La filogenesi di Holometabola

Abbiamo analizzato un totale di 1.343 geni ortogonali 1:1 (cioè, gruppi di sequenze omologhe, chiamati anche gruppi di ortologhi (OG)) e, includendo anche i dati pubblicati, i dati di un totale di 88 specie (Tabella 1). I sette set di dati decisivi specificamente progettati che abbiamo analizzato per affrontare le nostre sette domande filogenetiche consistevano ciascuno di un sottoinsieme di taxa e geni dal set di dati completo, tranne il set di dati 1 che è identico al set di dati completo. Le sette domande, i gruppi tassonomici che abbiamo selezionato come rilevanti per rispondere alle domande, e il numero di specie e OG per ogni set di dati sono mostrati nella Tabella 2. Per ogni set di dati abbiamo eseguito 1) la ricostruzione dell’albero ML e 2) il Four-cluster Likelihood Mapping (FcLM) (vedi Tabella 3). I risultati sono riassunti nella figura 1 (vedi file aggiuntivo 1: Figure S1-S7 per la presenza e l’assenza di geni nei set di dati, file aggiuntivo 2: Figure S8-S15 per gli alberi filogenetici completi, e file aggiuntivo 3: Figure S17-S25 per i risultati completi del FcLM).

L’analisi del dataset 1 ha prodotto gli Imenotteri come gruppo sorella di tutti i restanti ordini olometabolani sia nella ricostruzione dell’albero ML che nel FcLM (Tabella 3, Figura 1). Questo rapporto era già stato recuperato in diversi studi di geni multipli (ad esempio, ), e sulla base di dati del genoma intero, ma un campionamento limitato taxon. Le analisi precedentemente pubblicate di dati morfologici hanno dato risultati contraddittori, come ad esempio Hymenoptera + Mecopterida in Beutel e Gorb contro Hymenoptera + restanti ordini olometabolani in Beutel et al. I potenziali problemi di artefatti topologici in queste analisi che sono causati da riduzioni convergenti in molti sistemi di caratteri morfologici sono stati discussi in dettaglio da Friedrich e Beutel e Beutel et al. La collocazione degli Imenotteri come gruppo gemello di tutti i restanti ordini olometabolani implica che le sinapomorfie presunte di Imenotteri e Mecopterida (ad esempio, artiglio singolo delle larve, piastra settoforo sclerotizzata degli adulti; vedi ) sono in realtà omoplasie.

Le nostre analisi del dataset 2 hanno prodotto Neuropteroidea monofiletici (cioè, un clade che comprende Neuropterida, Coleoptera, e Strepsiptera) con supporto massimo nella ricostruzione dell’albero ML e forte supporto nel FcLM (Tabella 3, Figura 1). Neuropteroidea non è stato sostenuto come un clade in Beutel et al. , ma è stato trovato monofiletico in molti studi precedenti, anche se nella maggior parte dei casi con supporto debole o senza.

Non abbiamo trovato alcun segnale per Megaloptera parafiletico come discusso da Beutel et al. e Winterton et al. (dataset 3, Tabella 3, Figura 1). All’interno dei Neuropterida, le nostre analisi ML hanno supportato al massimo una relazione di gruppo sorella tra Raphidioptera e Neuroptera + Megaloptera, che è stata supportata anche da più di 2/3 di tutti i quartetti nel FcLM (dataset 4, Tabella 3, Figura 1). Le relazioni filogenetiche tra gli ordini di neuropteridi sono state discusse in modo controverso con due ipotesi alternative: Raphidioptera + Megaloptera essere monofiletico (ad esempio, ) o Neuroptera + Megaloptera essere monofiletico (ad esempio, ). I nostri risultati supportano fortemente quest’ultima ipotesi.

L’analisi del dataset 5 ha dato risultati ambigui rispetto a un possibile clade che comprende Coleoptera e Strepsiptera (Coleopterida) (Tabella 3, Figura 1). Risolvere questo annoso problema è difficile a causa della morfologia estremamente modificata (ad esempio, ) e le caratteristiche genomiche distintamente derivate degli Strepsiptera endoparassiti (“il problema Strepsiptera”, ; “insetti dallo spazio esterno”, ). Nei contributi più recenti, sono state trovate prove per Coleopterida monofiletici (ad esempio, ). Tuttavia, gli studi basati su dati molecolari sono rimasti ambigui nei loro risultati. Coleopterida non sono stati supportati da tutti i set di dati analizzati da McKenna e Farrell . I risultati di Wiegmann et al. erano basati su un insieme relativamente piccolo di geni e hanno mostrato solo un supporto debole per questo clade. Niehuis et al. hanno analizzato le sequenze nucleotidiche dell’intero genoma di insetti olometaboli e hanno trovato Coleopterida ben supportati, ma il campionamento del taxon non ha incluso alcun ordine di neuropteridi. Nel nostro studio, Coleopterida è supportato nell’albero ML (con supporto bootstrap massimo), ma non nelle analisi FcLM (Tabella 3, Figura 1). Nell’albero ML, Strepsiptera sono collocati all’interno di Coleoptera (come in alcuni degli alberi di McKenna e Farrell), tuttavia, con relazioni scarsamente supportate (Additional file 2: Figura S12). Abbiamo ulteriormente analizzato se l’incongruenza tra la ricostruzione dell’albero ML e le analisi FcLM è svanita considerando le analisi ML e FcLM partizionate utilizzando diversi modelli su diverse partizioni. Le analisi partizionate potrebbero ridurre potenziali errori di specificazione del modello e potrebbero produrre topologie congruenti. Tuttavia, l’incongruenza tra le analisi ML e FcLM non è scomparsa (tabella 3, file aggiuntivi 2 e 3). Questo implica che le misspecifications del modello dovute alle analisi non partizionate non sono la fonte dell’incongruenza (vedi anche e discussione qui). Apparentemente, i dati e le procedure analitiche del nostro studio non hanno prodotto una soluzione univoca della questione se Coleopterida sia o meno un gruppo monofiletico. Tuttavia, l’evidenza dalla morfologia suggerisce chiaramente Coleopterida monofiletico (vedi anche ) come il risultato più plausibile.

Al fine di testare la monofilia di Mecopterida, un clade che comprende Amphiesmenoptera (Lepidoptera + Trichoptera) e Antliophora (Diptera + Siphonaptera + Mecoptera), abbiamo analizzato due versioni del dataset 6 per tenere conto di due possibili ipotesi (dataset 6a, b; Tabelle 2 e 3). Entrambe le analisi hanno recuperato Mecopterida monofiletico con un forte supporto (Tabella 3, Figura 1). Mecopterida monofiletico, come proposto da Hinton con il nome di Panorpoidea (o complesso panorpoide), non era ben supportato in Kjer et al. e Wiegmann et al. , e solo supportato nelle analisi bayesiane dei caratteri morfologici in Beutel et al. . Niehuis et al. hanno trovato un supporto provvisorio per questo clade basato sui dati del genoma intero, ma il campionamento incompleto dei taxon – i genomi di Neuropterida, Trichoptera, Siphonaptera e Mecoptera non sono ancora stati sequenziati – ha diminuito la decisività di questo set di dati per quanto riguarda la questione dei Mecopterida monofiletici.

Le nostre analisi hanno chiaramente confermato la monofilia degli Amphiesmenoptera (Trichoptera + Lepidoptera) (Figura 1). Tuttavia, non abbiamo testato questa ipotesi con un set di dati specificamente progettato perché non è mai stato seriamente contestato.

In Antliophora, che ha mostrato il massimo supporto di bootstrap nell’albero ML, abbiamo trovato una relazione di gruppo sorella di Mecoptera e Siphonaptera, anche con supporto massimo di bootstrap e con supporto massimo nel FcLM (dataset 7, Tabella 2, Figura 1). Questo risultato conferma le opinioni avanzate da Beutel e Gorb , McKenna e Farrell , e Wiegmann et al. , anche se il clade Mecoptera + Siphonaptera non era ben supportato in quest’ultimo studio. Una relazione di gruppo sorella tra Diptera e Siphonaptera come recuperato in Beutel et al. (, vedi discussione ivi) è altamente improbabile sulla base delle nostre analisi.

Con questo studio, non contribuiamo alla questione se Mecoptera sono un gruppo monofiletico come solo una specie, Nannochorista philpotti, faceva parte del nostro campione taxon. Tuttavia, i dati morfologici e le analisi di nove geni nucleari suggeriscono fortemente che i Mecoptera formano effettivamente un gruppo monofiletico.

In sintesi, abbiamo dedotto una solida spina dorsale filogenetica di Holometabola, con tre cladi mega-diverse supportate al massimo Hymenoptera, Neuropteroidea, e Mecopterida, con circa 135.000, 370.000, e 300.000 specie descritte, rispettivamente. Per l’unità ben definita che comprende Neuropteroidea e Mecopterida suggeriamo il nome Aparaglossata (Figura 1). Il nome si riferisce alla perdita delle paraglosse, una delle apomorfie più vistose del gruppo (vedi sotto e Tabella 4).

La nostra compilazione dei dataset di sequenze molecolari e il nostro disegno dell’analisi filogenetica presentano alcune importanti differenze rispetto agli studi precedenti sulla filogenesi di Holometabola. In particolare, i) abbiamo usato un’enorme quantità di dati generati con Illumina Next Generation Sequencing (Tabella 1). ii) Abbiamo assicurato la risolutezza dei nostri set di dati progettando specificamente set di dati per ciascuna delle nostre sette domande di ricerca (Tabella 2) (vedi ). Decisività significa che tutti i geni inclusi in un set di dati sono coperti da almeno un rappresentante di tutti i gruppi tassonomici che sono rilevanti per la specifica relazione filogenetica in studio. Di conseguenza, ogni set di dati ha una copertura del 100% in termini di presenza di geni, rispetto ai gruppi tassonomici rilevanti. Assicurando la decisività, alleviamo gli effetti potenzialmente fuorvianti dei dati mancanti. I dati mancanti possono portare all’inferenza di topologie altamente supportate ma sbagliate (vedi ). iii) Abbiamo eseguito FcLM per ciascuno dei nostri sette set di dati (Tabella 3). Abbiamo reimplementato FcLM in RAxML per far fronte a queste matrici di dati su larga scala e abbiamo integrato il metodo con script scritti di recente che mappano i rispettivi risultati in grafici 2D simplex. Il supporto del bootstrap negli alberi filogenetici da solo è di limitata efficacia nelle analisi di insiemi di dati molto grandi. FcLM è un metodo per identificare il possibile supporto di topologie alternative in un set di dati, cioè un metodo per visualizzare il segnale incongruente che potrebbe non essere osservabile negli alberi filogenetici. Questo studio è il primo ad applicare FcLM a grandi supermatrici filogenomiche. Infine, iv) abbiamo controllato tutti i set di dati per i rogue taxa. I rogue taxa sono taxa che assumono posizioni filogenetiche multiple in un insieme di alberi bootstrap. Essi diminuiscono la risoluzione e/o il supporto, per esempio, quando si costruiscono gli alberi di consenso bootstrap. La rimozione dei rogue può produrre un albero di consenso bootstrap più informativo (vedi file aggiuntivo 4, capitolo 4). Tutti i nostri set di dati erano privi di canaglie.

Con una compilazione di set di dati come quella presentata qui (cioè, estraendo il numero massimo di geni che possono contribuire a risolvere la relazione filogenetica in questione) abbiamo anche assicurato che le topologie dedotte non fossero basate su una selezione arbitraria di geni rispetto al loro segnale filogenetico intrinseco. Dell’Ampio et al. hanno mostrato che la selezione dei geni – se non guidata da considerazioni riguardanti la decisività di un set di dati – può generare alberi topologicamente diversi che possono tuttavia mostrare tutti un supporto elevato. Inoltre, Simon et al. hanno mostrato che i geni coinvolti in diversi percorsi biologici possono sostenere topologie diverse per una specifica relazione filogenetica. Si può quindi concludere che gli alberi filogenetici dedotti dallo studio solo di un insieme di pochi o diversi geni sono facilmente distorti e quindi potrebbero non riflettere l’albero di specie corretto. Mentre l’approccio attualmente migliore per affrontare questo problema è quello di includere la massima quantità possibile di dati potenzialmente informativi, dovremo districare ulteriormente i fattori che contribuiscono alle incongruenze topologiche nei set di dati (vedi anche ).

Gli studi filogenetici basati esclusivamente sulla morfologia (ad esempio, ) hanno anche prodotto raggruppamenti problematici in alcuni casi. Gli autori hanno affrontato e discusso gli artefatti apparenti che erano principalmente causati da riduzioni parallele di complessi di caratteri (ad esempio, l’apparato di volo). Tuttavia, i problemi si sono rivelati intrattabili dati i dati e le procedure analitiche a portata di mano. Con i nostri set di dati molecolari siamo stati in grado di fornire soluzioni affidabili per la maggior parte delle relazioni filogenetiche interordinarie all’interno di Holometabola (Figura 1, e sopra). Per tracciare i cambiamenti evolutivi a livello fenotipico abbiamo utilizzato il più ampio set di dati morfologici attualmente disponibile, compresi 356 caratteri di rappresentanti di tutti gli ordini olometaboli e di taxa outgroup accuratamente selezionati. I caratteri sono stati mappati sulla filogenesi basata sul trascrittoma in un approccio formale (vedi sezione Metodi per i dettagli). Questo ci ha permesso di tracciare e reinterpretare i cambiamenti evolutivi di numerosi caratteri e di condurre ricostruzioni basate sulla parsimonia per tutti i cladi dell’albero (vedi “L’evoluzione all’interno degli olometaboli” qui sotto).

L’evoluzione all’interno di Holometabola

Larve e sviluppo

I nostri risultati filogenetici suggeriscono che la larva ancestrale di Holometabola era terrestre, ortognata, dotata di occhi composti moderatamente semplificati ma nettamente sviluppati e di zampe toraciche ben sviluppate. Le prole addominali e i cerci erano assenti (Figura 2). Il sistema muscolare era generalmente ben sviluppato. Le semplificazioni distinte delle antenne e dei lobi dell’endite labiale e dei muscoli associati sono autapomorfie larvali di Holometabola. La testa ortognata nel groundplan suggerisce che le prime larve di Holometabola si nutrivano esternamente di materiale vegetale o funghi e non scavavano nel substrato o penetravano in fessure strette (per esempio, sotto la corteccia).

La larva ancestrale aparaglossatan era probabilmente prognatica e dotata di stemmi. Se queste larve fossero del tipo campodeide agile, come le larve di molti coleotteri (ad esempio, Adephaga, Myxophaga , Staphylinoidea), Strepsiptera (primo stadio), Neuropterida, e alcuni gruppi di Trichoptera (ad esempio, Rhyacophilidae), rimane poco chiaro. È ipotizzabile che questo tipo larvale sia una condizione apomorfica che caratterizza i Neuropteroidea, con un’evoluzione parallela nei Tricotteri. Il prognatismo è spesso legato ad abitudini alimentari carnivore (Neuropterida, Adephaga, e alcuni sottogruppi polifagi), ma può anche essere correlato alla penetrazione di fessure strette o allo scavare nei substrati, come nel caso delle larve associate al legno degli Archostemata (Coleoptera), ma anche nei primi lignaggi di lepidotteri (ad esempio, ). Pertanto, non è chiaro se le larve ancestrali aparaglossate fossero predace o meno. Le larve dei Mecopterida mostrano alcune semplificazioni (tentorio e segmenti antennali), e una netta tendenza alla riduzione caratterizza le larve degli antliofori, soprattutto quelle dei Siphonaptera e dei Diptera. Entrambi hanno perso completamente le zampe toraciche (nettamente accorciate nei Mecoptera) e sono caratterizzati da semplificazioni delle strutture cefaliche, soprattutto del sistema muscolare. Questo riflette la diffusa storia di vita larvale in Antliophora, con le larve che vivono nello strato superiore del suolo, nella lettiera di foglie, nei substrati umidi o in diversi corpi idrici, nutrendosi principalmente di substrati morbidi o di piccole particelle. L’importante questione se le larve ancestrali degli antliophoran fossero terrestri (Lepidoptera, Mecoptera, Siphonaptera, Mecoptera excl. Nannochoristidae, Diptera partim) o acquatiche (Trichoptera, Nannochoristidae, Diptera partim) rimane ambigua.

I nostri risultati filogenetici indicano chiaramente che un tipico sviluppo olometabolico con larve completamente prive di gemme alari esterne (“insetti endopterigoti”) e anche prive di cerci appartiene al piano di base di Holometabola (vedi anche ). Le condizioni che caratterizzano le larve primarie strepsipterane (segmento addominale XI e cerci presenti) e le larve secondarie (gemme alari esterne riconoscibili come convessità esterne) sono apparentemente il risultato di inversioni, come la precoce comparsa dei futuri occhi composti (vedi ). Le pupe largamente immobilizzate con mandibole immobilizzate (pupa adectica) si sono quasi certamente evolute più volte in modo indipendente. Sembra probabile che una pupa mobile con mandibole mobili come è caratteristico per i Raphidioptera sia ancestrale per gli Holometabola anche se questo non è confermato da un’analisi formale dei caratteri.

Gli adulti e la deposizione delle uova

L’adulto ancestrale olometabola apparentemente differiva solo leggermente dalla pianta dei neotteri (Neoptera: tutti gli insetti alati tranne Odonata ed Ephemeroptera). Le strutture cefaliche, l’intero sistema muscolare, l’apparato di volo e le strutture addominali appaiono in gran parte non modificate. Le apomorfie più profonde negli insetti adulti olometabolani sono legate all’invaginazione degli sterniti pterotoracici (ad esempio, meso- e metacoxae strettamente adiacenti). I nostri dati non portano ad una valutazione affidabile delle abitudini alimentari ancestrali degli adulti olometaboli, ma è evidente che l’alimentazione nello stadio adulto ha giocato un ruolo minore rispetto all’alimentazione negli stadi larvali. Eccezioni a questa regola sono per esempio i coleotteri predatori (es, Dytiscidae e Carabidae) con uno sviluppo posttembrionale molto rapido e adulti longevi.

Trasformazioni morfologiche distinte caratterizzano l’ascesa degli Aparaglossata: la riduzione dei lobi dell’endite labiale (paraglossae), compresi i muscoli, la modifica distinta dell’ovopositore ortotteroide, e forse il numero ridotto di tubuli di Malpighian (anche in Acercaria (vere cimici, psocotteri, pidocchi e parenti). I nostri risultati non permettono una ricostruzione univoca della condizione ancestrale dell’apparato di volo per Holometabola e Aparaglossata. Sembra plausibile che segmenti pterotoracici di dimensioni approssimativamente uguali (come nei Neuropterida, nei primi lignaggi di lepidotteri e nei Mecoptera) siano plesiomorfi per gli Aparaglossata, ma la ricostruzione dello stato ancestrale di questo carattere nell’analisi formale è rimasta ambigua. Come sottolineato sopra, la questione se Coleopterida sia o meno un gruppo monofiletico non è completamente risolta. Tuttavia, sembra plausibile ipotizzare che il posteromotorismo si sia evoluto solo una volta in un antenato comune di Strepsiptera e Coleoptera, con una serie di caratteristiche correlate, come la riduzione delle dimensioni del mesotorace, una riduzione distinta del sistema muscolare mesotoracico, e un aumento delle dimensioni del metatorace. Un distinto anteromotorismo come è presente in Imenotteri, Tricotteri, Lepidotteri “superiori” e Ditteri è probabilmente ancestrale in Holometabola, ma è concepibile che questa condizione si sia evoluta (secondariamente?, vedi sopra) più volte indipendentemente (ad es, segmenti pterotoracici di dimensioni quasi uguali nei Lepidotteri non lucidi).

I meccanismi di accoppiamento delle ali si sono apparentemente evoluti in modo indipendente negli Imenotteri (hamuli come autapomorfia dell’ordine, vedi file aggiuntivo 4, capitolo 5), nei Tricotteri, nei Lepidotteri e in alcune famiglie di Neurotteri (in questi ordini sono presenti meccanismi diversi).

La modalità primaria di deposizione delle uova in Holometabola era molto probabilmente endofitica, come si può ipotizzare per il piano terra degli Imenotteri (“Symphyta”). Questa modalità di deposizione delle uova è probabilmente mantenuta nel groundplan dei Neuropteroidea. I Raphidioptera hanno un ovipositore modificato e allungato che usano per depositare le uova sotto la corteccia o nella lettiera del terreno. Questo assomiglia alla deposizione delle uova come ipotizzato per il groundplan degli Holometabola e degli Hymenoptera; tuttavia, potrebbe anche essere un carattere derivato. La riduzione completa o quasi completa degli elementi dell’ovopositore primario è una caratteristica dei Mecopterida ed è ovviamente legata alla deposizione superficiale delle uova o all’ovodeposizione in substrati morbidi. I nostri risultati confermano per lo più uno scenario evolutivo per il postabdomen femminile e la deposizione delle uova come descritto in dettaglio in Hünefeld et al.