Scoperta di triterpenoidi di Ganoderma lucidum come potenziali inibitori della proteasi NS2B-NS3 del virus della dengue

S2B-NS3
Selezione virtuale e analisi di simulazione del docking
Interazione molecolare e analisi MM/GBSA
Analisi della dinamica molecolare (MD)

S2B-NS3

I dati sulla struttura tridimensionale (3D) della proteina bersaglio sono stati stabiliti come un requisito primario per la scoperta di farmaci. Sia le strutture cristallografiche a raggi X che i modelli omologici generati per le proteine bersaglio sono stati utilizzati per identificare potenziali ligandi dai database chimici, ma è stato documentato che le strutture cristallografiche 3D sono più efficaci dei modelli omologici generati in silico. Pertanto, la struttura 3D della proteasi NS2B-NS3 del DENV, che è stata proposta come un importante bersaglio terapeutico contro l’infezione da DENV, è stata recuperata dalla banca dati delle proteine (PDB) con PDB ID:2FOM40. La struttura cristallina di NS2B-NS3pro è stata risolta alla risoluzione di 1,5 Å e mostrava due catene proteiche, cioè la catena A piegata per formare il cofattore NS2B e la catena B che comprende il dominio NS3pro (Fig. 2a). Qui, il dominio della proteasi (NS3pro) nella catena B (Fig. 2b) è stato selezionato per lo screening virtuale basato sulla struttura con triterpenoidi selezionati da G. lucidum.

Selezione virtuale e analisi di simulazione del docking

Di recente, lo screening virtuale basato sulla struttura ha guadagnato popolarità per la scoperta di nuovi composti principali da grandi librerie chimiche bioattive contro obiettivi selezionati. Questo approccio comprende docking simulato di ligandi nella regione del sito attivo del recettore selezionato, seguita da classifica e punteggio di inibitori23. In questo lavoro, abbiamo condotto struttura basata screening virtuale di 22 triterpenoidi antivirali noti da G. lucidum contro NS3pro utilizzando il modulo Glide della suite Schrodinger (tabella S1). Questi inibitori sono stati ulteriormente analizzati dal protocollo di docking XP del modulo Glide per raccogliere informazioni sull’energia di legame, nonché ulteriori modelli di legame con i residui del sito attivo. È stato osservato che tutti i triterpenoidi selezionati hanno mostrato affinità di legame significative verso NS2B-NS3pro tranne l’acido Ganoderico G (Tabella S1). Inoltre, il docking molecolare dell’inibitore di riferimento 1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinone contro lo stesso sito attivo ha prodotto un punteggio di docking di -5,377 kcal/mol. Pertanto, i triterpenoidi con punteggi di docking migliori di una soglia di -5 kcal/mol sono stati selezionati per l’analisi dell’interazione molecolare. Abbiamo selezionato un totale di quattro triterpenoidi, cioè Ganodermanontriol (-6,291 kcal/mol), Lucidumol A (-5,993 kcal/mol), Ganoderic acid C2 (-5,948 kcal/mol) e Ganosporeric acid A (-5,830 kcal/mol) come possibili inibitori del dominio NS3pro della proteasi DENV. Questi punteggi di docking sono stati considerati significativi rispetto all’inibitore noto 1,8-Diidrossi-4,5-dinitroantrachinone (-5,377 kcal/mol) e alle molecole bioattive riportate Nimbin (-5,56 kcal/mol), Desacetylnimbin (-5,24 kcal/mol) e Desacetylsalannin (-3,43 kcal/mol) da Azadirachta indica con DENV NS3pro41. Questi risultati indicano il potenziale dei triterpenoidi bioattivi da G. lucidum come inibitori della proteasi di DENV e suggerisce che potrebbero essere usati nello sviluppo di farmaci antivirali per l’infezione da DENV.

Interazione molecolare e analisi MM/GBSA

Perché i contatti molecolari nei complessi docked proteina-ligando possono portare a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari nei sistemi biologici42, è stato studiato anche il profilo del contatto molecolare per i triterpenoidi selezionati e l’inibitore di riferimento con la proteasi di DENV. Il complesso NS3pro-Ganodermanontriol ha esibito interazione da legami idrogeno singoli e doppi moderati nella regione attiva con Lys73 (3 Å), Thr120 (2,94 Å) e Asn167 (3,26 Å, 2,86 Å) residui, rispettivamente. Ulteriori attrazioni idrofobiche sono state registrate anche all’interno del complesso NS3pro-Ganodermanontriol ai residui Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 e Ala164. Inoltre, i residui His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167 e Gly153 hanno mostrato interazioni polari e glicine, rispettivamente con Ganodermanontriol. Nel frattempo, interazioni di carica positiva (Lys73 e Lys74) e negativa (Asp75) con i residui sono stati registrati anche nel complesso NS3pro-Ganodermanontriol docked (Fig. 3a,b).

I profili di interazione di NS3pro-Lucidumol A riflettevano due legami a idrogeno singoli formati con i residui Asp75 (3,31 Å) e Asn152 (2,48 Å) e la formazione di doppi legami a idrogeno a Gly153 (2,11 Å, 2,84 Å), che contribuisce anche a una interazione glicina con residuo Gly151. Inoltre, interazioni idrofobiche (Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 e Tyr161) e polari (His51, Ser135 e Asn152) sono state registrate nel complesso agganciato. Asp75 mostra interazioni di carica negativa nella tasca attiva della proteasi con Lucidumol A (Fig. 3c,d). Inoltre, l’acido ganoderico C2 agganciato con NS3pro ha mostrato una moderata formazione di doppi legami a idrogeno con Gly151 (2,73 Å, 3,12 Å) mentre la formazione di un singolo legame a idrogeno è stata osservata ai residui Trp50 (2,66 Å) e Arg54 (1,93 Å). Inoltre, la formazione di un ponte salino tra il gruppo idrossile dell’acido Ganoderico C2 e il residuo Arg54 della proteasi è stata anche registrata in questo complesso. Inoltre, le interazioni polari (residui His51 e Asn152), negative (residuo Asp75) e positive (residuo Arg54) sono state registrate anche nel NS3pro-Ganoderic acid C2 docked (Fig. 3e,f). Il complesso agganciato dell’acido NS3pro-Ganosporico A ha mostrato tre legami idrogeno singoli formati ai residui Thr120, Asn152 e Asn167, mentre Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 e Ala164 sono stati contrassegnati come espositori di interazioni idrofobiche (Fig. 3g,h). Inoltre, l’NS3pro agganciato con l’acido ganosporico A ha mostrato interazioni polari (residui Thr118,Asn119,Thr120, Asn152 e Asn167), positive (Lys73 e Lys74) e di carica negativa (Asp75).

Inoltre, un inibitore di riferimento, 1,8-Diidrossi-4,5-dinitroantrachinone, è stato agganciato al sito attivo della proteasi NS3pro e sono state registrate interazioni significative. Questo complesso mostra la formazione di un singolo legame a idrogeno al residuo Phe130, mentre His51 è stato notato per il ponte salino e l’interazione pi-pi con l’inibitore. Inoltre, le interazioni idrofobiche (Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 e Tyr151), polari (His51, Ser131 e Ser135) e glicine (Gly151 e Gly153) sono state segnate nel complesso agganciato.

Si è concluso che tutti i triterpenoidi esaminati hanno mostrato un legame a idrogeno con NS3pro nella triade catalitica (residui His51, Asp75 e Ser135), insieme ad alcuni altri residui conservati (Phe130, Tyr150, Asn152 e Gly153) che sono stati riportati per svolgere un ruolo significativo nel legame del substrato per la proteasi DENV43,44. Inoltre, alcuni residui aggiuntivi sono stati anche registrati per la condivisione di legami a idrogeno con diversi ligandi. Queste osservazioni suggeriscono che i legami a idrogeno tra un ligando e uno dei residui della triade catalitica di NS3pro possono disturbare il trasferimento di elettroni tra i gruppi carbossile e imidazolo dei residui Asp75 e His51, rispettivamente. Tale disturbo è stato segnalato per portare a un attacco nucleofilo abortivo del gruppo idrossile (ß-OH) del residuo Ser135, che è essenziale per iniziare l’attività proteolitica43,44. Quindi, è stato concluso che i triterpenoidi selezionati possono mostrare una forte affinità verso il dominio NS3pro di DENV attraverso varie interazioni intermolecolari e suggerito che potrebbero agire come farmaci contro l’infezione da DENV attraverso l’inibizione NS2B-NS3pro.

Inoltre, i complessi docked di tutti e quattro i triterpenoidi, Ganodermanontriol, Lucidumol A, Ganoderic acid C2 e Ganosporeric acid A con DENV NS3pro sono stati anche analizzati usando calcoli MM/GBSA per calcolare le affinità di legame dei rispettivi ligandi al sito attivo. Questi calcoli hanno mostrato valori MM/GBSA relativamente negativi per tutti e quattro i complessi agganciati, cioè NS3pro-Ganodermanontriol (-24,465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19,735 kcal/mol), NS3pro-Acido Ganoderico C2 (-19.039 kcal/mol) e NS3pro-Ganosporeric acid A (-11,449 kcal/mol), mentre il complesso inibitore di riferimento NS3pro-1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinone ha prodotto un valore maggiore (-38,934 kcal/mol). Queste osservazioni suggeriscono che l’attività di inibizione dei triterpenoidi selezionati contro NS3pro potrebbe essere più debole rispetto all’inibitore di riferimento, ma hanno anche suggerito la più forte affinità di legame di Ganodermanontriol con NS3pro rispetto agli altri triterpenoidi è stata supportata dai punteggi di docking previsti. Inoltre, i valori ΔG previsti e le componenti fisico-chimiche, cioè ΔGBind Coulomb, ΔGBind covalente, ΔGBind vdW (forze di van der Waals), ΔGBind Solv SA (superficie accessibile al solvente) e ΔGBind Solv GB (energia di solvatazione generalizzata Born) per i triterpenoidi selezionati e il controllo positivo complessati con la proteina DENV NS3pro indicano che, a seconda del ligando, il ΔGBind Coulomb e/o il ΔGBind vdW hanno contribuito maggiormente alla stabilità dei complessi dei triterpenoidi e degli inibitori di riferimento con la proteina DENV NS3pro. (Figg. 4, S2, Tabella S2). Quindi, il Ganodermanontriol è stato concluso come il triterpenoide funzionale più promettente per la proteina DENV NS3pro, e ulteriormente analizzato insieme agli altri triterpenoidi usando la dinamica molecolare e l’analisi in vitro.

Analisi della dinamica molecolare (MD)

Le informazioni di interazione previste da su target-ligando calcolate usando l’approccio di docking molecolare possono essere ulteriormente convalidate dalla simulazione di dinamica molecolare e dagli studi cristallografici38,41. Qui, la stabilità dei complessi selezionati triterpenoid-NS3pro dominio è stato valutato utilizzando 10 ns simulazione MD in termini di deviazione quadratica media (RMSD), radice media fluttuazione quadrata (RMSF) e proteina-ligando contatto mappa analisi.

L’analisi RMSD di C-alfa e atomi di spina dorsale in DENV NS3pro complessato con tutti e quattro ligandi ha mostrato deviazioni stabili e accettabile durante la simulazione MD 10 ns (Fig. 5). È interessante notare che la fluttuazione finale per il recettore è stata registrata come <2 Å RMSD mentre l’inibitore Ganodermanontriol ha mostrato una variazione stabile e massima di 6 Å in complesso con il dominio NS3pro alla fine dell’intervallo di simulazione (Fig. 5a). Inoltre, l’RMSF calcolato sia per i singoli residui del recettore che per gli atomi del ligando ha mostrato variazioni tollerabili (meno di 2,8 Å) durante l’intervallo di simulazione (Figg. S3a, S4a). Tuttavia, fluttuazioni RMSF insignificanti sono stati osservati anche durante un intervallo di tempo di 5 a 7 ns nei gruppi cheto e metile dell’anello ciclopenta-fenantren-7-one del ligando (Fig. S3a).

Similmente, l’analisi RMSD per il complesso NS3pro-Lucidumolo A ha rivelato che sia il recettore che il ligando hanno posto variazioni inferiori a 3 Å durante l’intervallo di simulazione 10 ns (Fig. 5b). Nel frattempo, l’analisi RMSF sia per NS3pro e Lucidumol A previsto variazioni < 3 Å, una deviazione accettabile sono stati registrati anche nel metile e gruppo idrossile nella regione eptano del ligando durante i 10 ns intervallo di simulazione (Fig. S3b). Allo stesso modo, il ligando nel complesso NS3pro-Ganoderic acido C2 ha mostrato deviazioni accettabili durante iniziale 2-5 ns seguita da stabilità e deviazione finale è stato registrato a meno di 8 Å durante l’intervallo di simulazione 10 ns (Fig. S4b).

Il complesso NS3pro-Ganoderic acido C2 anche esposto deviazioni insignificanti nel recettore tra 2-5 ns seguita da stabilità con variazione finale registrato a meno di 1,75 Å durante l’intervallo di simulazione (Fig. 5c). Queste deviazioni accettabili nel ligando (meno di 6 Å) e recettore (3 Å) sono stati supportati anche dal RMSF calcolato per il rispettivo complesso (Figs. S3c, S4c).

Inoltre, l’analisi di simulazione del ligando nell’acido NS3pro-Ganosporeric A complesso docked esposto inizialmente bassa deviazione per 6 ns nel gruppo carbossilico situato a eptano moiety di ligando iniziale seguita da acquisire uno stato stabile a 4,6 Å RMSD fino alla fine del 10 ns intervallo (Fig. 5d). Nel frattempo, NS3pro visualizzato oscillazioni stabili intorno 1.6 Å RMSD con deviazioni insignificanti nella regione terminale N iniziale (Fig. 5d). Queste osservazioni hanno suggerito la stabilità del rispettivo complesso agganciato come supportato dalle curve RMSF per i singoli residui (meno di 3,5 Å) e atomi (3 Å) del recettore e ligando, rispettivamente (Figg. S3d, S4d).

Una mappa di interazione proteina-ligando che descrive il contributo dei singoli residui al legame intermolecolare è stato generato anche dalle curve traiettoria di simulazione (Fig. 6). La mappa di interazione proteina-ligando per il complesso NS3pro-Ganodermanontriol ha mostrato la partecipazione di Met49, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu76, Trp83, Glu88, Thr118, Thr120, Ile123, Val147, Leu149, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Ala164, Ile165, Ala166 e Asn167 residui, formando legami idrogeno, attrazioni idrofobiche, interazioni ioniche e ponti d’acqua (Fig. 6a). Leu149 e Asn152 residui sono stati evidenziati per contribuire ponti d’acqua prominente e attrazioni legame a idrogeno durante l’intervallo di simulazione 10 ns (Fig. 6a). Il residuo Asn152 è stato anche previsto per formare legami a idrogeno nel complesso di docking (Fig. 3a,b), suggerendo l’importanza di questo residuo in NS3pro per l’interazione con Ganodermanontriol.

La mappa di interazione NS3pro-Lucidumolo A ha mostrato la partecipazione di His51, Arg54, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 e Asn167 in legami a idrogeno, interazioni idrofobiche e ponti d’acqua, con i residui Asp75 e Gly153 per i maggiori contributi in ponti d’acqua e formazione di legami a idrogeno, rispettivamente (Fig. 6b). L’analisi di docking molecolare ha anche suggerito il ruolo di Gly153 nel legame a idrogeno con il ligando (Fig. 3c,d), indicato l’importanza di questo residuo nella stabilità della proteina-ligando. Inoltre, i residui Tyr161, Asp75 e Leu128 sono stati anche indicati per i maggiori contributi in acqua mediata, legame a idrogeno e interazioni idrofobiche, rispettivamente, con questo ligando (Fig. 6b). Questi risultati hanno suggerito che Gly153, Tyr161, Asp75 e Leu128 erano i principali responsabili della conformazione stabile del complesso NS3pro-Lucidumol A durante l’intervallo di simulazione.

Nel frattempo il complesso NS3pro-acido canoderico C2 ha esibito contributi di Lys28, Ile36, Trp50, His51, Arg54, Val72, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Ser131, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val155 e Tyr161 residui in diverse interazioni molecolari nella mappatura proteina-ligando durante la simulazione (Fig. 6c). È interessante notare che l’interazione intermolecolare principale è stata contribuita da Arg54 attraverso la formazione di legami idrogeno seguita da ponti d’acqua e attrazione ionica (Fig. 6c). Questo residuo è stato anche previsto nell’analisi di docking molecolare per formare due legami a idrogeno con l’acido Ganoderico C2 (Fig. 3e,f), suggerendo che è un fattore chiave per mantenere la stabilità target-ligando durante la simulazione.

Similmente, il profilo di interazione NS3pro-acido ganosporico A ha mostrato che Try50, His51, Arg54, Asp71, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Thr118, Asn119, Thr120, Gly121, Thr122, Ile123, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 e Asn167 residui attivamente contribuito a ponti d’acqua, idrofobico e interazioni ioniche (Fig. 6d). Tuttavia, i residui Lys73, Lys74, Val155 e Asn167 sono stati previsti per dare i maggiori contributi alla stabilità di NS3pro complessato con l’acido Ganosporeric A ligando tramite legami idrogeno, seguito da ponti d’acqua, interazioni idrofobiche e ioniche (Fig. 6d). Inoltre, Asn167 è stato contrassegnato per la formazione di legami a idrogeno con l’acido Ganosporico A nel complesso agganciato, rivelando il suo contributo significativo alla stabilità del complesso. Questi risultati hanno convalidato e suggerito la significativa stabilità di ogni triterpenoide con il dominio NS3pro della proteasi DENV nei complessi agganciati. Quindi, è stato nuovamente suggerito che questi triterpenoidi potrebbero essere utilizzati nella formulazione di farmaci contro l’infezione da DENV.

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