3.4 Modifica dell’inosina e il turnover dell’mRNA
La modifica da adenosina a inosina (A-I) degli mRNA è catalizzata da adenosina deaminasi che agiscono su enzimi RNA (ADAR). Questi enzimi hanno una preferenza per le regioni di RNA a doppio filamento, e la conversione di A-I (descritta anche come editing in questa sezione) cambierà le proprietà di accoppiamento di base delle basi modificate, poiché ora si accoppieranno in modo simile alla guanina. Come è stato fatto in precedenza, separeremo gli effetti diretti dell’inosina sulla stabilità dell’mRNA da quelli che derivano dagli effetti indiretti. L’introduzione di inosina nelle regioni a doppio filamento di RNA può innescare la degradazione attraverso il reclutamento di ribonucleasi specifiche per gli RNA contenenti inosina. Il primo enzima proposto per mediare questo effetto è la nucleasi tudor-stafilococcica (SN), che ha dimostrato di promuovere la scissione di RNA a doppio filamento iperedificato in estratti. La maggior parte dei risultati descritti in questo studio dimostrano un’attività biochimica per Tudor-SN su substrati ipereditati in vitro. Tuttavia, non è chiaro da questi studi quale frazione di mRNA contenenti inosina sono soggetti a scissione da parte di Tudor-SN in vivo, e se Tudor-SN fosse o meno l’endonucleasi diretta. Tudor-SN è stato trovato per essere localizzato in granuli di stress citoplasmatico, quindi è possibile che alcuni dei suoi trascritti bersaglio possono essere regolati preferenzialmente durante le condizioni di stress. La seconda nucleasi nota per essere specifica per gli RNA contenenti inosina è l’endonucleasi umana V (hEndoV), che può tagliare una varietà di substrati di RNA contenenti inosina in vitro. Uno studio ha suggerito che hEndoV è la vera endonucleasi dell’inosina, con Tudor-SN che fornisce un’attività stimolatoria a hEndoV. È interessante notare che hEndoV localizza anche ai granuli di stress citoplasmatici, suggerendo una funzione simile a Tudor-SN nel regolare potenzialmente i livelli di mRNA contenenti inosina durante lo stress. Nel complesso, mentre è chiaro che le attività di nucleasi inosina-specifiche esistono nelle cellule eucariotiche (Fig. 5), il loro contributo alla scissione e al turnover dell’mRNA rimane poco compreso. Pertanto, l’impatto fisiologico della scissione del dsRNA ipereditato da Tudor-SN e/o hEndoV deve essere esplorato più a fondo.
Gli enzimi ADAR possono anche svolgere un ruolo importante nella stabilità dell’mRNA regolando il legame delle proteine leganti l’RNA che influenzano il decadimento dell’mRNA. L’influenza degli ADAR sul livello dei loro mRNA bersaglio è stata misurata globalmente, e in generale il loro impatto sui livelli di mRNA non si correla bene con la loro capacità di promuovere la formazione di inosina in questi mRNA. Piuttosto, sembra che l’impatto principale degli ADAR sulla stabilità dell’mRNA avvenga attraverso il reclutamento della proteina legante l’RNA HuR (ELAVL1), che è un importante regolatore del decadimento dell’mRNA. ADAR1 interagisce con HuR in un modo RNA-dipendente, e la maggior parte degli mRNA downregolati in assenza di ADAR1 contengono siti di legame HuR. Così, ADAR1 sembra influenzare la stabilità dei suoi obiettivi mRNA attraverso il reclutamento di HuR ai siti di destinazione situati nelle vicinanze. Gli ADAR possono anche regolare i livelli di diversi mRNA e ncRNA impedendo il legame del fattore di decadimento PARN, che è una nucleasi poli(A)-specifica. Questa funzione sembra anche indipendente dall’editing, in quanto un mutante ADAR cataliticamente inattivo è in grado di svolgere le funzioni dell’enzima nel controllo del decadimento. Così, l’impatto degli ADAR sulla stabilità dei loro bersagli di mRNA sembra essere per lo più indipendente dalla loro capacità di promuovere la formazione di inosina.
Una conseguenza importante della modifica dell’inosina sul turnover dell’mRNA è dovuta all’impatto dell’inosina sulla regolazione genica mediata dai microRNA. La presenza di inosina può influenzare due fasi principali di questo percorso: (i) la biogenesi dei microRNA e (ii) la specificità del targeting degli mRNA da parte dei microRNA. Per quanto riguarda l’impatto dell’inosina sulla biogenesi dei microRNA, è stato dimostrato che i precursori primari dei microRNA possono essere editati da ADAR1 o ADAR2 . La presenza di inosina in questi precursori ha due effetti dannosi sulla produzione di microRNA maturi. In primo luogo, l’inosina riduce l’efficienza dell’elaborazione dei precursori primari da parte di Drosha; in secondo luogo, i precursori contenenti inosina diventano ora un bersaglio per le ribonucleasi inosina-specifiche come Tudor-SN e/o hEndoV. Questi effetti combinati della modifica dell’inosina sui precursori primari dei microRNA risultano in una diminuzione dei livelli di microRNA prodotti da questi precursori, con un concomitante aumento degli mRNA bersaglio. Questo processo può essere regolato, come i precursori del microRNA miR-151 hanno dimostrato di essere modificati durante lo sviluppo precoce, che si traduce nella degradazione dei precursori da parte di Tudor-SN . Più in generale, i precursori dei microRNA contenenti inosina sono degradati durante le fasi postzigotiche nei topi. Questi risultati dimostrano che l’editing A-I dei precursori dei microRNA può regolare la loro biogenesi durante lo sviluppo, che a sua volta influenza direttamente l’espressione dei loro obiettivi mRNA. Tuttavia, l’effetto degli ADAR sulla biogenesi dei microRNA è complesso perché ADAR1 ha anche dimostrato di eterodimerizzare con l’enzima RNasi III Dicer per aumentare l’efficienza dell’elaborazione dei microRNA, giocando così un ruolo positivo nella biogenesi dei microRNA. La complessità degli effetti diretti e indiretti degli ADAR sulla biogenesi dei piccoli RNA è stata dimostrata anche a livello genomico in Caenorhabditis elegans. Infine, ADAR1 può anche legare i siRNA indipendentemente dall’editing dell’RNA nelle cellule di mammifero, il che limita l’efficacia del trattamento con siRNA. Pertanto, gli ADAR sembrano essere un’arma a doppio taglio per il silenziamento genico mediato da microRNA e piccoli RNA, poiché l’effetto soppressivo della modifica dell’inosina sull’elaborazione e la stabilità dei precursori di microRNA può essere controbilanciato dalla capacità degli ADAR di promuovere l’elaborazione dei microRNA attraverso la loro associazione con Dicer e il loro effetto sulla disponibilità di siRNA. Tuttavia, questi enzimi svolgono funzioni chiave nel controllo della differenziazione cellulare attraverso l’editing dei precursori di microRNA. Per esempio, l’iperediting del precursore del microRNA Let-7 da parte di ADAR1 nella leucemia ha dimostrato di promuovere il rinnovamento delle cellule staminali leucemiche, evidenziando l’importanza della regolazione fine dei precursori del microRNA durante la differenziazione cellulare.
L’inosina influenza anche la regolazione dell’mRNA mediata dai microRNA influenzando la formazione del duplex di RNA, che è fondamentale nel determinare la specificità delle interazioni microRNA-mRNA (Fig. 5). Questo è stato dimostrato per la prima volta dimostrando che l’introduzione di inosina nel microRNA miR-376 ha portato alla repressione di un diverso gruppo di mRNA rispetto a quelli repressi dal miR-376 non modificato. Se il sito modificato risiede nella sequenza del seme del microRNA, la modifica si traduce in un cambiamento di specificità per i microRNA perché l’inosina si accoppia preferenzialmente con la C. Reciprocamente, l’editing A-I nelle sequenze 3′-UTR degli mRNA cambierà il potenziale targeting di questi UTR da parte dei microRNA e può creare nuovi siti di legame dei microRNA. L’editing regolato ha dimostrato di essere potenzialmente importante nella regolazione degli oncogeni e dei geni soppressori del tumore attraverso i microRNA durante la trasformazione cellulare.
Infine, l’inosina può influenzare la stabilità dell’mRNA attraverso effetti indiretti. Gli mRNA contenenti inosina sono stati trovati per essere limitati al nucleo nelle cellule immunitarie stimolate da LPS, impedendo la loro esposizione al meccanismo di decadimento citoplasmatico degli mRNA. La ritenzione nucleare di questi mRNA, tuttavia, li sottoporrebbe alla degradazione preferenziale da parte delle vie di degradazione nucleare come l’esosoma nucleare. Questo può comportare un aumento o una diminuzione della stabilità, a seconda dell’efficienza relativa di ciascuna di queste vie di degradazione su specifici mRNA. L’inosina ha anche un impatto sullo splicing alternativo, che a sua volta potrebbe risultare in isoforme di mRNA con diverse stabilità. Questo è particolarmente vero se le specie con splicing alternativo contengono siti di legame per distinte proteine leganti l’RNA che modulano la loro stabilità. Pertanto, l’inosina e gli ADAR possono influenzare la stabilità e l’espressione dell’mRNA in molti modi attraverso una combinazione di effetti diretti e indiretti.