L’infezione da Giardia lamblia è una delle cause più comuni di malattie diarroiche in tutto il mondo (22). Questo protozoo patogeno colonizza l’intestino tenue e può attaccarsi all’epitelio ma non invade la mucosa. Le infezioni sono normalmente autolimitanti, poiché gli ospiti immunocompetenti possono controllare e tipicamente sradicare G. lamblia, un processo che coinvolge le cellule T CD4 e la generazione di immunoglobuline A (IgA) secretorie e altri effettori poco conosciuti (6, 8, 9, 18). Nonostante i sintomi clinici spesso gravi, diarrea, dolore addominale, malassorbimento e perdita di peso, l’infezione non è accompagnata da una significativa infiammazione della mucosa (12). Queste osservazioni suggeriscono che i mediatori infiammatori potrebbero non essere importanti per la diarrea indotta dal parassita, anche se i meccanismi che governano la diarrea nella giardiasi sono poco conosciuti. Giardia non ha dimostrato di rilasciare enterotossine che potrebbero spiegare il disturbo dell’assorbimento o della secrezione di liquidi intestinali. Una riduzione della superficie assorbente a causa di una perdita di microvilli epiteliali si verifica dopo l’infezione di Giardia nei topi (16), che potrebbe portare a diarrea osmoticamente guidato associato con malassorbimento, ma la riduzione di superficie assoluta è modesta rispetto alla riserva anatomica prevista del piccolo intestino. Gli esseri umani infettati da G. lamblia mostrano segni di ipermotilità intestinale all’esame radiologico (15), un fenomeno osservato anche nei gerbilli mongoli infettati sperimentalmente (5). I meccanismi sottostanti e il significato funzionale di questi risultati non sono attualmente chiari. Pertanto, l’obiettivo del presente studio è stato quello di verificare l’ipotesi che hypermotility intestinale rappresenta un meccanismo di difesa dell’ospite contro Giardia, utilizzando modelli murini di giardiasis.

Adult C57BL/6, SCID, e neuronale ossido nitrico sintasi (nNOS)-deficienti topi sono stati ottenuti da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Per le infezioni con Giardia muris, cisti sono stati purificati da flottazione saccarosio, contati in un emocitometro sotto un microscopio a contrasto di fase, e dato da gavage orale in acqua a 104 cisti / topo in 0.2 ml (9). Per le infezioni da G. lamblia, i trofozoiti del ceppo GS/M (ATCC 50580) (11) sono stati coltivati in mezzo TYIS-33 e somministrati per via orale a 107/mouse in 0,2 ml dello stesso mezzo (9). La motilità del piccolo intestino è stata determinata con un metodo modificato del pasto di prova. I topi sono stati a digiuno per una notte e dato 0,2 ml di una sospensione di 106 perle di polistirene fluorescente (10-μm-diametro Fluoresbrite YG carbossilato microsfere; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) e 6% colorante carminio in gomma arabica 5% in fosfato-buffered salina (PBS). Dopo 20 min, l’intestino tenue è stato rimosso rapidamente, e la posizione del fronte del colorante carminio e l’intera lunghezza dell’intestino tenue sono stati registrati. L’intestino è stato poi diviso in otto pezzi di uguali dimensioni, ognuno dei quali è stato aperto longitudinalmente, messo in 2 ml di PBS e raffreddato in ghiaccio per 10 minuti. Le miscele sono state agitate vigorosamente per staccare i trofozoiti e le perle, che sono stati poi contati separatamente utilizzando microscopi a contrasto di fase e a fluorescenza, rispettivamente. La distanza percorsa dal fronte del colorante carminio è stata espressa come percentuale dell’intera lunghezza dell’intestino tenue. Il numero di perline per segmento è stato espresso come percentuale del numero totale di perline nell’intestino tenue. Per valutare le conseguenze di inibire la motilità del piccolo intestino sulla clearance giardial, i topi sono stati prima infettati per via orale con G. muris o G. lamblia GS/M e trattati con gavage orale a giorni alterni, a partire dal giorno 7 o il giorno 4, rispettivamente, con 30 mg/kg loperamide o con PBS come controllo. I numeri dei trofozoiti del piccolo intestino sono stati determinati il giorno 21 per G. muris e il giorno 9 per G. lamblia.

Per determinare se i topi adulti normali sono un modello adatto per studiare il ruolo della motilità intestinale nel controllo dell’infezione giardial, abbiamo infettato topi C57BL/6 di 8-10 settimane con cisti del patogeno murino naturale G. muris. La motilità piccolo-intestinale è stata determinata da un metodo di pasto di prova, utilizzando colorante carminio come un marcatore di fase liquida (14) e 10-μm perline di polistirolo come un marcatore di particelle paragonabili per dimensioni ai trofozoiti Giardia (19). L’infezione con G. muris accelerato piccolo transito intestinale, dal momento che i fronti di entrambi colorante carminio (Fig. (Fig.1A) 1A) e perle di polistirolo (Fig. (Fig.1B) 1B) aveva viaggiato significativamente più lontano nei topi infetti che nei controlli non infetti. Un’analisi del corso del tempo di questo fenomeno ha rivelato che l’ipermotilità si è verificato entro una settimana dopo l’infezione, ma ha raggiunto il picco a 2 o 3 settimane, in un momento in cui il numero di trofozoiti erano diminuiti rispetto ai numeri al momento della massima infezione a 1 settimana (Fig. (Fig.1A).1A). Così, i cambiamenti massimi nella motilità piccolo-intestinale sono stati ritardati rispetto al picco nel carico trofozoite, suggerendo che questi cambiamenti possono essere causati da un meccanismo diverso dalla stimolazione diretta giardial.

Questo risultato ricorda i rapporti di perdita indotta da Giardia di microvilli epiteliali intestinali in cui la risposta immunitaria adattativa ospite è stato trovato per essere responsabile (16, 17). Per valutare se meccanismi simili possono essere coinvolti nel causare ipermotilità del piccolo intestino, abbiamo valutato i topi con grave immunodeficienza combinata (topi SCID). Questi topi mancano di cellule T e B funzionali a causa di un difetto nella subunità catalitica della protein chinasi DNA-dipendente, PRKDC, che è richiesto per la normale ricombinazione V (D) J, e non può eradicare Giardia (9, 18). G. muris infezione di topi SCID non ha alterato il transito piccolo-intestinale, che contrastava nettamente con le osservazioni nei controlli immunocompetenti (Fig. (Fig.2).2). Questi risultati indicano che l’ipermotilità del piccolo intestino associata alla giardiasi dipendeva dall’induzione di una normale risposta immunitaria adattativa al patogeno.

Per verificare se l’ipermotilità piccolo-intestinale osservato contribuito alla clearance di Giardia, abbiamo trattato i topi con loperamide, un farmaco che inibisce il transito intestinale attivando i recettori μ-opioidi nel tratto gastrointestinale (2, 13, 21). Il trattamento farmacologico è stato iniziato al momento del picco dell’infezione da G. muris (giorno 7) per garantire che i cambiamenti farmacologicamente indotti nella motilità non interferissero con l’instaurazione iniziale dell’infezione. L’inibizione della motilità del piccolo intestino da parte della loperamide ha notevolmente compromesso la clearance giardiale, con un numero di trofozoiti 25 volte superiore nei topi trattati con loperamide rispetto ai controlli trattati con PBS a 21 giorni (Fig. (Fig.3).3). Il trattamento con loperamide non ha avuto alcun effetto sullo sviluppo dell’immunità adattativa, poiché i titoli di IgA antigiardiali nelle secrezioni della mucosa intestinale non sono stati influenzati dal trattamento (dati non mostrati). Inoltre, questa strategia sperimentale ha rivelato un effetto inibitorio simile sull’infezione murina con G. lamblia GS/M, un patogeno giardiano umano che può infettare topi adulti normali (3, 9). I topi trattati con PBS avevano in gran parte eliminato l’infezione entro 9 giorni, mentre i topi trattati con loperamide dal giorno 4 in poi hanno continuato ad avere numeri significativi di trofozoiti G. lamblia nell’intestino tenue (Fig. (Fig.3).3). Così, l’inibizione della motilità del piccolo intestino ha compromesso la clearance di Giardia nell’ospite murino, indipendentemente dalla specie giardial. Come un ulteriore approccio per determinare l’importanza della motilità intestinale nella difesa dell’ospite antigiardial, abbiamo usato un approccio genetico in cui interruzione del gene per nNOS interferisce con propulsione efficace nell’intestino nei topi (20). L’analisi della motilità ha confermato che i topi con deficit di nNOS hanno esibito un ritardo costitutivo nel transito gastrointestinale rispetto ai loro compagni di cucciolata wild-type (Fig. (Fig.4A).4A). In parallelo, i topi knockout non è riuscito a cancellare G. lamblia infezione normalmente (Fig. (Fig.4B).4B). Così, utilizzando approcci farmacologici e genetici, abbiamo trovato che diminuita motilità intestinale è stato associato con compromissione della difesa dell’ospite contro Giardia.

Il nostro studio dimostra che l’ipermotilità intestinale è un’importante difesa dell’ospite contro Giardia, una conclusione raggiunta anche in un altro rapporto recente (10). Questa difesa sembra dipendere dallo sviluppo di una normale risposta immunitaria adattativa contro il parassita, in quanto non si è verificato in topi privi di cellule T e B, anche se è possibile, in linea di principio, che le cellule T o B contribuiscono alla ipermotilità indipendente dal loro ruolo nell’immunità adattativa antigiardiale. L’ipermotilità immunodipendente opera nella difesa dell’ospite contro altri parassiti enterici, in particolare gli elminti. Per esempio, l’eradicazione dell’ascaride Trichinella spiralis, che trascorre una porzione significativa del suo ciclo vitale nell’intestino tenue, è altamente correlata a una maggiore motilità intestinale (4, 23). Allo stesso modo, l’espulsione dell’anchilostoma Nippostrongylus brasiliensis nei ratti è accompagnata da ipermotilità del piccolo intestino, suggerendo un ruolo nella difesa dell’ospite contro questo elminta (7). Comune a tutti questi patogeni enterici è la loro localizzazione primaria, se non esclusiva, nel lume intestinale. Visto anatomicamente, questo sito di infezione si trova al di fuori del corpo rivestito di epitelio propriamente detto e quindi non è facilmente accessibile a molte cellule effettrici immunitarie e molecole, come i neutrofili o il complemento, che operano efficacemente all’interno del corpo. Infatti, un’efficace difesa antimicrobica nel lume intestinale rappresenta una sfida speciale per l’ospite, che ha un repertorio limitato di difese in questo sito. Di questi, IgA secretoria è considerato comunemente come un meccanismo di difesa luminale principale, ma la sua importanza effettiva nella clearance giardiale sembra essere variabile e può dipendere da fattori ospite e parassita mal definiti (6, 9, 18). I nostri dati e il lavoro precedente con gli elminti (4, 23) indicano che l’ipermotilità intestinale è un altro importante meccanismo di difesa contro la colonizzazione del lume intestinale.

L’ipermotilità immunodipendente può fornire una spiegazione meccanicistica per la diarrea associata alla giardiasi, come notato in rapporti precedenti (5, 15). In linea di principio, la diarrea può essere causata da una diminuzione dell’assorbimento dei fluidi o da un aumento della secrezione o da una combinazione di questi due meccanismi. Esistono poche prove per una maggiore secrezione di ioni e fluidi nella giardiasi, lasciando come causa probabile un assorbimento di fluidi alterato. Un tempo di contatto ridotto con i fluidi luminali, che possono essere ingeriti o derivati da secrezioni gastriche o pancreatiche, dovrebbe compromettere l’efficacia del trasporto di ioni attraverso l’epitelio, in particolare quando l’ipermotilità è combinata con la perdita riportata di superfici epiteliali assorbenti (16). Va notato, tuttavia, che i topi non mostrano diarrea franca su infezione da Giardia. Tuttavia, è possibile che uno squilibrio del fluido intestinale si verifichi sia negli ospiti umani che in quelli animali e che rimanga compensato nei topi ma non negli umani. Se ipermotilità infatti contribuisce alla patogenesi della diarrea, la nostra scoperta che i topi SCID non è riuscito a esibire Giardia-indotta ipermotilità implicherebbe che i pazienti con immunodeficienze cellulari associati con maggiore suscettibilità alle infezioni Giardia (ad esempio, immunodeficienza cronica variabile) può essere meno probabilità di sviluppare infezione-associata diarrea. Inoltre, i nostri risultati suggeriscono che la cautela è indicata quando si considera l’uso di inibitori della motilità intestinale nel trattamento della diarrea indotta da Giardia (1), come tale trattamento può prolungare l’infezione sottostante.