico rappresenta la quantificazione dei livelli di proteina IRE1α. (d) Le cellule MCF7 sono state trasfettate con siRNA di controllo o siRNA mirato a DDRGK1 per 72 ore. Prima della raccolta, le cellule DDRGK1-knockdown sono state trasfettate con vettori di controllo o IRE1α per 36 ore. Le cellule sono state successivamente colorate con Annexin V e PI e sottoposte ad analisi citometrica di flusso, seguita dalla quantificazione delle cellule apoptotiche (Annexin V+). Tutti i dati sono presentati come media±s.d. di tre esperimenti. *P<0,05 con il test t di Student. (e) Analisi Western blot di IRE1α in cellule MCF7 in d.

DDRGK1 interagisce con IRE1α

Per capire come DDRGK1 regola la stabilità di IRE1α, abbiamo testato se DDRGK1 interagisce con IRE1α attraverso un saggio di immunoprecipitazione reciproca (IP) in cellule HEK293T. I risultati hanno mostrato che il Flag-IRE1α espresso esogenamente ha interagito specificamente con DDRGK1 e BiP endogeni (Fig. 5a). Coerentemente, il Flag-DDRGK1 espresso esogenamente ha interagito specificamente con IRE1α endogeno e la nota proteina associata a DDRGK1, C53 (rif. 14). Tuttavia, non siamo stati in grado di rilevare BiP negli immunoprecipitati Flag-DDRGK1 (Fig. 5b), il che suggerisce che DDRGK1 potrebbe non interagire direttamente con BiP. IRE1α, come substrato endogeno di degradazione ER-associata (ERAD), viene degradato attraverso l’associazione tra IRE1α e il complesso Sel1L-Hrd1 ERAD in un modo BiP-dipendente24. Pertanto, abbiamo esaminato se BiP è coinvolto nell’interazione tra DDRGK1 e IRE1α. I risultati hanno mostrato che l’interazione tra DDRGK1 e IRE1α non è stata influenzata dal knockdown di BiP (Fig. 4 supplementare). Per confermare ulteriormente l’interazione di DDRGK1 con IRE1α, abbiamo eseguito esperimenti di colorazione in immunofluorescenza. I risultati hanno mostrato che queste due proteine sono co-localizzate nell’ER (Fig. 5c). Per mappare la regione coinvolta nell’interazione di IRE1α con DDRGK1, abbiamo co-trasfettato Flag-IRE1α wild-type e mutanti di troncamento insieme a DDRGK1 in cellule HEK293T, e i risultati IP hanno mostrato che il dominio citoplasmatico chinasi di IRE1α era necessario per la sua interazione con DDRGK1 (Fig. 5d). Per capire i cambiamenti dinamici nell’interazione tra DDRGK1 e IRE1α in condizioni di stress ER, le cellule HEK293T sono state trasfettate con Flag-DDRGK1 e trattate con Tg per diversi punti di tempo. Come previsto, abbiamo osservato che IRE1α totale, p-IRE1α e BiP erano significativamente aumentati sotto stress ER. È interessante notare che DDRGK1 ha interagito specificamente con IRE1α non fosforilato, ma non con p-IRE1α, negli immunoprecipitati (Fig. 5e). Questi risultati suggeriscono che DDRGK1 interagisce con e mantiene la stabilità di IRE1α non fosforilato.

(a). Analisi Western blot di immunoprecipitati di gel di affinità Flag M2 in cellule HEK293T trasfettate con vettori Flag-Vector o Flag-IRE1α per 36 h. (b). Analisi Western blot di immunoprecipitati di gel di affinità Flag M2 in cellule HEK293T trasfettate con Flag-Vector o Flag-DDRGK1 per 36 ore. (c). Le cellule MCF7 sono state doppiamente colorate con l’anticorpo anti-DDRGK1 (verde) e l’anticorpo anti-IRE1α (rosso). I nuclei delle cellule sono stati controcolorati con DAPI (blu). La co-localizzazione tra le due proteine endogene DDRGK1 e IRE1α è mostrata nel pannello di unione. Barra della scala, 20 μm. (d) Schemi di IRE1α wild-type e costrutti troncati e analisi western blot del gel di affinità Flag M2 immunoprecipitati in cellule HEK293T trasfettate con Flag-Vector o Flag-IRE1α wild-type e troncati. (e) Analisi Western blot di immunoprecipitati del gel di affinità Flag M2 in cellule HEK293T trattate con mock o Tg (2,5 μM) che esprimono Flag-Vector o Flag-DDRGK1.

Ufm1 è richiesto per l’interazione di DDRGK1 e IRE1α

Un recente studio ha dimostrato che DDRGK1 è un substrato di ufmilazione ed è richiesto per la ufmilazione di ASC115,20. Per indagare se l’ufmilazione è coinvolta nella regolazione della stabilità di IRE1α da parte di DDRGK1, abbiamo esaminato se la deplezione di Ufm1 influenza l’espressione della proteina IRE1α. Similmente alla deplezione di DDRGK1, abbiamo osservato che il knockdown dell’espressione di Ufm1 ha ridotto drammaticamente i livelli della proteina IRE1α (Fig. 6a), indicando che DDRGK1 regola IRE1α attraverso la ufmilazione. Coerentemente, abbiamo trovato che la sovraespressione di DDRGK1 non è riuscita a stabilizzare la proteina IRE1α nelle cellule MCF7 Ufm1-knockdown rispetto alle cellule di controllo (Fig. 6b). Inoltre, i livelli di proteina IRE1α erano drammaticamente diminuiti nelle cellule MCF7 Ufm1-knockdown sia in assenza che in presenza di Tg (Fig. 6c), il che suggerisce che la ufmilazione è necessaria per la regolazione della stabilità della proteina IRE1α da parte di DDRGK1. Ci siamo poi chiesti se IRE1α è soggetto a modifiche di ufmilazione. Per rispondere a questa domanda, abbiamo rilevato la ufmilazione di IRE1α in cellule che esprimono DDRGK1 e Ufm1 così come UBA5 (E1), UFC1 (E2) e UFL1 (E3), come precedentemente descritto20. Tuttavia, non siamo stati in grado di rilevare qualsiasi ufmilazione della proteina IRE1α, anche se ufmilazione della proteina DDRGK1 era facilmente rilevabile, come precedentemente descritto (dati non mostrati)15,20,25, suggerendo che IRE1α potrebbe non essere un obiettivo di ufmilazione. È interessante notare che abbiamo trovato che l’associazione tra DDRGK1 e IRE1α era significativamente diminuita nelle cellule HEK293T Ufm1-knockdown rispetto alle cellule di controllo (Fig. 6d). Coerentemente con questa osservazione, abbiamo trovato che l’interazione di DDRGK1 K267R (un mutante DDRGK1 carente in ufmilazione, in cui il residuo di lisina 267 è stato sostituito con un residuo di arginina)15 con IRE1α era drammaticamente diminuito rispetto al wild-type DDRGK1 (Fig. 6e), indicando che ufmilazione di DDRGK1 è richiesto per l’associazione tra DDRGK1 e IRE1α. Inoltre, DDRGK1 K267R non è riuscito a stabilizzare la proteina IRE1α rispetto al tipo selvaggio DDRGK1 (Fig. 6f). Insieme, questi risultati suggeriscono che la ufmilazione di DDRGK1 a K267 è richiesta per la sua interazione con IRE1α e la regolazione della stabilità della proteina IRE1α.

(a) Le cellule MCF7 sono state trasfettate con siRNA di controllo o siRNA mirato a Ufm1 per 72 ore. I livelli proteici di IRE1α sono stati determinati tramite western blot. (b) Analisi western blot di IRE1α in cellule MCF7 di controllo e Ufm1-knockdown che esprimono il vettore o DDRGK1. (c) Il livello proteico di IRE1α è stato determinato mediante western blot nelle cellule MCF7 di controllo e Ufm1-knockdown dopo il trattamento con 2,5 μM Tg per i tempi indicati. (d) Analisi Western blot di immunoprecipitati su gel di affinità Flag M2 in cellule HEK293T di controllo e Ufm1-knockdown che esprimono Flag-Vector o Flag-DDRGK1. (e) Analisi Western blot di immunoprecipitati del gel di affinità Flag M2 in cellule HEK293T trasfettate con Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT o K267R mutante. (f) Analisi Western blot di IRE1α in cellule MCF7 trasfettate con Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT o K267R mutante.

DDRGK1 è richiesto per la capacità di ricostituzione HSC nei topi

Un recente studio ha suggerito che le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono estremamente sensibili allo stress ER26. Questo ci ha portato a ipotizzare che DDRGK1 potrebbe essere fondamentale nella funzione delle HSC. Abbiamo determinato il livello di espressione di DDRGK1 in più lignaggi ematopoietici da 2 mesi-vecchio topi wild-type. La Q-PCR ha rivelato un livello significativamente più alto di espressione di DDRGK1 nelle CSE, comprese le CSE a lungo termine (LT-HSC), le CSE a breve termine (ST-HSC) e i progenitori multipotenti (MPP) (Fig. 7a). Inoltre, il livello proteico di DDRGK1 era altamente espresso nelle cellule del midollo osseo (BM) arricchite con Lineage-c-Kit+ rispetto alle cellule Lineage+c-Kit- BM (Fig. 7b). Queste osservazioni suggeriscono un ruolo importante di DDRGK1 nelle cellule staminali. Per esaminare il ruolo di DDRGK1 nella funzione delle CSE, sono stati eseguiti esperimenti di trapianto competitivo con le CSE dopo la riduzione lentivirale di DDRGK1 (Fig. 7c). Le cellule Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) di topi donatori CD45.1 sono state trasdotte con lentivirus di controllo o DDRGK1-knockdown e trapiantate in topi riceventi CD45.2 irradiati letalmente. L’analisi citometrica a flusso ha mostrato che la percentuale di cellule del sangue periferico (PB) derivate dal donatore era significativamente ridotta nel gruppo DDRGK1-knockdown rispetto al controllo, indicando che il knockdown di DDRGK1 ha significativamente compromesso la capacità di ricostituzione competitiva delle HSCs (Fig. 7d). Mentre in un esperimento di trapianto non competitivo, i topi riceventi trapiantati con HSC DDRGK1-knockdown erano ancora vivi 3 mesi dopo il trapianto, questo suggerisce che il knockdown di DDRGK1 stava semplicemente compromettendo la capacità di ricostituzione competitiva delle HSC. Per escludere effetti off-target, abbiamo progettato un altro shRNA mirato a DDRGK1 e abbiamo osservato risultati simili (Fig. 5A supplementare). Tre mesi dopo il trapianto, i topi riceventi sono stati eutanasizzati per l’analisi del BM e i saggi di formazione di colonie in vitro. L’analisi citometrica a flusso ha mostrato che l’abbattimento di DDRGK1 ha drammaticamente compromesso il mantenimento delle CSE trasdotte senza influenzare il loro potenziale di lignaggio (cioè i lignaggi delle cellule mieloidi, B e T), come indicato da una diminuzione della frequenza delle cellule ematopoietiche staminali e progenitrici derivate dal donatore, così come le cellule ematopoietiche differenziate nel BM e PB (Fig. 7e). Un risultato simile è stato osservato in un esperimento indipendente utilizzando un altro shRNA mirato a DDRGK1 (Fig. 5B supplementare). Inoltre, abbiamo isolato le cellule CD34-Flt3-LSK derivate dal donatore (LT-HSCs) dai topi riceventi e abbiamo eseguito un test di formazione di colonie di cellule singole. I risultati hanno mostrato che il knockdown di DDRGK1 ha compromesso la capacità delle HSCs di formare colonie intermedie e grandi (Fig. 7f). Complessivamente, questi dati suggeriscono che DDRGK1 è richiesto per il mantenimento della funzione HSC.

(a) Analisi Q-PCR dei livelli di espressione relativa dell’mRNA di DDRGK1 nelle sottopopolazioni indicate del BM da giovani topi wild-type (2 mesi, n=3). L’espressione relativa di DDRGK1 è stata normalizzata rispetto a GAPDH. I dati sono presentati come media±s.d. (b) Analisi Western blot di DDRGK1 in cellule arricchite Lineage+ c-Kit- e Lineage- c-Kit+ da giovani topi wild-type (2 mesi). (c) Schema sperimentale per il saggio di ricostituzione. (d) Rappresentante FACS pattern che mostra la percentuale di cellule GFP-positive in controllo donatore-derivato (sh-Vector) o DDRGK1-knockdown (sh-DDRGK1) cellule PB (pannello sinistro). I valori rappresentano le percentuali normalizzate di cellule GFP+ derivate dal donatore nell’incisione totale (pannello destro, n=3). I dati sono presentati come media±s.d. **P<0.01 e ***P<0.001 con il test t di Student. (e) I valori rappresentano le percentuali di cellule GFP+ derivate dal donatore in LT-HSC (CD34-Flt3- LSK), ST-HSC (CD34+Flt3- LSK), MPP (CD34+Flt3+ LSK), CMP (CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B, T e popolazioni di cellule del lignaggio mieloide nel BM da topi riceventi primari 12 settimane dopo il trapianto (n=3). I dati sono presentati come media±s.d. ***P<0.001 con il test t di Student. (f) Singole LT-HSC derivate da donatore GFP+ da topi riceventi sono state smistate in piastre da 96 pozzetti e coltivate per 14 giorni in vitro. La percentuale di colonie è stata calcolata dividendo il numero di colonie per il numero originale di singole cellule che sono state seminate. I dati sono presentati come media±s.d. **P<0.01 con il test t di Student.

Per esaminare se la funzione alterata delle HSC fosse dovuta a una ridotta efficienza di homing, abbiamo etichettato le cellule LSK di controllo o trasdotte con lentiviral sh-DDRGK1 purificate da topi di 2 mesi con un colorante fluorescente (viola) e le abbiamo iniettate in destinatari irradiati letalmente. La percentuale di cellule LSK etichettate presenti nel BM del ricevente 18 ore dopo il trapianto è stata analizzata mediante citometria a flusso. I risultati hanno mostrato che la capacità di homing delle cellule LSK DDRGK-knockdown era paragonabile a quella delle cellule di controllo (Fig. 6A e B supplementari). Per determinare se il knockdown di DDRGK1 aveva un effetto sullo stato del ciclo cellulare delle cellule LSK, abbiamo colorato le cellule LSK di controllo derivate da donatori e DDRGK1-knockdown con il marker di proliferazione Ki67 e DAPI e non abbiamo trovato alcuna differenza significativa nei profili del ciclo cellulare tra le HSC DDRGK1-knockdown e le HSC di controllo (Fig. 7A supplementare). Abbiamo poi esaminato l’effetto di DDRGK1-knockdown sull’apoptosi delle CSE usando la colorazione dell’allegato V e abbiamo trovato una frequenza significativamente più alta di apoptosi nelle cellule LSK derivate dal donatore DDRGK1-knockdown rispetto alle cellule LSK di controllo; questo fenomeno è stato osservato con entrambi gli shRNA che hanno come target DDRGK1 (Fig. 8a; Fig. 7B supplementare). Successivamente, abbiamo esaminato i livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nelle CSE trasdotte. I risultati hanno mostrato che il livello di ROS era comparabile tra i gruppi di controllo e DDRGK1-knockdown (Fig. 7C supplementare). Sulla base delle osservazioni di cui sopra, abbiamo concluso che il knockdown di DDRGK1 nelle HSCs ha indotto la morte cellulare apoptotica, compromettendo così la funzione delle HSC.

(a) Modello FACS rappresentativo che mostra la percentuale di cellule positive all’annessina V all’interno delle cellule LSK di controllo derivate dal donatore e DDRGK1-knockdown dopo il trapianto (pannello sinistro). Il grafico a barre mostra la percentuale di cellule Annexin V-positive all’interno delle cellule LSK (pannello destro, n=3). I dati sono presentati come media±s.d. *P<0.05 con il test t di Student. (b) Analisi Q-PCR dei livelli di espressione relativa dell’mRNA di DDRGK1, BiP e CHOP in cellule LSK derivate da donatore e DDRGK1-knockdown dopo il trapianto (n=3). I dati sono presentati come media±s.d. **P<0.01 e ***P<0.001 con il test t di Student. (c) Analisi Western blot di p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK e ATF6 in cellule GFP+Lineage-c-Kit+ derivate da donatori arricchite da topi riceventi di controllo o DDRGK1-knockdown. *Rappresenta una banda non specifica. (d) Analisi RT-PCR dello splicing XBP-1 nelle cellule LSK di controllo derivate dal donatore e DDRGK1-knockdown dopo il trapianto. Le cellule MEF con trattamento Tg sono servite come controllo dello splicing di XBP-1.

Per indagare se la funzione alterata delle CSE fosse dovuta all’attivazione della risposta allo stress ER nelle CSE DDRGK1-knockdown, abbiamo analizzato i livelli di espressione di BiP e CHOP mediante Q-PCR nelle CSE incise di controllo e DDRGK-knockdown, i risultati hanno mostrato che i livelli di mRNA di BiP e CHOP erano significativamente aumentati nelle CSE DDRGK1-knockdown (Fig. 8b). Inoltre, abbiamo esaminato i livelli proteici dei sensori di stress ER nelle cellule BM Lineage-c-Kit+ di controllo e DDRGK-knockdown. In accordo con l’osservazione nelle linee cellulari tumorali, il knockdown di DDRGK1 ha mostrato livelli proteici diminuiti di IRE1α e p-IRE1α e un livello aumentato di p-PERK, mentre i livelli di ATF6 non differivano nei gruppi di controllo e DDRGK1-knockdown (Fig. 8c). Coerentemente, il livello di XBP1s era diminuito nelle cellule LSK derivate dal donatore DDRGK1-knockdown (Fig. 8d). Nel complesso, questi risultati indicano che il knockdown di DDRGK1 ha compromesso la segnalazione di IRE1α ma ha attivato la via PERK e supportano ulteriormente che DDRGK1 è fondamentale per il corretto mantenimento dell’omeostasi ER e quindi essenziale per la sopravvivenza e il mantenimento delle HSCs.