L’approccio abituale allo studio della funzione dei geni è quello di inserire o inattivare il gene in una cellula o in un individuo, e osservare i cambiamenti nel comportamento biologico delle cellule o i fenotipi individuali per identificare la sua funzione.

Quindi lo studio della funzione genica può essere condotto seguendo due tipi di strategie:

• Perdita di funzione

• Ricerca di funzione

Perdita di funzione

Il knockout genico è uno dei metodi più usati per studiare la perdita di funzione nei topi. Il knockout genico si riferisce alla scoperta delle funzioni biologiche dei geni target attraverso lo studio di organismi che portano i geni target inattivati (knocked out). Questa tecnica richiede l’introduzione di modifiche nelle sequenze parziali dei geni bersaglio, che disattivano le funzioni dei geni specifici e quindi inattivano in parte o in tutto la funzione del gene bersaglio. Il knockout genico può essere ulteriormente suddiviso in knockout genico convenzionale e knockout genico condizionale.

Conventional Gene Knockout

• Conventional Knockout (abbreviazione: KO) si riferisce al knockout di alcuni esoni vitali, domini funzionali del gene target, o anche di tutti gli esoni, in tutte le cellule del topo, con conseguente perdita di espressione del gene target.

• I topi KO portano le sequenze del gene bersaglio ingegnerizzato in tutti i tessuti e le cellule. I geni bersaglio non sono espressi nei topi omozigoti

• I topiKO sono generalmente utilizzati per studiare gli effetti dei geni bersaglio o le funzioni delle proteine sulla fisiologia o la patologia.

Conditional Gene knockout

• Conditional Knockout (abbreviazione: CKO) è l’ingegneria temporale e spaziale-specifica del genoma del topo limitando l’ingegneria genica ad alcuni tipi specifici di cellule nel topo o ad uno specifico stadio di sviluppo

• Il gene targeting è usato nei topi CKO per affiancare uno o più esoni importanti del gene target con siti loxP. L’espressione del gene target era normale prima dell’incrocio con il ceppo che esprime la ricombinasi Cre. Quando si incrocia con topi transgenici che esprimono la ricombinasi Cre, il gene bersaglio può essere eliminato in un tessuto o tipo di cellula specifico, e la sua espressione rimarrà normale in altri tessuti o tipi di cellule.

• I topi CKO sono generalmente utilizzati per studiare i geni che causano letalità embrionale, le funzioni dei geni o delle proteine target in un particolare tessuto o tipo di cellula, o il ruolo dei geni o delle proteine target in un particolare periodo o stadio.

Caso: Applicazione dei modelli di topo Drd2 KO e Drd2 CKO nella ricerca sulla risposta immunitaria del cervello

Gain of function

Lo studio della funzione genica osservando i cambiamenti nei tratti biologici della cellula o dell’individuo, in cui il gene target era stato introdotto per generare nuovi o maggiori livelli di espressione.

Trasgene casuale

La transgenesi a inserimento casuale è l’integrazione casuale di un gene esogeno nel genoma del topo per generare modelli di topo con sovraespressione del gene target. Viene utilizzata per studiare l’impatto della sovraespressione del gene target sulla fisiologia e la patologia.

La sovraespressione del gene target

La sequenza di DNA esogeno è espressa in modo stabile nei topi dopo essere stata bussata nel locus del gene Gt (ROSA) 26Sor del topo noto anche come Rosa26. L’espressione del gene esogeno può anche essere tessuto-specifica o indotta da farmaci.

• Utile per esperimenti di sovraespressione sulla funzione di geni e proteine

• Può essere usato per esperimenti di salvataggio per fenotipi KO

Gene knock-in

Knock-in (abbreviazione: KI) si riferisce all’introduzione di mutazioni specifiche o sequenze di DNA esogene nel sito del gene bersaglio.

(1) Introduzione di una mutazione di base nel gene bersaglio per imitare un modello di malattia genetica umana.

(2) Introduzione di un gene reporter, come EGFP, RFP, mCherry, YFP, LacZ, e Luciferasi, nel gene endogeno murino per osservare il modello di espressione del gene bersaglio.