Junction Melting

Come primo passo per valutare l’applicabilità del modello 3SPN.2 per prevedere le proprietà termodinamiche di massa della giunzione Holliday, valutiamo le proprietà di fusione della giunzione dalle simulazioni del modello 3SPN.2 e le confrontiamo con i nostri esperimenti di assorbimento. Simuliamo la fusione della giunzione tramite replica-exchange molecular dynamics (REMD, vedi metodi) per migliorare il campionamento degli stati parzialmente fusi. Campionamento accurato della frazione relativa di intatto, fuso e parzialmente fuso configurazioni di giunzione non è attualmente possibile utilizzando un all-atom rappresentazione.

Figura 2 mostra la frazione di single-strand α come funzione di T su una gamma di concentrazioni di sale sia per il modello 3SPN.2 e misure di assorbimento. Vedi i metodi per la definizione di α nelle simulazioni. La somiglianza tra le simulazioni e gli esperimenti è sorprendente. Sia le simulazioni che gli esperimenti mostrano che la temperatura di fusione aumenta con l’aumentare della concentrazione di sale e che la transizione diventa sempre più netta, o “cooperativa”. I dati possono essere ben descritti dalla legge dell’azione di massa, o relazione di van’t Hoff46,

Proprietà di fusione della giunzione J34.

Confronto della frazione di singolo filamento α da (a) simulazioni e (b) esperimenti. Abbiamo adattato i dati usando l’equazione di van’t Hoff (equazione 1), indicata dalle linee solide. Seguendo la convenzione, definiamo TM come la temperatura alla quale α = 0,5.

dove K è la costante di equilibrio per la fusione della giunzione, ΔH e ΔS sono l’entalpia e la differenza di entropia tra la giunzione fusa e quella intatta, che si suppone siano costanti in questo intervallo di temperatura e C è la concentrazione totale del filamento (la concentrazione di ogni filamento è C/4). Si noti che ΔS controlla la nitidezza della transizione di fusione. Discuteremo di seguito il comportamento di ΔH e ΔS, che sono determinati dai dati di adattamento nell’intervallo 0.1<α<0.9.

La temperatura di fusione TM è un’utile metrica termodinamica della stabilità della giunzione ed è comunemente definita come la temperatura alla quale α = 1/2. La figura 3 mostra i valori sperimentali e simulati di TM in funzione della concentrazione di sale. Come anticipato dalle curve di fusione, le simulazioni rispecchiano da vicino la dipendenza sperimentale di TM. Anche la somiglianza quantitativa è notevole. I risultati della simulazione sono costantemente spostati verso una T superiore di 5-8 K, una differenza inferiore al 3%. Per entrambi gli esperimenti e le simulazioni, la temperatura di fusione è quasi indipendente dalla concentrazione di sale per ≥ 200 mM. Questa indipendenza è legata allo screening delle interazioni elettrostatiche ad alte concentrazioni di sale; di conseguenza, la Fig. 3 mostra anche la lunghezza di screening Debye utilizzata nel modello 3SPN.2 per l’approssimazione Debye-Hückel delle interazioni elettrostatiche. La lunghezza di screening è <6 Å ad alta concentrazione di sale, rendendo la repulsione elettrostatica insignificante. La corrispondenza tra i valori TM dell’esperimento e della simulazione convalida il trattamento approssimativo dell’elettrostatica nel modello 3SPN.2. Dato che il modello 3SPN.2 è stato parametrizzato solo per imitare la fusione del duplex B-DNA, i dati di fusione della giunzione suggeriscono che il modello 3SPN.2 è trasferibile alla termodinamica di strutture di DNA più complesse. Allo stesso tempo, questa scoperta non è del tutto imprevista, poiché la fusione di ogni braccio dovrebbe essere molto simile a quella del DNA duplex ordinario.

Dipendenza dalla concentrazione di sale della temperatura di fusione della giunzione TM.

A tutte le concentrazioni, TM differisce di <3% tra le simulazioni 3SPN.2 (cerchi verdi) e gli esperimenti di assorbimento (diamanti rossi). Le linee sono intese solo come una guida per l’occhio. La figura mostra anche la lunghezza di screening di Debye usata dal modello 3SPN.2 nell’approssimazione Debye-Hückel alle interazioni elettrostatiche. Il plateau della temperatura di fusione coincide con un forte screening delle interazioni elettrostatiche.

L’adattamento dei dati usando la relazione di van’t Hoff (equazione 1) fornisce una stima dell’entalpia e dell’entropia di fusione. I valori di ΔH e ΔS da questo adattamento sono dell’ordine di grandezza corretto che ci si aspetterebbe in base ai parametri termodinamici determinati da SantaLucia e collaboratori47,48. L’inserto della Fig. 4 mostra che le simulazioni sovrastimano modestamente i valori di ΔH e ΔS rispetto agli esperimenti e che ΔH varia quasi linearmente con ΔS. Questa relazione lineare è talvolta indicata come una relazione di “compensazione”. Infatti, l’equazione di van’t Hoff implica una relazione specifica tra ΔH e ΔS

Thermodynamics of junction melting.

L’entropia ΔS e l’entalpia ΔH della fusione ottenute adattando gli esperimenti (diamanti rossi) e le simulazioni (cerchi verdi) all’equazione di van’t Hoff (equazione 1). Il riquadro mostra una relazione lineare approssimativa di compensazione entropia-entalpia. Sia i dati sperimentali che quelli simulati mostrano un migliore accordo con l’equazione di van’t Hoff valutata alla TM (eq. 2, linea blu).

che segue dall’eq. 1 impostando α = 1/2 alla TM. La figura 4 dimostra la coerenza con questa relazione e chiarisce che la compensazione lineare tra ΔH e ΔS è solo approssimativa; se i valori TM variassero più significativamente con la concentrazione, le deviazioni dalla linearità tra ΔH e ΔS sarebbero più evidenti, mentre l’eq. 2 dovrebbe rimanere valida. Più importante da un punto di vista pratico è che questi risultati dimostrano l’efficacia del modello 3SPN.2 nel riprodurre le caratteristiche energetiche e termodinamiche delle giunzioni che sono in stretto accordo con i dati sperimentali.

Abbondanze conformazionali e struttura

Per sondare ulteriormente la capacità del modello 3SPN.2 di prevedere le proprietà sperimentali della giunzione, esaminiamo la popolazione relativa delle conformazioni di giunzione. Sperimentalmente, è noto che la forma planare aperta è predominante a bassa concentrazione di sale e, a concentrazioni di sale più alte, le giunzioni adottano conformazioni impilate (Fig. 1). Ad una concentrazione relativamente alta = 50 mM e T = 298 K, gli esperimenti indicano un 23/77% abbondanza relativa di stacked isoforme I / II, rispettivamente15. Qui, usiamo il modello 3SPN.2 per esaminare una vasta gamma di concentrazioni di sale a T = 300 K per convalidare il modello e fornire una previsione per la dipendenza complessiva concentrazione di sale di popolazioni di giunzione. Si noti che esaminiamo l’effetto di Na +, piuttosto che Mg2 +, che produce risultati simili 16,45.

Come Thirumalai e collaboratori sottolineato 26, la corrispondenza tra una media temporale e la media di insieme (ergodicità) per quattro vie giunzioni può essere rotto su scale temporali piuttosto grandi osservazionali, a causa del tasso di conversione tra conformazioni giunzione. Quindi, per stimare le popolazioni relative dei conformatori impilati, abbiamo bisogno di un insieme significativo di simulazioni. Di conseguenza, per ogni concentrazione di sale, effettuiamo 100 simulazioni indipendenti, ciascuna a partire dalla configurazione aperta, poiché questa conformazione si converte rapidamente e casualmente in iso-I o iso-II. Ogni simulazione viene eseguita per 2 μs, ottenendo 200 μs totale di dati traiettoria per ogni concentrazione di sale, diviso tra 100 campioni indipendenti. Questo fornisce una stima iniziale per la popolazione relativa di ogni conformazione. Sulla base di questa stima, eseguiamo 100 ulteriori simulazioni utilizzando un rapporto di aperto, iso-I o iso-II configurazioni iniziali che sono conformi alla stima preliminare della popolazione, al fine di vedere se i nostri risultati sono sensibili a partire dallo stato aperto. Troviamo che le stime della popolazione rimangono stabili all’interno della nostra incertezza statistica, così che non troviamo alcun effetto significativo dovuto alla partenza dallo stato aperto. I nostri risultati sono influenzati se usiamo tutte le configurazioni iniziali iso-I o tutte le configurazioni iso-II, a causa dell’interconversione relativamente lenta di questi stati.

Per valutare le popolazioni di giunzione, abbiamo bisogno di identificare una metrica che distingua accuratamente tra le tre conformazioni di giunzione primaria. Sperimentalmente, gli studi FRET usano comunemente la distanza tra le estremità dei bracci selezionati (che definisce l’angolo inter-duplex) per distinguere gli stati conformazionali. Abbiamo inizialmente esaminato l’angolo inter-duplex, ma abbiamo trovato (come viene discusso più avanti) che l’IDA fluttua sostanzialmente in ogni isoforma, rendendo difficile distinguere senza ambiguità le conformazioni. Invece, abbiamo trovato che le separazioni interbase vicino al cuore della giunzione forniscono un indicatore più affidabile della conformazione della giunzione. Queste distanze dovrebbero anche essere accessibili sperimentalmente utilizzando una coppia di analoghi nucleotidici fluorescenti di base, come 6-metil isoxanthopterin (6-MI) o 2-aminopurina, posti giudiziosamente vicino al centro della giunzione. I pannelli inferiori della Fig. 1 mostrano le otto basi al centro della giunzione nei conformeri iso-I e iso-II, così come la forma aperta. Nel conformatore iso-I, la separazione dTT delle basi T (sui filamenti X e H) e la separazione dCC delle basi C (anche sui filamenti X e H) sono molto più piccole delle separazioni dAG delle basi A e G (sui filamenti B e R); nel conformatore iso-II, lo stacking inverso porta al comportamento opposto delle distanze relative. Nella forma aperta, tutte queste distanze sono simili, ma più grandi delle distanze dei conformeri impilati iso-I e II.

Pertanto, dovremmo essere in grado di distinguere tra iso-I e II semplicemente basandoci su queste separazioni interbase. Per confermare questo, in Fig. 5 tracciamo la distribuzione di frequenza normalizzata delle distanze interbase P(dTT ∪ dCC) e P(dAG), che dimostra la presenza di due picchi distinti per tutte le concentrazioni ≥50 mM. Per P(dAG) (Fig. 5a), il picco a piccola separazione indica gli stati conformer iso-II e il picco a separazione maggiore è dovuto a conformazioni iso-I o aperte. Per P(dTT ∪ dCC) (Fig. 5b), il picco a piccole distanze indica gli stati iso-I e il picco a distanze maggiori sono sia iso-II o conformazioni aperte. Adottiamo un cut-off di 12 Å di separazione, la posizione approssimativa del minimo delle distribuzioni, per distinguere le giunzioni come sia il stacked iso-I o iso-II conformer. Quelle configurazioni che sono identificate come né iso-I né II sono classificate come conformatori aperti. Coerentemente con l’aspettativa che la conformazione aperta domini a basse concentrazioni di sale, nessuna delle due distribuzioni ha un picco per piccole separazioni e così quasi tutte le configurazioni a basso sale sono identificate con la conformazione aperta.

Criterio per distinguere le conformazioni di giunzione.

Distribuzione della separazione interbase al centro della giunzione per (a) le basi AG, dove una piccola separazione identifica il conformatore iso-II e (b) le coppie TT o CC, dove una piccola separazione identifica il conformatore iso-I. Il picco di distanza maggiore a bassa concentrazione di sale è dovuto a conformazioni aperte; a sale più alto, deriva principalmente dalla forma complementare impilata. La linea verticale tratteggiata indica il criterio di cutoff che usiamo per identificare successivamente gli stati conformazionali delle singole configurazioni.

Utilizzando questi criteri per distinguere i conformatori, identifichiamo le singole configurazioni con uno dei tre isomeri e mostriamo serie temporali rappresentative delle conformazioni di giunzione per cinque simulazioni a = 300 mM in Fig. 6a. La figura 7a mostra le configurazioni rappresentative di questi conformatori. I dati della serie temporale mostrano qualitativamente che la conformazione aperta è estremamente breve e agisce come uno stato di transizione tra i conversi iso-I e iso-II a lunga durata. Questo è stato precedentemente dedotto da esperimenti di singola molecola8,15,16,50 e in questo studio, osserviamo esplicitamente e confermiamo il meccanismo di transizione tra gli stati di conformazione di equilibrio. Dimostriamo quantitativamente il ruolo della conformazione aperta come intermedio valutando le nove probabilità di transizione (comprese le transizioni alla stessa conformazione) tra i tre conformeri. La figura 6b mostra che le probabilità di transizione per Iso I→II e II→I sono irrisorie sulla scala di questi grafici (zero, entro l’incertezza del nostro calcolo). Di conseguenza, l’unico percorso tra i conformeri impilati è attraverso il conformatore aperto, stabilendolo come stato di transizione. La figura 6c mostra come le probabilità di transizione tra le conformazioni impilate e aperte variano con la concentrazione di sale, con transizioni allo stato aperto che dominano a basse concentrazioni di sale. Le cinque serie temporali in Fig. 6a dimostrano anche che la media temporale dei dati varia da campione a campione. Chiaramente 2 μs è inadeguato per un campionamento ergodico delle abbondanze conformazionali e richiede il nostro approccio di utilizzare un insieme di simulazioni. Questo approccio è possibile per il modello a grana grossa, ma è oltre le attuali risorse computazionali per un modello a tutti gli atomi. Questa “ergodicità rotta” è simile alla scoperta sperimentale che il campionamento conformazionale è non-ergodico su grandi scale temporali26. Tuttavia, dovremmo essere attenti a sottolineare che l’ergodicità rotto qui è interamente dovuto alla natura stocastica del campionamento conformazionale, mentre negli esperimenti di rif. 26, variazioni nel legame di ioni alle giunzioni individuali anche giocare un ruolo.

Variazioni da molecola a molecola nel campionamento conformazionale e nelle probabilità di transizione conformazionale.

(a) Serie temporale di esempio delle conformazioni di giunzione per cinque dei 100 membri dell’ensemble a = 300 mM. L’isoforma aperta è di breve durata e agisce uno stato di transizione tra iso-I e iso-II. (b) Matrice delle probabilità di transizione da un dato stato iniziale allo stato finale a = 300 mM. Le probabilità di transizione allo stesso stato (elementi diagonali) non sono mostrati, poiché la tendenza a rimanere nello stato attuale domina la scala di altre probabilità di transizione49. Si noti che le probabilità di transizione per iso I→II (e viceversa) sono quasi zero. (c) Dipendenza dalla concentrazione del sale delle quattro probabilità di transizione chiave.

Conformazioni di giunzione, abbondanza e struttura.

(a) Conformazioni rappresentative osservate nelle nostre simulazioni; solo la spina dorsale del DNA è mostrata, per semplicità. (b) L’abbondanza relativa delle isoforme primarie in funzione della concentrazione di sale. Le identità delle isoforme sono definite dalle separazioni delle basi all’interno della giunzione, come descritto nel testo. (c) angolo inter-duplex (IDA) per ogni conformazione. Si noti che la conformazione planare aperta è predominante solo a basso sale. A sale più alto, la piccola frazione di conformazioni aperte campionate adotta (in media) una conformazione tetraedrica.

In base ai dati della serie temporale per la conformazione della giunzione, valutiamo direttamente la frazione di configurazioni nelle conformazioni aperte, iso-I o iso-II in funzione della concentrazione di sale (Fig. 7b). Come ci aspettiamo, per basse concentrazioni di sale (= 10 mM), osserviamo essenzialmente solo lo stato planare aperto con geometria quadrata. A tutte le concentrazioni di sale più alte, i conformatori impilati sono preferiti, con una media di ≈58% in iso-II e 36% in iso-I (per ≥200 mM). Le nostre simulazioni prevedono che, tranne che per concentrazioni di sale piuttosto basse, la frazione relativa dei conformeri non dipende significativamente dal sale. La dominanza delle conformazioni impilate ad alta concentrazione di sale può essere prevista a causa del forte screening delle interazioni elettrostatiche, simile alla dipendenza dalla concentrazione di sale della temperatura di fusione. Tuttavia, questo screening non spiega la polarizzazione verso la conformazione iso-II impilata. La differenza nella popolazione di isomeri deve sorgere a causa di effetti di sequenza di base vicino al nucleo della giunzione, come osservato sperimentalmente16,17. Il fatto che il modello riproduce il bias sperimentalmente noto verso iso-II indica il grado di successo del modello a grana grossa nel catturare la struttura dipendente dalla sequenza. Troviamo anche una piccola frazione, 6%, di configurazioni di giunzione nello stato aperto ad alto sale. Come discusso sopra, queste conformazioni sono di breve durata e facilitano le trasformazioni tra le conformazioni impilate. Rispetto agli esperimenti di Ha e collaboratori15 a concentrazioni di sale relativamente alte, il modello 3SPN.2 sotto prevede la polarizzazione verso iso-II di circa il 15%. La differenza può essere dovuta in parte alla differenza nei criteri sperimentali e computazionali utilizzati per definire le isoforme, in particolare, esaminiamo le separazioni di base all’interno della giunzione, mentre gli esperimenti FRET utilizzare etichette che sono sensibili alla separazione delle estremità dei bracci R e X della giunzione (effettivamente l’IDA). Per H-come conformazioni con un centro di giunzione aperto (osservato sperimentalmente in presenza di endonucleasi12), questi approcci alternativi sarebbe sistematicamente differiscono nella loro classificazione: (i) in base alle estremità della giunzione, le conformazioni H sarebbero classificate come iso-I o II; (ii) al contrario, in base alla separazione al centro della giunzione, le conformazioni H sarebbero classificate come aperte, in modo che i nostri criteri produrranno sempre una frazione impilata più piccola.

Siccome i nostri criteri ci permettono di categorizzare le conformazioni delle singole configurazioni di giunzione, possiamo anche valutare direttamente la struttura media di ciascuna di queste conformazioni. Caratterizziamo la struttura della giunzione attraverso l’angolo inter-duplex (IDA), che definiamo dall’angolo formato dai bracci XR e RH con il vertice della giunzione51. Di conseguenza, l’IDA per iso-II dovrebbe essere sostanzialmente più piccolo di quello di iso-I. La figura 7c conferma questa aspettativa, con l’IDA di iso-II che si avvicina a 90° ad alta concentrazione di sale e l’IDA di iso-I vicino a 140°. Un valore di 90° per iso-II è grande rispetto alle stime sperimentali, che sono dell’ordine di 40-60° basato su misure di equilibrio FRET41,44,45, un punto su cui torneremo. Dovremmo anche essere chiaro che 90° per iso-II non implica una configurazione planare, che è visivamente evidente nelle configurazioni rappresentative mostrate in Fig. 7a; a causa della struttura tridimensionale, anche una struttura impilata può adottare un angolo vicino a 90°. Alle concentrazioni di sale più basse, non possiamo stimare l’angolo per le conformazioni impilate, poiché esse non sono essenzialmente campionate. A = 10 mM, troviamo l’IDA della giunzione aperta è 95 °, coerente con una giunzione quasi planare, che è anche visivamente evidente in Fig. 7a. A concentrazioni di sale più elevate, la piccola frazione di configurazioni aperte adotta un angolo un po ‘più grande di ≈105 °. Questo angolo più grande è coerente con una configurazione quasi tetraedrica (Fig. 7a), che dovrebbe forse essere considerata distinta dalla configurazione planare aperta a bassa concentrazione di sale. Così, i nostri risultati suggeriscono che gli stati di transizione tra conformatori impilati sono prevalentemente conformazioni tetraedriche aperte, piuttosto che planari. Tali intermedi di tipo tetraedrico sono stati osservati in precedenza nelle simulazioni23. Infatti, la possibilità di una moltitudine di conformazioni di giunzione è stata dedotta dall’analisi dei dati di singola molecola26.

Confronti struttura di giunzione

Come punto finale di confronto, consideriamo come l’IDA valutato dal modello 3SPN.2 confronta con misure sperimentali e quello stimato dalla nostra simulazione AMBER tutto l’atomo. Le misure FRET hanno stimato che l’IDA di iso-II è 43 ± 8° a T = 283 K e concentrazione di sale = 200 mM45. Di conseguenza, simuliamo entrambi i modelli AMBER e 3SPN.2 in condizioni di corrispondenza, a partire da un iniziale iso-II configurazione con un IDA di 43 ° (vedi Fig. 1b). Per entrambi i modelli 3SPN.2 e AMBER, la giunzione si apre ad una IDA più grande e si assesta ad un valore costante dopo ≈50 ns (inset Fig. 8). Il pannello principale della Fig. 8 mostra i valori IDA campionati da ciascun modello nello stato stazionario. Il modello 3SPN.2 mostra fluttuazioni più ampie dell’IDA rispetto al modello AMBER, anche se l’IDA medio è simile nei due modelli. Quantitativamente, per AMBER, l’IDA media è 85,3° con deviazione standard 12,3°; per 3SPN.2, l’IDA media è 95,7° con deviazione standard 24,1°.

Confronto della struttura di giunzione tra modelli all-atom e a grana grossa.

Le IDA per il modello AMBER all-atom (nero) e 3SPN.2 a grana grossa (rosso) a T= 283 K e = 200 mM. Il pannello principale mostra la distribuzione dei valori IDA campionati; le linee solide sono la frequenza calcolata e le linee tratteggiate sono una distribuzione normale con la stessa media e deviazione standard dei dati. Il riquadro mostra la serie temporale originale per ogni modello, da cui sono determinate le distribuzioni. Si noti che per il modello 3SPN.2, abbiamo 2 μs di dati, non tutti i quali sono mostrati nell’inserto.

Le simulazioni entrambi mostrano un IDA sostanzialmente più grande di quanto previsto dalle misure FRET e studi cristallografici45,52. Questo può suggerire che nessuno dei due modelli fornisce una stima accurata dell’IDA, o che le approssimazioni che devono essere fatte per stimare l’IDA dai dati FRET sottostimano l’IDA. Certamente, negli esperimenti FRET di massa la presenza dei coloranti esterni, i loro linker associati e il loro orientamento relativo può introdurre un notevole errore nella determinazione della distanza. Le differenze tra le attuali determinazioni dell’IDA e quelle misurate dalla cristallografia potrebbero forse derivare da alcuni vincoli del reticolo cristallino. Confrontando i modelli all-atom e a grana grossa, il quasi raddoppio della deviazione standard mostra chiaramente che i bracci di giunzione sono più flessibili nel modello a grana grossa. Questo può essere dovuto in parte all’assenza di un solvente esplicito, poiché l’acqua solvante nella rappresentazione all-atom ostacola necessariamente la flessibilità dei bracci di giunzione.