Risultati

Analisi dei campioni clinici.

Nel settembre 2006, il virus dell’influenza A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) è stato isolato da diversi suini di 5-6 settimane con broncopolmonite multifocale in un allevamento commerciale di suini di più fornitori. Le lesioni polmonari comprendevano una broncopolmonite purulenta moderata, da subacuta a cronica, e una polmonite interstiziale con bronchiolite e peribronchite. Il tessuto polmonare era negativo al virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRSV), al circovirus suino tipo 2 (PCV2) e al Mycoplasma hyopneumoniae, ma era positivo allo Streptococcus suis. A causa delle caratteristiche lesioni simili all’influenza e dei segni clinici della polmonite, l’omogenato di tessuto polmonare è stato inoculato su cellule di rene canino Madin-Darby (MDCK). Gli effetti citopatici sono stati rilevati il giorno 3 dopo l’inoculazione (p.i.). Il gene della nucleoproteina del virus dell’influenza (NP) è stato rilevato nelle cellule infettate tramite RT-PCR. Il virus non ha reagito con gli antisieri suini di riferimento (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) nei test di inibizione dell’emoagglutinazione (HI) e la RT-PCR multiplex non ha rilevato alcun gene H1N1 o H3N2 (14). Il virus è stato presentato al National Animal Disease Center (NADC) nel febbraio 2007 per la sottotipizzazione e il sequenziamento.

Dopo che l’isolato di settembre è stato sottotipizzato e sequenziato (descritto di seguito), una ricerca dei registri dei casi ha rivelato che un altro isolato influenzale “non tipizzabile” era stato presentato nell’aprile 2006. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) era stato isolato da un maiale di 12 settimane con una malattia respiratoria in un’altra azienda commerciale di suini da allevamento. Le lesioni polmonari erano istopatologicamente caratteristiche dell’influenza suina (grave infiammazione subacuta degli alveoli e dei bronchi con necrosi delle cellule epiteliali bronchiali e metaplasia). Il polmone era negativo per PRRSV, PCV2 e M. hyopneumonia ma era positivo per il virus A dell’influenza mediante RT-PCR (specifico per il gene NP) e S. suis. Il virus è stato sottoposto al NADC nel marzo 2007 per la sottotipizzazione e il sequenziamento.

Sottotipizzazione e analisi filogenetica.

Per identificare e caratterizzare entrambi i virus dell’influenza, sono stati condotti il sequenziamento dell’acido nucleico e l’analisi molecolare e filogenetica. Entrambi i virus sono stati sequenziati direttamente da isolati a basso passaggio utilizzando cellule MDCK, e le sequenze sono state confermate dopo la purificazione delle placche e il risequenziamento. Sono stati identificati come virus H2N3 dalla sequenza nucleotidica e da una ricerca BLAST dell’Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov). Il segmento del gene HA di Sw/4296424 corrispondeva più da vicino a quelli dei virus H2 isolati da germani in Nord America. Il suo segmento NA era strettamente legato a quello di un virus dell’influenza aviaria H4N3 (AIV) isolato da alzavole blu (98,3% di identità). Con l’eccezione del gene della polimerasi acida (PA), i suoi geni interni sono stati derivati dai virus contemporanei dell’influenza suina a tripla gravità attualmente presenti negli Stati Uniti. Questi virus portano geni interni di origine umana (PB1), aviaria (PB2, PA) e suina (Tabella 4). Il suo segmento PA era identico al 99,2% a quello dell’AIV H6N5 isolato dalle anatre domestiche (Tabella 4). I virus Sw/2124514 e Sw/4296424 mostravano un’identità di sequenza nucleotidica totale del 99,3-99,9% (Tabella 5). Entrambi gli isolati sono stati ripetutamente clonati a placche, ritestati e confermati dal sequenziamento come appartenenti al sottotipo H2N3. Il sottotipo H2N3 è stato confermato sierologicamente mediante test di inibizione dell’emoagglutinazione e della neuraminidasi. L’analisi filogenetica basata sui geni HA e NA ha mostrato che questi due virus appartengono al lineage aviario americano che è distinto dai ceppi aviari eurasiatici e dai virus H2N2 isolati dall’uomo dopo la pandemia influenzale del 1957 (Fig. 1).

Analisi molecolare delle proteine di superficie HA e NA.

I virus dell’influenza A contengono due proteine di superficie: l’HA è la glicoproteina che si lega al recettore e alla membrana e l’NA è un enzima che distrugge il recettore. L’HA virale è un fattore critico della specificità di specie ospite dei virus dell’influenza (15). Per caratterizzare i residui all’interno dell’HA che possono essere associati all’adattamento di un virus aviario all’ospite mammifero, abbiamo confrontato le sequenze aminoacidiche dell’HA suina con quelle dei virus aviari putativi di riferimento. Il confronto molecolare delle molecole HA dei due isolati H2N3 suini ha rivelato che differiscono dal virus H2N3 di riferimento putativo isolato dai germani reali per sei sostituzioni di aminoacidi comuni (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I e L506V) (Tabella 6). La sostituzione Q226L è stata trovata in entrambi gli isolati suini H2N3, mentre la posizione 228 conteneva G, identica alla sequenza di consenso aviaria (Tabella 1) (16). Al contrario, le molecole HA umane del sottotipo H2 contengono 226L e 228S, mentre i primi isolati H2 umani contengono 226L e 228G (Tabella 1), simili agli isolati suini. Le posizioni 36N, 274I, 316I e 419I sono uniche per i due isolati suini H2N3 (Tabella 6), mentre le rispettive posizioni negli isolati umani e aviari descritti nella Fig. 1 a sono 36D, 274T, 316V e 419L. Per gli isolati dell’influenza descritti nella Fig. 1 a, la posizione 506V e’ conservata tra gli umani, due isolati suini H2N3, e gli isolati aviari, tranne che per A/mallard/Alberta/2004 (H2N3) come mostrato nella tabella SI 6. Due cambiamenti aminoacidici comuni nella sequenza aminoacidica NA di entrambi gli isolati suini sono stati trovati se confrontati con il virus H4N3 di riferimento isolato dall’alzavola azzurra: H47Y e H253Y (Tabella 7). La posizione 47Y in entrambi gli isolati suini H2N3 è la stessa del rispettivo aminoacido negli isolati aviari eurasiatici raffigurati in Fig. 1 b; al contrario, la posizione negli isolati aviari nordamericani è 47H. La posizione 253Y è unica per gli isolati H2N3 suini, e la posizione 253H è conservata negli isolati aviari eurasiatici e nordamericani raffigurati in Fig. 1 b. È interessante notare che Sw/4296424 (H2N3), isolato 5 mesi dopo Sw/2124514 (H2N3), aveva due sostituzioni aggiuntive (P162S e L321V) nella molecola HA, e aveva tre sostituzioni aggiuntive (V30I, I49T, e A135T) nella molecola NA rispetto alla HA e NA di Sw/2124514 (tabelle SI 6 e 7). La posizione 30I (Sw/4296424) nella molecola NA è simile agli isolati eurasiatici, mentre la posizione 30V (Sw/2124514) è conservata negli isolati aviari nordamericani.