Informazioni di base
La trasfezione del DNA per elettroporazione è una tecnica consolidata che è applicabile a forse tutti i tipi di cellule. Produce un’alta frequenza di trasformanti stabili e ha un’alta efficienza di espressione genica transitoria. L’elettroporazione ha ora dimostrato di essere efficace nel fornire DNA plasmidico in vivo a una varietà di tipi di tessuto. L’elettroporazione sfrutta il fatto che la membrana cellulare agisce come un condensatore elettrico che non è in grado di passare la corrente (tranne che attraverso i canali ionici). Sottoporre le membrane a un campo elettrico ad alto voltaggio provoca la loro rottura temporanea e la formazione di pori abbastanza grandi da permettere alle macromolecole (così come alle molecole più piccole come l’ATP) di entrare o uscire dalla cellula. La richiusura dei pori di membrana è un processo di decadimento naturale che è ritardato a 0°C.
Durante il tempo in cui i pori sono aperti, l’acido nucleico può entrare nella cellula e infine nel nucleo. Il DNA lineare con le estremità libere è più ricombinogenico e ha più probabilità di essere integrato nel cromosoma ospite per produrre trasformanti stabili. Il DNA superavvolto è più facilmente impacchettato nella cromatina ed è generalmente più efficace per l’espressione genica transitoria.
L’uso di scosse elettriche ad alto voltaggio per introdurre il DNA nelle cellule fu eseguito per la prima volta da Wong e Neumann usando fibroblasti (Wong e Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). La tecnica è stata poi generalizzata (Potter et al., 1984) a tutti i tipi di cellule, anche quelle come i linfociti che, a differenza dei fibroblasti, non possono essere trasfettate con altre procedure (per esempio Calcio fosfato o DEAE-destrano DNA coprecipitato).
Oliver Smithies e colleghi hanno poi usato l’elettroporazione per introdurre il DNA nelle cellule staminali embrionali (ES) e hanno progettato vettori di targeting che hanno permesso al DNA introdotto di ricombinarsi con regioni omologhe nel genoma e introdurre un gene alterato o una sequenza di disturbo per generare cellule ES con un gene specifico ‘knocked in’ o ‘knocked out’. Le cellule ES alterate sono state poi utilizzate per generare i corrispondenti topi knockin o knockout. L’elettroporazione era necessaria per queste applicazioni di trasferimento genico perché introduce il DNA nelle cellule in una forma nuda che può facilmente partecipare alla ricombinazione omologa. Questa estensione dell’elettroporazione ha portato il Dr. Smithies a condividere il Premio Nobel 2007 per la medicina o la fisiologia. La metodologia per l’elettroporazione delle cellule ES è essenzialmente la stessa delle altre cellule di mammiferi. Se si desidera una sostituzione genica omologa, si devono progettare vettori che permettano uno screening “positivo-negativo” (Bronson e Smithies, 1994; Joyner 2000) in modo che una selezione recuperi tutte le cellule in cui il DNA elettroporato si è inserito nel genoma, e la seconda selezione sia contro i cloni ES in cui il DNA si è inserito in modo casuale. I topi knockin/out possono quindi essere generati fondendo le cellule ES clonate selezionate con embrioni, reimpiantando per permettere lo sviluppo, e allevando le chimere risultanti per generare topi in cui tutte le cellule portano il gene alterato.
Anche se sono state riportate piante intere o tessuti fogliari da trasferire per elettroporazione, le cellule vegetali devono generalmente essere trasformate in protoplasti prima che il DNA possa essere facilmente introdotto in esse (protocollo alternativo; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Come le cellule dei mammiferi, i protoplasti delle piante possono essere elettroporati in una varietà di condizioni elettriche (parametri critici). Sia l’alta tensione con bassa capacità (breve durata dell’impulso) che la bassa tensione con alta capacità (lunga durata dell’impulso) sono state utilizzate per ottenere un trasferimento genico di successo (Chu et al., 1991). L’EP in vivo è stato originariamente utilizzato per consegnare agenti chemioterapici ai tumori solidi ed è progredito dagli studi preclinici fino alle prove cliniche (Gothelf, et al., 2003). La consegna in vivo di DNA plasmidico usando l’elettroporazione è stata riportata per la prima volta nella prima metà degli anni ’90 (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996) ed era un progresso logico basato sul successo delle trasfezioni in vitro con elettroporazione e la dimostrazione che la procedura poteva essere eseguita in sicurezza in vivo quando si consegnavano piccole molecole come gli agenti chemioterapici. L’uso dell’elettroporazione in vivo per la consegna di DNA plasmidico ha visto una crescita enorme nel numero di studi preclinici condotti ed è stato recentemente tradotto nella clinica (Heller, et al., 2006a e Bodles-Brakhop, et al.,2009).
L’ampio uso di elettroporazione è stato reso possibile in gran parte dalla disponibilità di apparecchi commerciali che sono sicuri e facili da usare e che danno risultati estremamente riproducibili. I design di queste macchine variano sostanzialmente, ma rientrano in due categorie di base che utilizzano mezzi diversi per controllare la durata degli impulsi e la tensione (i due parametri elettrici che governano la formazione dei pori). Un tipo usa un sistema di scarica del condensatore per generare un impulso di corrente che decade esponenzialmente, e l’altro genera una vera onda quadra (o una sua approssimazione). Gli strumenti a scarica del condensatore caricano il loro condensatore interno ad una certa tensione e poi lo scaricano attraverso la sospensione cellula-DNA. Sia la dimensione del condensatore che la tensione possono essere variate. Poiché l’impulso di corrente è una funzione di decadimento esponenziale di (1) la tensione iniziale, (2) l’impostazione della capacità dello strumento, e (3) la resistenza del circuito (incluso il campione), cambiando la dimensione del condensatore per consentire una maggiore (o minore) carica da immagazzinare alla tensione si otterrà un tempo di decadimento più lungo (o più breve) e quindi una diversa durata effettiva dell’impulso. Al contrario, i generatori di onde quadre controllano sia la tensione che la durata dell’impulso con dispositivi di commutazione a stato solido. Possono anche produrre impulsi che si ripetono rapidamente. Per le applicazioni in vivo, i generatori di onde quadre sono preferiti. Oltre alla durata degli impulsi e l’ampiezza, il numero di impulsi e la configurazione degli elettrodi influenzano anche l’efficienza della consegna.
La maggior parte dei nostri esperimenti di elettroporazione in vitro hanno usato il Bio-Rad Gene Pulser, un dispositivo di scarico del condensatore, ma sono direttamente applicabili ad altri dispositivi di scarico del condensatore, e con qualche regolazione ai generatori di onda quadra. Dispositivi di scarica del condensatore sono disponibili anche da GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific e International Biotechnologies (vedi APPENDICE 4 per gli indirizzi dei fornitori). Queste macchine, in una singola unità o attraverso componenti aggiuntivi, possono fornire una varietà di condizioni di elettroporazione adatte alla maggior parte delle applicazioni. I generatori a onda quadra sono disponibili da BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan e IGEA e offrono un grande controllo sulla larghezza dell’impulso, permettono impulsi multipli e rapidi, e possono essere più efficaci per le cellule che sono molto sensibili o altrimenti difficili da trasfettare. L’uso dell’elettroporazione per realizzare la terapia genica negli animali viventi o negli esseri umani richiede anche un buon controllo sui parametri di elettroporazione per assicurare un trasferimento efficiente del DNA con danni minimi ai tessuti e questo richiede generalmente generatori di onde quadre. I generatori sono disponibili per somministrare impulsi come tensione costante o corrente costante. Oltre a fornire generatori di onde quadre, gli elettrodi adatti all’elettroporazione in vivo sono anche disponibili da questi fornitori. Queste macchine sono generalmente più costose. E ‘diventato evidente che gli impulsi di corrente alternata a ~ 100 kHz può essere la forma d’onda più efficace per l’elettroporazione e forse elettrofusione (Chang, 1989).
La maggior parte dei nostri esperimenti in vivo hanno utilizzato BTX T820 o T830 generatori di onda quadra. Questi esperimenti hanno utilizzato elettrodi disponibili in commercio come una matrice a 2 aghi, elettrodi a pinza ed elettrodi a pinza così come elettrodi progettati su misura. Come accennato in precedenza, i principali fornitori di attrezzature elettroporazione hanno una varietà di elettrodi penetranti e non penetranti disponibili. I generatori di onda quadra permettono un migliore controllo dei parametri di impulso che è particolarmente importante quando si esegue la consegna in vivo. La crescita dell’uso di elettroporazione in vivo è direttamente collegata alla sua consegna efficace nel muscolo. L’applicazione della consegna intramuscolare di geni usando l’elettroporazione è stata particolarmente importante per scopi di vaccinazione (Abdulhagg, et al., 2008). È stato anche dimostrato che il muscolo è un ottimo deposito per applicazioni di sostituzione delle proteine basate sui geni (Trollet, et al., 2006). La consegna al muscolo può anche essere usata per la consegna di vaccini anti-cancro (Bodles-Brakhop, et al., 2009). Anche la consegna alla pelle è stata accettata come un bersaglio versatile. La consegna alla pelle può essere usata per trattare direttamente le malattie cutanee, consegnando proteine alla circolazione per la terapia sistemica, la terapia del cancro e per consegnare vaccini del DNA (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
L’elettroporazione può essere più facile da eseguire rispetto alle tecniche alternative, motivo per cui sta diventando sempre più utilizzata. Il suo svantaggio per l’uso con l’analisi transitoria è che quasi cinque volte più cellule e DNA sono necessari sia con fosfato di calcio o DEAE-destrano trasfezione mediata (UNITS 9.1, 9.2 & 16.12). La differenza principale tra le procedure di elettroporazione e di coprecipitazione del fosfato di calcio è lo stato del DNA integrato dopo la selezione in mezzi antibiotici appropriati. Nel caso del fosfato di calcio, la quantità di DNA assorbita e integrata nel genoma di ogni cellula trasfettata è dell’ordine di 3 × 106 bp. Di conseguenza, il DNA trasfettato spesso si integra come grandi matrici tandem contenenti molte copie del DNA trasfettato. Questo sarebbe un vantaggio quando la trasfezione di DNA genomico in cellule destinatarie e la selezione per qualche cambiamento fenotipico come la trasformazione maligna è desiderato; qui una grande quantità di DNA integrato per cella destinataria è essenziale. Al contrario, l’elettroporazione può essere regolata per ottenere da una a molte copie di DNA inserito per cellula ricevente. Questo sarebbe un vantaggio per gli studi di espressione genica, poiché l’identità della particolare copia responsabile dell’espressione genica può essere controllata e, come discusso sopra, è essenziale per il targeting genico delle cellule ES per generare topi transgenici.