Abstract

Fondo e obiettivo. Uno strumento di previsione non invasivo affidabile per lo screening, la diagnosi e/o la stadiazione del cancro colorettale (CRC) prima della chirurgia è fondamentale per la scelta del trattamento e la prognosi. Metodi. I pazienti ammessi per il trattamento iniziale del CRC tra il 1° gennaio 2015 e il 31 dicembre 2018 sono stati recuperati e rivisti. Le registrazioni delle cellule natural killer (NK) CD16+CD56+ sono state analizzate secondo le fasi del CRC. Risultati. Il numero di partecipanti qualificati nei pazienti sani, stadio I, stadio II, stadio III e stadio IV del CRC erano rispettivamente 60, 66, 60, 70 e 68. C’era una differenza significativa nelle cellule NK CD16+CD56+ circolanti tra il gruppo sano e il gruppo CRC (), così come tra il gruppo sano e il gruppo CRC allo stadio III o IV ( e 0,001, rispettivamente). La percentuale di cellule NK CD16+CD56+ circolanti nei linfociti era negativamente correlata all’insorgenza del CRC. Confrontando il pool di casi di CRC allo stadio I e II con il pool di casi di CRC allo stadio III e IV usando le cellule NK CD16+CD56+ circolanti, l’area sotto la curva Receiver Operating Characteristic era 0,878. Utilizzando un valore di cutoff ottimale del 15,6%, l’OR era 0,06 (0,03, 0,11), la sensibilità era 86,5%, la specificità era 72,5%, il valore predittivo positivo era 74,2% e il valore predittivo negativo era 85,5%. Conclusioni. Le cellule NK CD16+CD56+ circolanti possono essere utilizzate come strumento di screening e di diagnosi/stadiazione per il CRC.

1. Introduzione

Il cancro del colon-retto (CRC) ha un’incidenza di circa un milione all’anno e causa la morte di quasi 700.000 persone ogni anno, classificandolo come il quarto cancro più mortale al mondo. L’attuale strategia di screening del CRC si scontra con la bassa sensibilità e/o specificità dei test basati sulle feci, le noiose fasi di preparazione dell’intestino prima degli esami radiografici e l’alto rischio di perforazione negli esami endoscopici. Infatti, il miglior test di screening e di follow-up con alta conformità per il CRC dovrebbe essere facilmente completato e ripetuto, soprattutto considerando i casi non resecabili fino al 25% al momento della diagnosi e il tasso di recidiva del 50% nei casi in stadio iniziale dopo l’intervento chirurgico.

La stadiazione e la prognosi del CRC si basano principalmente sulla patologia dopo le procedure chirurgiche. Un immunoscore di consenso su sezioni di paraffina per la classificazione e la prognosi del CRC è stato un esempio pratico. Anche se diversi studi hanno impiegato biomarcatori complementari e non invasivi nella diagnosi di CRC, manca ancora uno strumento di predizione affidabile con alta sensibilità e specificità per la diagnosi e/o la stadiazione di CRC prima dell’intervento chirurgico.

Il sistema immunitario è noto per essere coinvolto nello sviluppo e nella progressione di CRC. L’infiltrazione immunitaria di diverse cellule immunitarie nel CRC ha dimostrato di essere correlata alla metastasi e alla prognosi. Inoltre, le cellule immunitarie circolanti possono riflettere la risposta immunitaria locale nel microambiente tumorale, fornendo così informazioni potenzialmente importanti sulla progressione della malattia nel CRC. Le cellule natural killer (NK), come un importante sottoinsieme delle cellule immunitarie, la cui attività è innescata da un equilibrio in evoluzione e delicato tra segnali di attivazione e inibizione ricevuti dai recettori di superficie delle cellule, sono considerate obiettivi interessanti per studi traslazionali e clinici.

Nel presente studio, abbiamo analizzato le cellule NK CD16 e CD56 doppiamente positive nei pazienti sani e in diversi stadi di CRC prima del trattamento iniziale, cercando di capire il valore delle cellule NK CD16+CD56+ nella previsione e nella stadiazione pretrattamento di CRC.

2. Metodi

Questo era uno studio di coorte retrospettivo condotto presso il 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, un ospedale terziario nel nord-est della Cina. L’approvazione del comitato etico istituzionale è stata ottenuta prima della raccolta dei dati e il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti al momento del ricovero.

Sono state recuperate e riviste le cartelle cliniche dei pazienti che sono stati ammessi per il trattamento iniziale di CRC tra il 1° gennaio 2015 e il 31 dicembre 2018 al dipartimento di oncologia. I pazienti inclusi dovevano avere a disposizione i dati sulle cellule NK pretrattamento (il più recente prima del primo intervento chirurgico), così come il CRC primario confermato istologicamente. La stadiazione era basata sulla terminologia TNM (Tumor Node Metastasis). Sono stati esclusi i pazienti con diagnosi non chiara, complicati con altri tumori, ricoverati dopo precedenti trattamenti per CRC, con altre malattie croniche (come malattie cardiovascolari e endocrine), o con infezioni virali o batteriche. Nel gruppo di controllo sono stati arruolati partecipanti sani per età e BMI (nessuna lamentela clinica che hanno appena completato l’esame fisico annuale al momento dell’arruolamento).

I campioni di sangue venoso periferico a digiuno sono stati raccolti da tutti i partecipanti prima del trattamento (per il gruppo CRC) o il giorno dell’esame annuale (per i controlli sani) in una provetta rivestita di eparina e conservata a 2-8°C. 100 μl di sangue appena raccolto sono stati trasferiti in una provetta specifica per il flusso. Sono stati aggiunti 20 μl di un reagente BD Multitest TBNK a 6 colori (rif. 644611, BD, USA, compresi CD3 FITC, CD16 PE+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC, e CD8 APC-Cy7) per lo studio in citometria a flusso secondo il manuale del produttore, all’interno del cui pannello CD16+CD56+ quantificava specificamente le cellule NK all’interno della popolazione linfocitaria. La miscela è stata incubata a temperatura ambiente per 15 minuti al buio e trattata con 2,5 ml di tampone di lisi dei globuli rossi (Sigma-Aldrich) per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. La miscela è stata lavata due volte con tampone PBS, risospesa e fissata in 0,5 ml di PBS contenente lo 0,9% di formaldeide (Sigma-Aldrich), e analizzata utilizzando un sistema di citometro a flusso FACSCanto II (BD Biosciences) con il software FACSDiva™ versione 8.0 (BD Biosciences). Almeno 20.000 cellule sono state analizzate nel gate P1 di ogni campione.

2.1. Analisi statistica

I dati discreti sono stati espressi come numero di casi (percentuali) e analizzati utilizzando il test o il test esatto di Fisher, insieme a odds ratio (OR) e intervallo di confidenza al 95% (95% CI), a seconda dei casi. I dati continui sono stati mostrati come il e sono stati analizzati usando il -test. L’area sotto la curva ROC (Receiver Operating Characteristic) è stata usata per mostrare il valore della predizione. SPSS 24.0 (IBM Corp., Armonk, NY) è stato utilizzato per l’analisi statistica. Un due code è considerato significativamente diverso.

3. Risultati

Durante il periodo di studio prestabilito, 2.714 pazienti CRC sono stati ammessi nel nostro ospedale. Secondo i criteri d’inclusione prestabiliti, 66 dello stadio I, 60 dello stadio II, 70 dello stadio III e 68 dello stadio IV sono stati inclusi nel nostro studio. Altri 60 partecipanti sani, di pari età e BMI, sono stati arruolati nel gruppo di controllo. Non c’erano differenze significative in età, sesso, peso corporeo, altezza o BMI tra i controlli sani e i casi di CRC o tra i diversi gruppi (Tabella 1).

3.1. Il valore predittivo delle cellule NK CD16+CD56+ circolanti nel CRC

C’era una differenza significativa nelle cellule NK CD16+CD56+ circolanti tra il gruppo sano e i casi di CRC (, Tabella 1). La percentuale di cellule NK CD16+CD56+ circolanti nei linfociti era negativamente correlata all’insorgenza di CRC.

La curva ROC (Receiver Operating Characteristic) è stata utilizzata per mostrare il ruolo delle cellule NK CD16+CD56+ nella previsione di CRC. Confrontando i controlli sani con i casi di CRC nel loro insieme (Figura 1), l’area sotto la curva (AUC) era 0,725 (Tabella 2). Utilizzando un valore di cutoff ottimale del 19,7%, l’OR era 0,08 (0,04, 0,15), la sensibilità era 80,0%, la specificità era 76,9%, il valore predittivo positivo (PPV) era 44,0% e il valore predittivo negativo (NPV) era 94.4%.

Figura 1

Curva operativa caratteristica (ROC) delle cellule NK nella previsione dei casi CRC (sani vs. casi).

3.2. Cellule NK CD16+CD56+ circolanti in diversi stadi di casi di CRC

Non c’erano differenze nelle cellule NK CD16+CD56+ circolanti tra il gruppo sano e il gruppo CRC stadio I o II ( e , rispettivamente), ma esistono differenze significative tra il gruppo sano e il gruppo CRC stadio III o IV (, , e , rispettivamente, Tabella 1). Poiché non c’erano differenze nelle cellule NK CD16+CD56+ tra il gruppo sano e il gruppo CRC allo stadio I o II, quando si è confrontato il gruppo di controlli sani+casi CRC allo stadio I+II con il gruppo di casi CRC allo stadio III+IV (Figura 2), l’AUC era 0,892 (Tabella 2). Utilizzando un valore di cutoff ottimale del 15,6%, l’OR era 0,07 (0,04, 0,12), la sensibilità era 84,4%, la specificità era 72,5%, PPV era 80,5% e NPV era 77,5%.

Figura 2

Curva caratteristica operativa (ROC) delle cellule NK in diversi stadi di casi CRC (sano+stadi 1&2 vs. stadi 3&4).

Confrontando il pool di casi CRC di stadio I e II con il pool di casi CRC di stadio III e IV (Figura 3), l’AUC era 0,878 (Tabella 2). Utilizzando un valore di cutoff ottimale del 15,6%, l’OR era 0,06 (0,03, 0,11), la sensibilità era 86,5%, la specificità era 72,5%, PPV era 74,2% e NPV era 85,5%.

Figura 3

Curva caratteristica operativa (ROC) delle cellule NK in diversi stadi di casi CRC (stadi 1&2 vs. stadi 3&4).

4. Discussione

In generale, in base alla loro espressione CD56, le cellule NK possono essere suddivise in CD56bright e CD56dim. Le prime cellule sono associate all’immunoregolazione e alla produzione di citochine proinfiammatorie, mentre le seconde sono citotossiche. Il CD16 (FcγRIII) sulle cellule NK media la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente, e la presenza del CD16 esclude quindi il coinvolgimento di alcune cellule NK correlate alle cellule T o B.

Di recente, due studi hanno utilizzato CD3-CD56+ come marcatori per le cellule NK. Uno studio ha riportato la presenza di sottoinsiemi di cellule NK nei pazienti CRC, con la conclusione che “la percentuale di cellule CD16+ NKT-like era indipendentemente associata a una più breve sopravvivenza libera da malattia nei pazienti CRC”. Tuttavia, gli autori hanno arruolato solo un numero limitato di pazienti, e la stratificazione per diversi stadi così come una divisione della popolazione di cellule NK CD56bright e CD56dim ha ulteriormente diluito la potenza dei loro dati. Inoltre, alcuni di questi pazienti hanno ricevuto un trattamento radiologico già prima della raccolta delle cellule NK, il che potrebbe introdurre eterogeneità (una miscela di pazienti inizialmente trattati e post-trattamento) nella popolazione di pazienti raggruppati. Un altro studio ha riportato una correlazione negativa tra le cellule NK periferiche e la stadiazione TNM del CRC, con una differenza significativa nelle cellule NK tra il sano e gli stadi I e II, e il sano e lo stadio IV, ma non tra il sano e lo stadio III. Questa tendenza incoerente potrebbe essere dovuta al piccolo numero di pazienti arruolati in ogni gruppo. Nel nostro studio, abbiamo raccolto più pazienti, e solo i pazienti senza trattamento precedente sono stati arruolati per l’analisi, che potrebbe mostrare la condizione naturale del corpo sotto il peso del CRC. Pertanto, i nostri dati, in quanto omogenei, sono applicabili come test di screening prima del trattamento iniziale.

Un altro potere del nostro studio risiede nell’esclusione dei casi di infezione virale o batterica. Ci sono recettori attivatori e recettori inibitori sulla superficie delle cellule NK. I recettori attivanti delle cellule NK, come sono stati esemplificati da Ly49H, KIR2DL3, o KIR3DS1, sono necessari per eliminare le infezioni da citomegalovirus, virus dell’epatite C o virus di Epstein-Barr, rispettivamente. D’altra parte, i recettori inibitori delle cellule NK, come sono stati esemplificati da CD94-NKG2A , o KIRs , sono anche coinvolti nel caso di infezioni virali. L’equilibrio tra recettori attivanti e inibitori è mantenuto per mezzo del legame recettore-ligando. I recettori diretti Toll-like (TLR) possono essere attivati dal lipopolisaccaride, un componente dei batteri gram-negativi. La stimolazione dei TLR sulle cellule NK è stata anche riportata per essere coinvolta nell’attivazione delle cellule NK. Pertanto, l’esclusione dei casi di infezione virale o batterica ridurrà l’eterogeneità di questi casi nell’analisi dei casi di CRC.

Ci sono stati rapporti sulla prognosi di CRC basata sulla colorazione immunoistochimica per rilevare la mutazione o il polimorfismo del gene, o l’attivazione, che è possibile solo dopo procedure chirurgiche. Una categoria di biomarcatori circolanti per CRC rientra nell’ambito della regolazione genica (microRNA o metilazione) . Un’altra categoria risiede nell’analisi metabolomica del siero. In questo senso, le cellule NK CD16+CD56+ circolanti hanno un ruolo predittivo sia nello screening che nella stadiazione prima delle procedure chirurgiche.

5. Conclusione

In sintesi, abbiamo trovato che la percentuale di cellule NK CD16+CD56+ circolanti era negativamente correlata all’insorgenza di CRC e alla stadiazione di CRC. Utilizzando un valore di cutoff del 19,7% e del 15,6%, la percentuale di cellule NK CD16+CD56+ circolanti era in grado di differenziare tra casi sani e casi di CRC o stadio I+II e III+IV, rispettivamente.

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