Nell’ultimo decennio, le tecniche chemiogenetiche e optogenetiche hanno rivoluzionato le neuroscienze integrative fornendo nuovi strumenti per manipolare reversibilmente l’attività di specifiche popolazioni o sistemi neurotrasmettitoriali con maggiore selettività (Sternson e Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al., 2017). Rispetto all’optogenetica, che permettono una modulazione neuronale veloce e fasica con alta risoluzione temporale, la chemiogenetica permette una modulazione più estesa dei sistemi, particolarmente utile per gli studi che si concentrano su fenomeni tonici (ad esempio, l’indagine dell’implicazione della dopamina nei processi motivazionali; Whissell et al., 2016). Tra gli strumenti chemiogenetici, i recettori designer attivati esclusivamente da farmaci designer (DREADDs) sono ampiamente utilizzati e sono indicati come un sistema biologico “lock-and-key” per la manipolazione selettiva dell’attività cellulare attraverso vie di segnalazione G-protein. Sviluppato per la prima volta in modo molto elegante dal gruppo di Roth (Armbruster et al., 2007), questo recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) è un recettore muscarinico: la serratura, che è stata mutata per rispondere solo al clozapina-N-ossido (CNO), la chiave, un metabolita derivato dell’antipsicotico atipico clozapina, altrimenti con, potenzialmente, nessuna attività farmacologica.

Tuttavia, dal 2016, alcune pubblicazioni hanno sollevato questioni preoccupanti riguardanti l’uso del CNO. In primo luogo, dosi relativamente elevate di CNO (10 mg/kg) somministrate per via sistemica possono avere attività farmacologica off-target, come evidenziato dall’induzione di effetti comportamentali in ratti e topi non mediati dai DREADD (MacLaren et al., 2016; Gomez et al., 2017; Baerentzen et al., 2019). Inoltre, Gomez et al. (2017) hanno dimostrato che il CNO non attraversa facilmente la barriera emato-encefalica, può esibire una bassa affinità di legame con i DREADD, ed è stato rimetabolizzato in clozapina, diventando il vero effettore dei DREADD. Sulla base di queste osservazioni sorprendenti, hanno suggerito l’uso diretto di basse dosi di clozapina (0.1 mg/kg) per attivare DREADDs invece di CNO. Tuttavia, l’uso di basse dosi di clozapina invece di grandi dosi di CNO che si convertono gradualmente in clozapina porta a due grandi limitazioni. In primo luogo, non è ovvio che la clozapina, in iniezione acuta o in diffusione prolungata, agisca sui DREADDs allo stesso modo (Mahler e Aston-Jones, 2018). In secondo luogo, poiché la clozapina è un agente antipsicotico atipico, ha numerosi bersagli endogeni come i recettori serotoninergici, muscarinici o dopaminergici, con affinità relativamente forti (Meltzer, 1989; Schotte et al., 1993; Brunello et al., 1995; Ashby e Wang, 1996; Armbruster et al., 2007) e probabilmente inducono effetti off-target, anche con basse dosi. Infatti, la dose di 0,1 mg/kg di clozapina raccomandata per gli esperimenti DREADD è stata trovata per aumentare significativamente il comportamento legato all’ansia nei topi (Manzaneque et al., 2002) così come nei ratti (un effetto che abbiamo anche osservato; R. Goutaudier e S. Carnicella, osservazioni non pubblicate), dove la clozapina colpisce anche la locomozione attraverso una potenziale sedazione e compromette la flessibilità cognitiva (Ilg et al, 2018).

Anche se il verificarsi di questi effetti può dipendere dalla specie, dal ceppo o dal sesso utilizzato, e può essere molto discreto (poiché non tutte le dimensioni comportamentali sono interessate); essi hanno il potenziale di interferire significativamente con le prestazioni degli animali in una varietà di compiti comportamentali. Elevato stress e ansia possono essere fattori confondenti negli studi sulla memoria o sul dolore, per esempio (Sousa et al., 2006; Sorge et al., 2014). Inoltre, il comportamento legato a droghe d’abuso o a disturbi psichiatrici come la schizofrenia, l’ansia o la flessibilità cognitiva può modificare l’intero fenotipo (Floresco et al., 2009; Koob e Schulkin, 2018). Sulla base di queste osservazioni, sono necessarie importanti precauzioni con la clozapina per evitare studi comportamentali distorti.

Una nuova molecola progettata specificamente per i DREADD sarebbe più selettiva? Il composto 21 (C21) è un ligando DREADD sintetico, sviluppato nel 2015 (Chen et al., 2015) e parzialmente caratterizzato in vitro e in vivo nel 2018 (Thompson et al., 2018). Ancora una volta, a basse dosi (<3 mg/kg), è stato descritto come privo di effetti off-target comportamentali e capace di alterare il comportamento degli animali che esprimono DREADD. Questo studio è stato rafforzato da Jendryka et al. (2019), che hanno condotto esperimenti farmacocinetici e farmacodinamici utilizzando topi e C21 (3 mg/kg). Hanno dimostrato che 30 min dopo la somministrazione di C21 la concentrazione della molecola nel CSF era >10 volte superiore all’EC50 stimato per l’attivazione di DREADD (CSF = 40 nm e EC50DREADDs = 3 nm), e senza retro-metabolizzazione in clozapina. Tuttavia, i risultati di un recente studio BioRxiv preprint in ratti, topi e macachi (Bonaventura et al., 2018) suggeriscono che, sebbene C21 esibisca una bassa penetranza cerebrale, una dose di 1 mg/kg può già modificare la funzione cerebrale nei topi wild-type. Inoltre, una debole affinità e occupazione per i DREADD è stata osservata in vitro in fette di cervello di ratto, così come in vivo in topi e macachi in uno studio di tomografia a emissione di positroni. Sulla base della stessa indagine sperimentale di C21, hanno proposto, come alternativa, altri due ligandi, JHU37152 e JHU37160, che possiedono una maggiore potenza in vivo per DREADDs e potenzialmente meno effetti off-target (Bonaventura et al., 2018). Sebbene questa nuova generazione di ligandi DREADD appaia promettente, a causa della loro novità, sono ancora poco caratterizzati e rimangono strutturalmente omologhi a clozapina e CNO. Una caratterizzazione esaustiva in indagini cellulari e comportamentali sarà quindi cruciale per escludere le potenziali insidie trovate per CNO.

Una soluzione alternativa per migliorare la selettività degli approcci chemiogenetici sarebbe quella di utilizzare un’altra combinazione di serratura e chiave. Come tale, il κ-opioid receptor-DREADD (KORD) è un GPCR inibitorio mutato derivato dal recettore κ-opioide umano (Vardy et al., 2015). Rispetto ai classici DREADD che legano clozapina, CNO, C21, o composti JHU, KORD è impegnato dalla salvinorina B, un metabolita drug-like dell’agonista KOR-selettivo salvinorina A. Anche se questo approccio chemogenetico è stato elegantemente utilizzato in combinazione con un DREADD attivatorio per creare un sistema “ON e OFF” all’interno della stessa popolazione neuronale (Vardy et al, 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), rimane marginalmente utilizzato perché riduce solo l’attività neuronale per un breve periodo di tempo (Aldrin-Kirk e Björklund, 2019). Inoltre, la salvinorina B esibisce una certa affinità per il KOR endogeno ad alte concentrazioni e non ha ancora beneficiato di una caratterizzazione approfondita come avviene attualmente per i composti legati al DREADD (Roth, 2016). Sostituire il GPCR con un canale ionico mutato, un altro recettore alternativo progettato chiamato ligand-gated ion channels (LGICs) è un’opzione sviluppata dal laboratorio Stenson (Magnus et al., 2011). Rispetto ai DREADD, gli LGIC combinano il dominio di legame al ligando di un recettore nicotinico mutato con il dominio del poro ionico di un altro recettore scelto per creare un canale ionico chimerico. Simile a DREADDs, questo canale ibrido è attivato da un piccolo agonista derivato dal chinuclidinyl benzamide, un agonista del recettore nicotinico α7 dell’acetilcolina, e permette lo scambio di ioni attraverso la membrana neuronale. Tra le altre limitazioni specifiche di questo approccio (Aldrin-Kirk e Björklund, 2019), condivide anche con i DREADD l’uso di un ligando farmacologico che può potenzialmente interagire con i recettori endogeni, a seconda delle condizioni sperimentali. Infine, tutte queste chiusure derivano da recettori endogeni e, in quanto tali, non riescono a liberarsi delle limitazioni intrinsecamente legate alla farmacologia.

Al di là di questi recenti sviluppi e delle domande che rimangono, occorre porsi una domanda cruciale: sarà mai trovata una chiave totalmente selettiva e inerte? Probabilmente no. È essenziale tenere a mente che i DREADD sono strumenti chemiogenetici che combinano genetica e farmacologia. Anche se gli approcci genetici offrono un potente controllo dell’espressione delle serrature (cioè dei DREADD) in specifiche popolazioni cellulari, o sottopopolazioni con approcci condizionali, essi derivano da GPCRs endogeni e, come tali, sono soggetti agli stessi limiti della farmacologia classica della chiave. È quindi improbabile che si trovino molecole che presentino un’alta affinità di legame per i DREADD senza affinità per alcuni dei numerosi recettori già presenti nel cervello e strettamente legati ai DREADD. Per esempio, la clozapina ha un’affinità molto alta per i DREADD, ma anche per il recettore serotoninergico 5-HT2 (Ki = 10-8 per entrambi; Armbruster et al., 2007; Gomez et al., 2017), e un’alta affinità per una vasta gamma di altri GPCR (Ki = 10-7 a 10-6; Armbruster et al., 2007). Anche i ligandi sintetici che sono specificamente progettati per questa tecnica chemiogenetica mostrano affinità sostanziali per i recettori endogeni. Per esempio, anche se JHU37152 e JHU37160 hanno un’affinità inferiore per i recettori 5-HT rispetto alla clozapina, hanno un profilo di bersaglio complessivo simile a questo farmaco, con un’affinità ancora maggiore per i recettori muscarinici (Bonaventura et al., 2018), suggerendo effetti off-target potenzialmente più forti. C21 mostra anche una maggiore affinità per il recettore istaminergico H1 rispetto ai DREADD (Ki > 10-8 e Ki = 10-7,2, rispettivamente; Thompson et al., 2018) e un maggiore potenziale di legame ai recettori oppioidi rispetto alla clozapina (Bonaventura et al., 2018). Per ridurre al minimo le insidie di questo potente approccio, indipendentemente dalla scelta della chiave, è necessario adottare precauzioni critiche (Fig. 1).

In primo luogo, prima di qualsiasi esperimento comportamentale, le condizioni sperimentali devono essere testate per trovare il miglior ligando e la dose ottimale o dosi, a seconda dell’approccio sperimentale. I DREADD non devono essere considerati come uno strumento chiavi in mano; gli esperimenti cellulari, neurochimici o elettrofisiologici dovrebbero essere eseguiti prima dello studio comportamentale (Mahler et al., 2014; Beloate et al., 2016; Boekhoudt et al., 2016) per confermare l’efficacia del ligando alla dose scelta nel sistema di interesse. Inoltre, devono essere inclusi anche animali di controllo privi di DREADD per verificare l’assenza di effetti neurobiologici aspecifici del ligando o del recettore in sé che potrebbe essere attivato da un neurotrasmettitore o avere un’attività costitutiva (Saloman et al., 2016).

In secondo luogo, quando possibile, due diversi ligandi DREADD dovrebbero essere testati per confermare che gli effetti comportamentali osservati sono specificamente mediati da DREADD. Le azioni farmacologiche specifiche su DREADD sarebbero simili, ma gli effetti off-target potrebbero essere diversi.

In terzo luogo, e il punto più critico, devono essere utilizzati controlli farmacologici convenzionali. Si deve applicare la stessa filosofia della farmacologia e, come per gli esperimenti neurobiologici, si devono integrare gruppi di animali transgenici senza espressione di DREADDs (ad esempio, vettori virali vuoti di DREADDs) per verificare gli effetti selettivi del ligando e della dose scelta (Smith et al., 2016, Campbell e Marchant, 2018; Mahler e Aston-Jones, 2018; per un esempio di studi sperimentali che seguono questo disegno, vedi anche Xia et al., 2017; Cope et al., 2019). Questa affermazione può sembrare banale, ma la ricerca di un ligando selettivo assoluto e l’attrattiva di questo approccio hanno già portato ad alcuni studi comportamentali troppo sicuri, a volte condotti in completa assenza di questo controllo.

In conclusione, i DREADD forniscono un modo preciso di manipolare i circuiti neurali e il comportamento, e permettono una grande alternativa all’optogenetica per manipolare tonicamente una specifica sottopopolazione cellulare, aprendo così nuove ed entusiasmanti strade di ricerca. Tuttavia, proprio come le proprietà termiche della luce in optogenetica possono portare a effetti aspecifici (vedi anche Owen et al., 2019), una maggiore precauzione è necessaria con la chemiogenetica, e i controlli standard devono essere obbligatori. I limiti di DREADD devono essere riconosciuti e si deve prendere tempo per evitare o controllare i possibili effetti off-target e per verificare che questo approccio non induca bias di per sé. Utilizzando i punti di forza della genetica e prestando attenzione alle debolezze della farmacologia, si massimizzerà il potenziale di questo approccio.