Isolamento batterico e identificazione RdFucI

Una colonia che è cresciuta nel mezzo contenente l-fucoidano proveniente da Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) come unica fonte di carbonio è stata isolata da un intestino di abalone raccolto in Corea del Sud (file aggiuntivo 1: Fig. S1). Il confronto dell’identità di sequenza basata sull’RNA ribosomiale 16S con il database NCBI ha rivelato che l’isolato era filogeneticamente vicino ai membri del genere Raoultella (file aggiuntivo 1: Fig. S1). Pertanto, il ceppo isolato è stato identificato come Raoultella sp. KDH14. Dopo aver eseguito il sequenziamento del genoma completo, RdFucI è stato identificato da Raoultella sp. KDH14 sulla base dell’identità di sequenza del gene.

RdFucI è composto da 595 aminoacidi con una massa molecolare di 65,5 kDa e un punto isoelettrico di 5,5. I risultati del basic local alignment search tool (BLAST) hanno indicato l’alta identità di sequenza di RdFucI (> 90%) con altri l-FucI da vari batteri appartenenti alle famiglie Raoultella, Klebsiella e Citrobacter.

Il RdFucI identificato è stato sovrapprodotto in E. coli BL21(DE3) con il tag N-terminale hexa-histidine e purificato mediante cromatografia di affinità his-tag. Quando analizzato da sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE), la singola banda è apparso intorno a 65 kDa, coerente con la massa molecolare calcolata della subunità monomero.

RdFucI-catalizzata reazione favorisce la formazione di l-fucosio

Per esaminare l’attività isomerasi di RdFucI, la reazione enzimatica è stata eseguita con l-fucosio o l-fuculosa come substrato (Fig. 2). Le attività enzimatiche per le reazioni in avanti (da l-fucosio a l-fuculosio) e inversa (da l-fuculosio a l-fucosio) sono state determinate. La produzione di l-fuculosio da l-fucosio è stata confermata dalla cromatografia su strato sottile (TLC) e dall’analisi della gascromatografia/spettrometria di massa (GC/MS) (Additional file 2: Fig. S2). Nell’interconversione tra l-fucosio e l-fuculosio, non è stato osservato alcun prodotto laterale, il che significa che un substrato produce un prodotto (file aggiuntivo 2: Fig. S2). Pertanto, riteniamo ragionevole utilizzare la quantità calcolata di concentrazione di l-fuculosio misurando sperimentalmente la quantità di l-fucosio.

Conversione enzimatica di a l-fucosio a l-fuculosio (reazione in avanti) e b l-fuculosio a l-fucosio (reazione indietro) da RdFucI. Reazione enzimatica è stata eseguita da 3 µg di RdFucI con a l-fucosio o b l-fuculosio a 10 mM come substrato di partenza a 30 ° C per 10 min in 20 mM di sodio fosfato (pH 7,0) in presenza di 1 mM di Mn2 +. l-Fucosio concentrazione è stata misurata sperimentalmente e l-fuculosio concentrazione è stata calcolata sottraendo sperimentalmente determinato l-fucosio concentrazione dalla concentrazione totale di zucchero (10 mM). I dati sperimentali rappresentano le medie ± deviazioni standard di tre repliche

La reazione inversa era 6,6 volte più veloce della reazione in avanti, e l’attività specifica per l-fuculosio (63,9 U/mg) era superiore a quella per l-fucosio (9,6 U/mg). In entrambe le reazioni, il rapporto di equilibrio tra l-fucosio e l-fuculosio, che è stato determinato sperimentalmente, era circa 9:1, dando così la costante di equilibrio (Keq) di 0,11. Il valore di Keq è stato anche determinato teoricamente come 0,23, sulla base della relazione termodinamica della variazione standard dell’energia libera di Gibbs di reazione e Keq all’equilibrio, \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{text{eq}}}, dove R e T rappresentano la costante del gas (8,314 J/mol K) e la temperatura (K), rispettivamente. \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ }}) rappresenta la variazione standard dell’energia libera di Gibbs per la reazione di l-fucosio a l-fuculosio (0.859993 kcal/mol), che è elencata nel database BioCyc (https://biocyc.org). C’era qualche discrepanza tra i valori sperimentali e teorici di Keq. Un Keq < 1 indica che la reazione inversa è favorita. L’isomerizzazione catalizzata da RdFucI ha favorito la reazione inversa, producendo l-fucosio da l-fuculosio con circa il 90% di resa a 30 °C e pH 7.

Effetto della temperatura e del pH sull’attività di RdFucI e sull’equilibrio

Le reazioni enzimatiche sono state eseguite a varie temperature da 10 a 80 °C e con pH da 4 a 11 usando l-fuculosio come substrato (Fig. 3). L’isomerizzazione di l-fuculosio a l-fucosio da RdFucI era altamente dipendente dalla temperatura, e le attività massime o quasi massime (> 80% del massimo) sono state esposte a temperature che vanno da 30 a 50 °C (Fig. 3a). Per studiare l’effetto della temperatura sull’equilibrio per l’isomerizzazione da l-fucosio a l-fuculosio, il rapporto di equilibrio è stato studiato a 30, 40 e 50 °C a cui sono state mostrate attività massime o quasi massime (> 80% del massimo). Come risultato, non c’era alcuna differenza significativa nel rapporto di equilibrio tra le tre temperature (l-fucosio/l-fuculosio = 9:1; p > 0,05). In altre parole, l-fucosio è stato sintetizzato da l-fuculosio con una resa di circa il 90% a tutte le temperature testate (Additional file 3: Fig. S3a).

Effetto di a temperatura e b pH sull’attività relativa di RdFucI contro l-fuculosio. Le reazioni enzimatiche sono state eseguite a a varie temperature che vanno da 10 a 80 °C e b a vari pH che vanno da 4 a 11. I buffer utilizzati erano 50 mM acetato di sodio (pH 4, 5 e 6), 50 mM fosfato di sodio (pH 6, 7 e 8), 50 mM Tris-HCl (pH 7, 8 e 9) e 50 mM glicina-NaOH (9, 10 e 11). I dati sperimentali rappresentano le medie ± deviazioni standard di tre replicati

L’effetto del pH è stato studiato. Attività elevate di RdFucI (> 70% del massimo) sono state osservate a pH alcalini e quasi neutri (pH 9, 10 e 11 e pH 6, 7 e 8). Al di sotto di pH 6, l’attività dell’enzima è diminuita bruscamente, con poca attività osservata a pH 4. Nonostante le alte attività specifiche in condizioni alcaline, la resa di l-fucosio all’equilibrio (60 minuti di incubazione) era molto più bassa a pH 10 (54%) che a pH 7 (88%) (Additional file 3: Fig. S3b). Le attività relative a pH 7, 8 e 9 erano molto più basse nel tampone Tris-HCl rispetto alle attività nel tampone acetato di sodio o glicina-NaOH, il che implica che Tris ha fortemente inibito l’attività enzimatica di RdFucI. I precedenti esperimenti enzimatici in questo studio sono stati eseguiti in miscele di reazione contenenti Tris a 1 mM, che proveniva dalla fase di cambio del tampone dopo la purificazione dell’enzima. Per esaminare se Tris nella miscela di reazione potrebbe inibire RdFucI, attività di isomerizzazione dalle reazioni che si verificano in assenza e in presenza di 1 mM Tris sono stati confrontati (Additional file 4: Fig. S4). Nessuna differenza significativa è stata evidente nelle attività enzimatiche delle due reazioni, indicando che 1 mM Tris non ha inibito l’attività di RdFucI.

Effetto degli ioni metallici sull’attività di RdFucI

Le isomerasi dello zucchero, comprese le isomerasi di l-fucosio, richiedono cationi divalenti, come Mn2+ e Co2+, come cofattori per le loro attività di isomerizzazione. Per studiare l’effetto dei cationi divalenti sull’attività catalitica di RdFucI su l-fuculosio, l’attività dell’enzima è stata valutata in assenza e in presenza di 1 mM di vari ioni metallici o acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (Tabella 1). L’enzima nativo RdFucI non esposto a ioni metallici o EDTA visualizzato bassa attività, e chelazione del metallo da EDTA ridotto l’attività dell’enzima. Tra gli ioni metallici testati, Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ e Zn2+ hanno portato ad un aumento pronunciato dell’attività enzimatica. In particolare, l’aggiunta di Mn2+ ha aumentato al massimo l’attività di RdFucI di circa 7,4 volte. Al contrario, Ca2+, Cu2+ e Fe3+ hanno piuttosto inibito l’attività di RdFucI.

Specificità del substrato e parametri cinetici di RdFucI

In generale, le isomerasi di zucchero e fosfato di zucchero mostrano un’ampia specificità verso vari substrati. Per valutare se l’attività chetoso-favorente di RdFucI mostrata con l-fuculosio era evidente anche con altri substrati, la specificità del substrato di RdFucI è stata studiata contro vari zuccheri aldosi (l-fucosio, d-arabinosio, d-altrosio, d-galattosio, d-mannosio e d-glucosio) e i loro corrispondenti zuccheri chetosi (l-fuculosio, d-ribulosio, d-psicosio, d-tagatosio e d-fruttosio) (Fig. 4). Tra tutti questi substrati, compresi gli zuccheri aldosi e chetosi, le attività più alte sono state osservate con l-fuculosio (115,3 U/mg) e d-ribulosio (127,3 U/mg), che sono entrambi zuccheri chetosi. Le attività di RdFucI per l-fuculosio e d-ribulosio erano molto più alte di quelle per gli altri substrati. Tra gli zuccheri aldosi, l’attività per l-fucosio era la più alta (21,0 U/mg), con gli altri substrati che producevano attività specifiche che andavano da 4,7 a 7,9 U/mg. Gli zuccheri chetosio diversi da l-fuculosio e d-ribulosio hanno mostrato attività specifiche da 0,0 a 10,8 U/mg. Quindi, l-fuculosio e d-ribulosio erano i substrati preferiti per RdFucI e l’attività chetoso-favorente di RdFucI è stata mostrata solo con l-fuculosio e d-ribulosio.

Substrato specifico di RdFucI. Le reazioni enzimatiche sono state eseguite contro 10 mM di vari substrati aldosi e chetosi a 40 °C e pH 10. Per i substrati aldosi, sono stati utilizzati l-fucosio, d-arabinosio, d-altrosio, d-galattosio, d-mannosio e d-glucosio. Per i substrati chetosio, l-fuculosio, d-ribulosio, d-psicosio, d-tagatosio, e d-fruttosio sono stati utilizzati. I dati sperimentali rappresentano le medie ± deviazioni standard di tre replicati

I parametri cinetici sono stati determinati utilizzando l-fuculosio e d-ribulosio come substrati (file aggiuntivo 5: Tabella S1). I valori di Km (costante di Michaelis) e kcat (numero di turnover del substrato) per l-fuculosio erano 1,9- e 1,2 volte inferiori, rispettivamente, a quelli per d-ribulosio. L’efficienza catalitica di RdFucI, rappresentata come kcat/Km, per l-fuculosio, era 1,5 volte superiore a quella del d-ribulosio, indicando che l-fuculosio è preferito come substrato di RdFucI.

Struttura di cristallo complessiva di RdFucI

Per comprendere meglio la funzione molecolare, abbiamo determinato la struttura di cristallo di RdFucI (file aggiuntivo 6: Tabella S2). La mappa di densità elettronica di RdFucI era ben definita dai residui Ser5-Arg591 per sei subunità nell’unità asimmetrica. Il monomero RdFucI è costituito da 19 α-eliche e 23 β-fila che comprende N1, N2, e domini C (Fig. 5a). Il dominio N1 (Ser5-Met172) adotta una piega α/β ed è coinvolto nel riconoscimento del substrato nella formazione esamerica di RdFucI. I domini N2 (Lys173-Leu352) e C (Thr353-Arg591) contengono i residui di legame al metallo coinvolti nell’attività catalitica (Fig. 5a). Nell’unità asimmetrica, le subunità RdFucI formano la formazione esamerica disposta come un dimero di trimeri con pseudosimmetria D3h (Fig. 5b). Questo è coerente con il risultato della cromatografia analitica di esclusione dimensionale in cui RdFucI si è rivelato esistere come un omoesamero in soluzione (Additional file 7: Fig. S5).

Struttura complessiva di RdFucI. a Rappresentazione cartografica del monomero RdFucI. Il monomero RdFucI è composto dai domini N1- (giallo), N2- (rosa), e C- (verde). b Rappresentazione superficiale dell’esomero RdFucI. Le subunità A, B, C, D, E e F sono colorate rispettivamente in giallo, rosa, ciano, viola, verde e arancione. Un sito di legame metallico su una tasca di legame del substrato è indicato da un punto rosso

Nella formazione esamerica, la subunità A (superficie totale: 23011.7 Å2) interagisce con quattro diverse subunità B (residui nell’interfaccia: 47/superficie totale: 1909.6 Å2), C (58/1837.6 Å2), D (42/1482.9 Å2), ed E (34/1086.2 Å2). La subunità A non interagisce con la restante subunità F (Fig. 5b). La subunità A di RdFucI ha una superficie totale sepolta di 2569,1 Å2, che rappresenta il 27,45% della superficie totale. Questa interfaccia sepolta è stabilizzata dall’interazione che coinvolge 59 legami idrogeno e 26 ponti di sale da altre subunità (file aggiuntivo 8: Tabella S3, file aggiuntivo 9: Tabella S4, file aggiuntivo 10: Tabella S5, file aggiuntivo 11: Tabella S6).

Sito di legame del substrato e sito attivo di RdFucI

La tasca di legame del substrato è formata dai domini N2 e C della subunità A e dal dominio N1 della subunità B (Fig. 6a-c) e ha un totale di sei siti di legame del substrato nel RdFucI omoesamerico. L’ingresso della tasca di legame del substrato, dove il substrato si avvicina, è di circa 11 × 12,5 Å (Fig. 6a). La tasca di legame del substrato, dove si forma il sito di legame del metallo, ha una superficie negativamente carica di circa 4 × 5 Å (Fig. 6b). La distanza tra il sito di legame del metallo e la superficie della tasca di legame del substrato è di circa 16,7 Å (Fig. 6d), il che implica che il centro attivo si trova in profondità in una tasca. Questo indica che sia la catena aperta che la forma ad anello del substrato sono accessibili al centro del sito attivo e che, al contrario, un saccaride bulk non sarebbe accessibile al sito attivo esistente all’interno della tasca di legame del substrato.

Tasca di legame del substrato e sito attivo di RdFucI. a La tasca di legame del substrato è formata dal montaggio delle subunità A e C. b Superficie elettrostatica della tasca di legame del substrato. c Presentazione del fattore B della superficie di legame del substrato. d Vista superficiale sezionale della tasca di legame del substrato. e La mappa di densità elettronica 2Fo-F (maglia grigia, contornata a 1,0 σ) sui siti di legame del metallo di RdFucI immersi in una soluzione contenente 10 mM Mn2+. f Analisi geometrica dei siti di legame al Mn2+ di RdFucI

RdFucI richiede ioni metallici divalenti per la sua attività catalitica per la reazione di isomerizzazione utilizzando il meccanismo ene-diolo. Il sito di legame metallico di RdFucI dovrebbe essere coordinato con Mn2+ da conservati Glu337, Asp359, e His528 residui (file aggiuntivo 12: Fig. S6). Tuttavia, non c’è una mappa di densità di elettroni Fo-Fc (contati a > 5σ) che si sospetta essere legato a Mn2+ come un metallo essenziale per il legame del substrato (Additional file 13: Fig. S7a). L’analisi del fattore B ha rivelato che il fattore di temperatura di Mn2+ (70,53 Å2) è superiore al fattore di temperatura medio della proteina (36.22 Å2), indicando che Mn2+ è presente su RdFucI con una bassa occupazione. La scoperta è coerente con il risultato dell’analisi biochimica in cui l’enzima nativo ha mostrato un basso livello di attività. D’altra parte, l’aggiunta di Mn2+ ha aumentato sostanzialmente l’attività catalitica di RdFucI (Tabella 1). Così, abbiamo ipotizzato che l’aggiunta di Mn2+ al cristallo RdFucI avrebbe aumentato l’occupazione vincolante di Mn2+. Dopo ammollo RdFucI cristalli in una soluzione di 10 mM Mn2 +, affidabile Fo-Fc densità di elettroni (> 6σ) sul sito di legame del metallo è stato osservato dove la posizione di Mn2 + è stato chiarito in tutte le subunità (Fig. 6e e file aggiuntivo 13: Fig. S7b). Tuttavia, la temperatura B-fattore del Mn2 + (76,56 Å2) era superiore a quella della proteina intera (60,69 Å2), implicando che lo ione Mn2 + non è ancora completamente occupato nel sito di legame del metallo. Mn2 + è stato coordinato da OE1 (distanza media: 2.62 Å) e OE2 (2.65 Å) atomi di Glu337, OD1 (2.72 Å) e OD2 (2.72 Å) atomi di Asp361, NE2 (2.52 Å) atomo di His528, e la molecola di acqua (2.79 Å) (Fig. 6e). Gli angoli di legame medio di Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2), e Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) erano 127.32°, 86.25°, e 73.96°, rispettivamente. L’angolo di legame tra i ligandi e Mn2+ ha mostrato una coordinazione ottaedrica distorta.

Confronto strutturale con altri l-FucIs

Il server DALI è stato usato per cercare omologhi strutturali. Questa ricerca ha rivelato che RdFucI è simile alle l-FucI di E. coli (EcFucI, codice PDB 1FUI, Z score: 60.6, rmsd: 0.3 per 587 atomi di Cαs), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, Z score: 56.6, rmsd: 0.7 per 580 atomi di Cαs), e Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, punteggio Z: 55.9, rmsd: 0.7 per 585 atomi di Cαs). La sovrapposizione della tasca di legame del substrato ha mostrato che i residui di legame al metallo Glu337, Asp361, e His528 (numerati in RdFucI) sono posizionalmente identici alle altre proteine, mentre i residui di riconoscimento del substrato (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496, e Asn524) hanno una leggera differenza conformazionale nelle loro catene laterali (Fig. 7a). In particolare, il ciclo α7-α8 di ogni l-FucI, che si trova sulla superficie della tasca di legame del substrato, ha una conformazione diversa. L’allineamento delle sequenze di l-FucI ha mostrato un’alta somiglianza, ma la sequenza del ciclo α7-α8 di ogni l-FucI era altamente variabile (Fig. 7b). Poiché il ciclo α7-α8 è coinvolto nella formazione dell’architettura della tasca di legame del substrato, ogni l-FucI forma una tasca di legame del substrato unica (Fig. 7c). l-FucIs comunemente hanno una superficie carica negativamente intorno al sito di legame del metallo, ma la superficie della tasca di legame del substrato mostra diversi stati di carica (Fig. 7c). Di conseguenza, le differenze strutturali dei cicli α7-α8 causeranno differenze nella specificità del substrato delle l-FucI.

Confronto strutturale di RdFucI con altre l-FucI. Sovrapposizione di a sito attivo e b superficie di legame del substrato di RdFucI con EcFucI (codice PDB: 1FUI), ApFucI (3A9R) e SpFucI (4C20). Vista ravvicinata della grande differenza conformazionale dei loop α8-α9 da l-FucIs (a sinistra). c Allineamento parziale della sequenza per la regione del loop α8-α9 per RdFucI e EcFucI, ApFucI e SpFucI. d Rappresentazione elettrostatica della superficie di RdFucI, EcFucI, ApFucI e SpFucI. La tasca profonda di legame del substrato e le regioni di loop α8-α9 sono indicate da linee arancioni e nere, rispettivamente. Un sito di legame metallico è indicato da un asterisco giallo