MUCUS HYPERSECRETION AND CHRONIC RESPIRATORY DISEASE

Hypersecretion of mucus into the airways is an important contributor to morbidity and mortality in many patients with severe chronic lung diseases, such as chronic pulmonary obstructive disease (COPD), asthma, and cystic fibrosis.35 Un eccesso di muco nelle vie aeree può limitare il flusso d’aria; e la sua presenza è un particolare fattore di rischio per quei pazienti con BPCO che sono inclini alle infezioni del torace. La BPCO è una grave malattia infiammatoria cronica delle vie respiratorie che comprende tre condizioni, vale a dire la bronchite cronica (ipersecrezione di muco nelle vie aeree di lunga durata), la malattia delle piccole vie aeree e l’enfisema.36 La sua prevalenza e il suo peso economico sono in aumento in tutto il mondo.37,38 Nella BPCO, i pazienti con ipersecrezione cronica di muco hanno un rischio significativamente maggiore di ospedalizzazione e morte rispetto ai pazienti senza una marcata componente bronchitica.39,40 Gli attuali trattamenti per la BPCO sono palliativi e non arrestano la progressione della malattia,41 e non esiste un trattamento specifico per l’ipersecrezione di muco.42 In assenza di una terapia efficace per qualsiasi aspetto della fisiopatologia della BPCO, lo sviluppo di trattamenti per l’ipersecrezione di muco è garantito. La capacità di eliminare il muco dai polmoni, attraverso il movimento delle ciglia delle vie aeree, dipende dalla sua viscosità ed elasticità. Queste proprietà sono determinate dalla proporzione di glicoproteine muciniche, in peso, che il muco contiene.43 MUC5AC e MUC5B sono le principali mucine nelle secrezioni delle vie aeree umane sia normali che patologiche.44 Nei pazienti con BPCO, i livelli delle mucine MUC5AC e MUC5B sono aumentati nel muco respiratorio, anche se in proporzione viene secreta più MUC5B.45 Le mucine sono secrete nelle vie aeree dalle cellule del pidocchio nell’epitelio e dalle ghiandole sieromucose nella sottomucosa.43 Una possibilità per inibire la secrezione di muco è quella di utilizzare l’attività inibitoria delle neurotossine endopeptidasi clostridiane sulla fusione delle vescicole, mirata alle cellule secernenti mucina delle vie aeree utilizzando un appropriato ligando di targeting.

Per studiare se un’endopeptidasi clostridiale adeguatamente mirata potesse scindere le proteine SNARE nelle cellule epiteliali respiratorie umane, e quindi inibire la secrezione di muco, è stata generata una proteina di fusione da un gene ricombinante che codifica il dominio LHN di BoNT/C e EGF, designato EGF-LHN/C, per mirare ai recettori EGF sulle cellule secernenti mucina.34 EGF è stato scelto come prototipo di ligando per la creazione di tale proteina di fusione perché i recettori EGF sono presenti sulle cellule epiteliali respiratorie umane46,47 e sono upregolati nell’epitelio delle vie aeree di pazienti con asma e BPCO48 , così come i fumatori49 . La proteina di fusione ricombinante EGF-LHN/C ha scisso la relativa proteina SNARE sintaxina in una linea cellulare metastatica mucoepidermoide umana, le cellule H292, in vitro in modo concentrazione-dipendente.34 Pretrattare le cellule H292 con EGF-LHN/C inibisce il rilascio stimolato di mucina in risposta a uno stimolo combinato di EGF e fattore di necrosi tumorale-α (TNFα) in modo concentrazione-dipendente, con un IC50 di circa 0,4 nM (Fig. 28-1). Questo si confronta molto bene con l’effetto inibitorio precedentemente riportato di EGF-LHN/C sul rilascio di mucina stimolata da un’altra linea cellulare epiteliale respiratoria, la linea cellulare alveolare umana di tipo II A549, in risposta allo stesso stimolo.34 In entrambi i tipi di cellule, non c’era alcun effetto rilevabile di EGF-LHN/C sul livello basale di secrezione di mucina. L’inibizione della secrezione di mucina da parte di EGF-LHN/C è dovuta alla consegna mirata della sua attività endopeptidasica attraverso il recettore EGF, e non è il risultato della citotossicità cellulare o dell’antagonismo del recettore o della downregulation.34 EGF-LHN/C è anche in grado di inibire il rilascio di mucina stimolata dalle cellule A549 in risposta a un cocktail stimolante di citochine, una combinazione di 1 ng/mL di interferone (IFN)-γ, TNFα e interleuchina (IL)-1β, chiamata cytomix (Fig. 28-2). Così, l’effetto di EGF-LHN/C sul rilascio di mucina stimolata dalle cellule epiteliali respiratorie è indipendente dalla natura precisa dello stimolo utilizzato. L’esame istologico mostra che la mucina è trattenuta all’interno delle cellule trattate (Fig. 28-3). Le cellule di controllo contengono mucina intracellulare colorata, mentre le cellule stimolate mostrano una colorazione marcatamente ridotta, indicando la secrezione di mucina. Le cellule stimolate pretrattate con EGF-LHN/C mostrano una colorazione intracellulare trattenuta, indicando l’inibizione della secrezione da parte di EGF-LHN/C. Per valutare la risposta delle cellule a tale ritenzione intracellulare di mucina, è stato misurato l’effetto del pretrattamento con EGF-LHN/C sui livelli di mRNA MUC5AC come indicatore della sintesi di mucina. Il pretrattamento EGF-LHN/C è associato a un’inibizione concentrazione-dipendente dell’espressione di mRNA di MUC5AC indotta da EGF-TNFα, con un valore IC50 di ∼0,1 nM (Fig. 28-4). Come per l’inibizione del rilascio di mucina stimolata dalle cellule, questo effetto di EGF-LHN/C è dovuto alla consegna mirata della sua attività endopeptidasica attraverso il recettore EGF, perché né un LHN/C privo di un ligando EGF per indirizzarlo al recettore EGF né una forma mutata della proteina di fusione in cui il dominio endopeptidasico è stato inattivato da tre cambiamenti di residui nella regione catalitica (EGF-TE-LHN/C) inibiscono l’espressione di mRNA MUC5AC. Questo effetto di EGF-LHN/C sull’espressione dell’mRNA di MUC5AC suggerisce l’esistenza di un possibile meccanismo di feedback negativo tra il rilascio di mucina e la sintesi di mucina nelle cellule epiteliali respiratorie, e anche che l’espressione genica si abbassa in risposta all’inibizione della secrezione da parte di una endopeptidasi clostridiale ricombinante.

Le proteine di fusione di endopeptidasi clostridiali ricombinanti che possono inibire la secrezione di muco, come esemplificato da EGF-LHN/C, hanno il potenziale per lo sviluppo come proteine terapeutiche per il trattamento della BPCO, della bronchite cronica, della fibrosi cistica e di altre condizioni respiratorie croniche che coinvolgono la produzione eccessiva di muco nelle vie aeree. La longevità dell’attività della proteina significherebbe che il prodotto dovrebbe essere inalato solo di rado, rendendolo adatto al trattamento di malattie respiratorie croniche di questo tipo.