FRAP può anche essere usato per monitorare le proteine fuori dalla membrana. Dopo che la proteina di interesse è resa fluorescente, generalmente tramite l’espressione come proteina di fusione GFP, un microscopio confocale viene utilizzato per photobleach e monitorare una regione del citoplasma, fuso mitotico, nucleo o un’altra struttura cellulare. La fluorescenza media nella regione può quindi essere tracciata in funzione del tempo trascorso dal photobleaching, e la curva risultante può produrre coefficienti cinetici, come quelli per le reazioni di legame della proteina e/o il coefficiente di diffusione della proteina nel mezzo in cui viene monitorata. Spesso le uniche dinamiche considerate sono la diffusione e le interazioni di legame/scollegamento, tuttavia, in linea di principio le proteine possono anche muoversi attraverso il flusso, cioè, Questo potrebbe essere dovuto al flusso del citoplasma o del nucleoplasma, o al trasporto lungo i filamenti nella cellula come i microtubuli da parte dei motori molecolari.

L’analisi è più semplice quando il recupero della fluorescenza è limitato dal tasso di diffusione nell’area sbiancata o dal tasso al quale le proteine sbiancate si slegano dai loro siti di legame nell’area sbiancata, e sono sostituite dalla proteina fluorescente. Esaminiamo questi due limiti, per il caso comune di sbiancamento di una proteina di fusione GFP in una cellula vivente.

Recupero della fluorescenza limitato dalla diffusioneModifica

Per un punto di sbiancamento circolare di raggio w {displaystyle w}

e recupero dominato dalla diffusione, la fluorescenza è descritta da un’equazione derivata da Soumpasis (che coinvolge funzioni di Bessel modificate I 0 {displaystyle I_{0}}

e I 1 {displaystyle I_{1}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) {\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}{sinistra(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\destra)}

con τ D {displaystyle \tau _{D}}

la scala di tempo caratteristica per la diffusione, e t {\displaystyle t}

è il tempo. f ( t ) {displaystyle f(t)}

è la fluorescenza normalizzata (va a 1 come t {displaystyle t}

va all’infinito). La scala dei tempi di diffusione per una macchia sbiancata di raggio w {displaystyle w}

è τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, con D il coefficiente di diffusione.

Nota che questo è per un candeggio istantaneo con un profilo di funzione a gradini, cioè la frazione f b {displaystyle f_{b}

della proteina che si assume essere sbiancata istantaneamente al tempo t = 0 {displaystyle t=0}

è f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, e f b ( r ) = 0 , r > w {displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, per r {displaystyle r}

è la distanza dal centro dell’area sbiancata. Si assume anche che il recupero possa essere modellato dalla diffusione in due dimensioni, che è anche uniforme e isotropa. In altre parole, che la diffusione avvenga in un mezzo uniforme, quindi la costante di diffusione effettiva D è la stessa ovunque, e che la diffusione sia isotropa, cioè avvenga alla stessa velocità lungo tutti gli assi del piano.

In pratica, in una cella nessuna di queste ipotesi sarà strettamente vera.

1. Lo sbiancamento non sarà istantaneo. In particolare se è richiesto un forte sbiancamento di una vasta area, lo sbiancamento può richiedere una frazione significativa della scala temporale di diffusione τ D {displaystyle \tau _{D}}
   

   . Quindi una frazione significativa della proteina sbiancata si diffonderà fuori dalla regione sbiancata effettivamente durante lo sbiancamento. Non tenere conto di questo introdurrà un errore significativo in D.

2. Il profilo sbiancato non sarà una funzione radiale a gradini. Se il punto sbiancato è effettivamente un singolo pixel, allora lo sbiancamento in funzione della posizione sarà tipicamente limitato dalla diffrazione e determinato dall’ottica del microscopio confocale a scansione laser utilizzato. Questa non è una funzione di passo radiale e varia anche lungo l’asse perpendicolare al piano.
3. Le cellule sono naturalmente tridimensionali e non bidimensionali, come il volume sbiancato. Trascurare la diffusione fuori dal piano (che consideriamo il piano xy) sarà un’approssimazione ragionevole solo se la fluorescenza si recupera prevalentemente attraverso la diffusione in questo piano. Questo sarà vero, per esempio, se un volume cilindrico viene sbiancato con l’asse del cilindro lungo l’asse z e con questo volume cilindrico che attraversa l’intera altezza della cella. Allora la diffusione lungo l’asse z non causa il recupero della fluorescenza poiché tutte le proteine sono sbiancate uniformemente lungo l’asse z, e quindi trascurarla, come fa l’equazione di Soumpasis, è innocuo. Tuttavia, se la diffusione lungo l’asse z contribuisce al recupero della fluorescenza, allora bisogna tenerne conto.
4. Non c’è motivo di aspettarsi che il citoplasma o il nucleoplasma delle cellule siano completamente uniformi o isotropi dal punto di vista spaziale.

Quindi, l’equazione di Soumpasis è solo un’utile approssimazione, che può essere utilizzata quando le ipotesi elencate sopra sono buone approssimazioni alla situazione reale, e quando il recupero della fluorescenza è effettivamente limitato dalla scala temporale di diffusione τ D {\displaystyle \tau _{D}}

. Si noti che solo perché la Soumpasis può essere adattata adeguatamente ai dati non implica necessariamente che le ipotesi siano vere e che la diffusione domini il recupero.

Recupero limitato dalla reazioneModifica

L’equazione che descrive la fluorescenza in funzione del tempo è particolarmente semplice in un altro limite. Se un gran numero di proteine si lega a siti in un piccolo volume tale che il segnale di fluorescenza è dominato dal segnale delle proteine legate, e se questo legame è tutto in un singolo stato con un tasso di spegnimento koff, allora la fluorescenza in funzione del tempo è data da

f ( t ) = 1 – e – k off t {\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{{text{off}}}t}

Nota che il recupero dipende solo dalla costante di tasso per lo slegamento, koff. Non dipende dal tasso di legame. Anche se dipende da una serie di ipotesi

1. Il tasso di on deve essere sufficientemente grande perché la concentrazione locale della proteina legata superi di molto la concentrazione locale della proteina libera, e quindi ci permette di trascurare il contributo a f della proteina libera.
2. La reazione è una semplice reazione bimolecolare, dove la proteina si lega a siti localizzati che non si muovono significativamente durante il recupero
3. Lo scambio è molto più lento della diffusione (o qualsiasi meccanismo di trasporto sia responsabile della mobilità), poiché solo allora la frazione che diffonde recupera rapidamente e poi agisce come fonte di proteina fluorescente che si lega e sostituisce la proteina sbiancata legata e quindi aumenta la fluorescenza. Con r il raggio del punto sbiancato, questo significa che l’equazione è valida solo se la vita legata 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{\text{off}}>>r^{2}/D}
   

   .

Se tutte queste ipotesi sono soddisfatte, allora l’adattamento di un esponenziale alla curva di recupero darà la costante di velocità off, koff. Tuttavia, altre dinamiche possono dare curve di recupero simili agli esponenziali, quindi l’adattamento di un esponenziale non implica necessariamente che il recupero sia dominato da una semplice reazione bimolecolare. Un modo per distinguere tra il recupero con un tasso determinato dal non legame e il recupero che è limitato dalla diffusione, è quello di notare che il tasso di recupero per il recupero limitato dal non legame è indipendente dalla dimensione dell’area sbiancata r, mentre scala come r – 2 {\displaystyle r^{-2}}

, per il recupero limitato alla diffusione. Così, se un’area piccola e una grande sono sbiancate, se il recupero è limitato da unbinding allora i tassi di recupero saranno gli stessi per le due dimensioni dell’area sbiancata, mentre se il recupero è limitato dalla diffusione allora sarà molto più lento per l’area sbiancata più grande.

Diffusione e reazioneModifica

In generale, il recupero della fluorescenza non sarà dominato né dalla semplice diffusione isotropa, né da un singolo tasso di disassociazione semplice. Ci saranno sia diffusione che legame, e infatti la costante di diffusione può non essere uniforme nello spazio, e ci può essere più di un tipo di siti di legame, e questi siti possono anche avere una distribuzione non uniforme nello spazio. Anche i processi di flusso possono essere importanti. Questo comportamento più complesso implica che un modello con diversi parametri è necessario per descrivere i dati; i modelli con solo una singola costante di diffusione D o una singola costante di velocità off, koff, sono inadeguati.

Ci sono modelli sia di diffusione che di reazione. Sfortunatamente, una singola curva FRAP può fornire prove insufficienti per adattarsi in modo affidabile e unico ai dati sperimentali (possibilmente rumorosi). Sadegh Zadeh et al. hanno dimostrato che le curve FRAP possono essere adattate da diverse coppie di valori della costante di diffusione e della costante di reazione, o, in altre parole, che gli adattamenti alla FRAP non sono unici. Questo è in fit a tre parametri (costante di on-rate, costante di off-rate e costante di diffusione). I fit che non sono unici, non sono generalmente utili.

Quindi, per i modelli con un certo numero di parametri, un singolo esperimento FRAP può essere insufficiente per stimare tutti i parametri del modello. Allora sono necessari più dati, per esempio, sbiancando aree di dimensioni diverse, determinando alcuni parametri del modello in modo indipendente, ecc.

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