Cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC) e cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC): due metodi cromatografici liquidi a confronto diretto. Questo articolo discute le differenze tra le due tecniche con particolare enfasi sui requisiti dei rispettivi analiti.
I nomi fast protein liquid chromatography (FPLC) e high performance liquid chromatography (HPLC) offrono un indizio delle differenze tra questi metodi cromatografici. Mentre l’HPLC lavora ad alta pressione per analizzare piccoli composti chimici, la FPLC purifica grandi biomolecole come le proteine o il DNA. La cromatografia delle biomolecole è molto esigente e sensibile perché non possono sopportare alte temperature, alte pressioni o i solventi usati di solito nell’HPLC. Per queste ragioni, la separazione delle biomolecole richiede un approccio alternativo all’HPLC.
Diversi termini sono comunemente usati per la cromatografia liquida veloce delle proteine, come biocromatografia, bioseparazione o biopurificazione. Questa forma speciale di cromatografia viene applicata per purificare grandi biomolecole di diversi kilodalton (kDa) come proteine, nucleotidi o peptidi (Figura 1). L’obiettivo dell’utente della FPLC è quello di ottenere un prodotto il più possibile puro e nativo. Gli obiettivi dell’HPLC classica, d’altra parte, sono di identificare e qualificare gli analiti, di solito piccoli composti che vanno in dimensioni da pochi atomi fino a circa 3000 Da.
La sfida di ottenere una proteina pura da un estratto cellulare
Tipo, le biomolecole vengono purificate da cellule batteriche o eucariotiche, che sono piene di proteine, DNA, RNA e membrane cellulari. Quindi, la purificazione della proteina di interesse da un estratto cellulare può essere molto impegnativa. I biochimici applicano diversi trucchi: uno è quello di utilizzare proteine ricombinanti, che sono sovraespresse dalle cellule. La sovraespressione della proteina di interesse permette la purificazione in quantità maggiori. Il secondo trucco è quello di aggiungere un tag alla proteina di interesse, che è specificamente riconosciuto dalla resina (materiale della colonna). Le proteine senza un tag non si legano alla colonna ed eluiscono immediatamente, mentre la proteina desiderata si arricchisce e può essere separata facilmente.
Le biomolecole vengono purificate da lisati cellulari, il che significa volumi di campione molto più grandi rispetto all’HPLC analitico. Pertanto, per iniettare il campione vengono utilizzati anelli di campionamento più grandi o anche pompe con velocità di flusso più elevate. Inoltre, i materiali delle colonne FPLC e HPLC differiscono completamente. Per l’HPLC si utilizzano perle di silice con dimensioni delle particelle molto piccole e con una grande resistenza alle alte pressioni, mentre l’FPLC richiede agarosio o materiale polimerico con dimensioni delle particelle più grandi per la maggior parte dei metodi. Le resine usate per la FPLC non sono stabili alla pressione come le perle di silice e sono molto sensibili alle bolle d’aria. Inoltre, non solo il materiale della colonna ma anche l’hardware della colonna è diverso. Nell’HPLC classico, si usano colonne in acciaio inossidabile resistenti alla pressione. Come già detto, la stabilità alla pressione non è importante per l’FPLC e quindi è possibile lavorare con colonne di vetro trasparenti e biocompatibili. Questo è un grande vantaggio perché l’utente può controllare la colonna per le bolle d’aria o monitorare le condizioni del materiale durante un ciclo di purificazione.
Biomolecole diverse, metodi di purificazione diversi
Le differenze nel materiale della colonna si riflettono anche nei metodi. Nell’HPLC analitico, la cromatografia in fase inversa con fasi stazionarie idrofobiche e fasi mobili polari è il metodo di scelta, mentre nella FPLC viene applicata una maggiore varietà di metodi (Figura 2). Un metodo FPLC è la cromatografia a esclusione di dimensione (SEC) in cui le molecole vengono separate in base alle loro dimensioni. Le molecole più piccole possono diffondersi nei pori delle perline, mentre le molecole più grandi passano attraverso la colonna quasi senza essere trattenute. Le molecole più piccole eluiscono più tardi dalla colonna generando un gradiente di queste molecole in base alle loro dimensioni. Un altro approccio di separazione è la cromatografia a scambio ionico. Le biomolecole sono separate e purificate secondo la loro carica specifica, che dipende dal pH del tampone. Più la proteina è carica, meglio si legherà alla resina di carica opposta. Per eluire la proteina dalla colonna, la concentrazione degli ioni di sale viene aumentata durante la corsa. Gli ioni di sale competono con la proteina per legarsi alla resina. Un altro importante metodo FPLC è la cromatografia di affinità dove la molecola di interesse può legarsi specificamente alla colonna mentre le altre molecole non possono ed eluiranno senza legarsi. Qui vengono usate colonne con mezzi speciali che riconoscono la biomolecola desiderata. Una forma speciale di cromatografia di affinità è l’affinità di ioni metallici immobilizzati (IMAC). La proteina di interesse deve essere alterata geneticamente aggiungendo un tag alla proteina, che di solito consiste di sei istidine. La resina IMAC riconosce specificamente questo “Hisâtag”. L’eluizione avviene aumentando la concentrazione di imidazolo che compete con le proteine con tag His. Inoltre, le proteine possono anche essere separate in base alla loro idrofobicità specifica utilizzando il metodo di separazione per interazione idrofobica. La resina è composta in modo tale che le proteine più idrofobiche si legheranno più fortemente alla colonna e saranno eluite diminuendo il gradiente salino.
Per purificare una proteina desiderata, di solito si usa una combinazione di metodi. Nella prima fase, la cosiddetta fase di “cattura”, la proteina viene purificata dall’estratto grezzo. Tipicamente, la cromatografia di affinità è usata per questa prima fase della purificazione. Il secondo passo, il passo “intermedio”, rimuove ulteriori contaminazioni mediante cromatografia a scambio ionico o interazione idrofobica. Lo scopo della fase finale di “lucidatura” – di solito una fase di cromatografia di esclusione dimensionale – è quello di sbarazzarsi di tutte le impurità rimanenti per ottenere un prodotto ad alta purezza. Questa strategia di purificazione delle proteine dipende totalmente dalla biomolecola specifica. In alcuni casi, una purificazione in due fasi può essere sufficiente. Più metodi vengono combinati, più la proteina di interesse viene persa durante la purificazione, ma si può ottenere una maggiore purezza.
Dopo la purificazione, il campione ottenuto può essere analizzato per purezza, concentrazione e funzione o attività enzimatica usando HPLC, elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecil-solfato di sodio (SDS-PAGE), saggi di attività enzimatica o spettrometria di massa.
Requisiti della FPLC
Le proteine sono composte da aminoacidi allineati in una catena. Questa catena è piegata in una struttura tridimensionale, che è la chiave della funzione e dell’attività di ogni proteina. Pertanto, è molto importante mantenere questa struttura proteica durante il processo di purificazione. Fattori esterni come l’alta temperatura, l’alta pressione, il pH estremo o i solventi possono disturbare la struttura della proteina e sono quindi evitati nella FPLC. La temperatura di lavoro per le proteine è solitamente di 4 °C. Questo è il motivo per cui una macchina FPLC è spesso collocata all’interno di una camera fredda o di una stanza fredda dove è esposta non solo alla bassa temperatura ma anche all’umidità di condensazione. I componenti di un sistema FPLC devono essere appositamente progettati per queste condizioni. Inoltre, i componenti FPLC incontrano un’ulteriore sfida, ovvero le soluzioni tampone saline che vengono utilizzate come eluenti. Di solito vengono scelti un pH isosmotico e concentrazioni di sale simili all’ambiente cellulare. I sistemi di cromatografia sono generalmente in acciaio inossidabile. Da un lato, il sale nei tamponi può portare alla corrosione e dall’altro gli ioni metallici dell’acciaio inossidabile possono interferire con le proteine e disturbarne la struttura. Pertanto, è importante evitare l’acciaio inossidabile e utilizzare materiali biocompatibili come la ceramica di polietere etere chetone (PEEK) o il titanio quando si esegue la FPLC. Come i sistemi HPLC, anche i sistemi FPLC sono controllati da un software. Ci sono notevoli differenze tra il software FPLC e HPLC. Quest’ultimo viene utilizzato principalmente per analizzare i campioni e contiene molti strumenti analitici. In FPLC invece, non sono necessari molti strumenti analitici ed è comune generare metodi basati sul volume o anche sul volume della colonna (Figura 3). Per la maggior parte delle applicazioni FPLC, i metodi basati sul volume della colonna sono preferiti, rendendo facile l’upscaling. Il software FPLC è per lo più molto intuitivo e facile da usare e include il controllo diretto, che permette di regolare i parametri durante una corsa. In questo modo, l’utente può reagire alle diverse situazioni in modo molto spontaneo.
È quindi chiaro che ci sono grandi differenze tra queste due aree cromatografiche (Tabella 1). I metodi, l’hardware e il software differiscono notevolmente a seconda che la molecola venga analizzata o purificata. Per le applicazioni FPLC la natura sensibile dei campioni e l’ambizione di mantenerli il più nativi possibile aggiungono la sfida. Nel complesso, entrambe le tecniche sono aree molto interessanti che chiunque lavori nel campo dovrebbe conoscere.
Stephanie Runde si è laureata all’Università Tecnica di Monaco, Germania, con un diploma in biochimica. Ha ottenuto il suo dottorato alla Freie Universität di Berlino, in Germania, e attualmente lavora alla Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH come product manager per FPLC.