… (Zhang et al., 2009), ha causato gravi problemi per la caratterizzazione delle proteine Flv4 e Flv2. È stato inizialmente ipotizzato che tale associazione di membrana avvenga attraverso la proteina Sll0218, che è una proteina integrale di membrana con quattro eliche transmembrana previste. Tuttavia, questo si è rivelato non essere il caso come Flv4 in gran parte è rimasto nella frazione di membrana anche in assenza della proteina Sll0218 (il D fl v2, D sll0218-19, e D sll0218- 19/ fl ag – fl v4 mutanti) (dati non mostrati). Inoltre, la proteina Sll0218 è associata a un grande complesso di membrana indipendentemente dall’eterodimero Flv2/Flv4 (Figura 4). Infine, modificando il metodo di partizionamento a due fasi per la sottofrazione della membrana, la proteina Sll0218 è stata localizzata alla membrana tilakoide, mentre Flv4 e Flv2 in quel sistema tendono ad associarsi con la membrana plasmatica (Figura 2D). Quest’ultima associazione sembrava essere fortemente dipendente dai cationi (Figure 2B e 2C). Un comportamento simile è stato recentemente riportato per un’altra proteina Synechocystis, anche se il meccanismo di associazione alla membrana non è chiaro (Carmel et al., 2011). Sulla base del modello Flv2/Flv4 eterodimero e l’allineamento di sequenza, alcuni siti putativi di legame del metallo che coinvolgono His, Asp, e residui Glu sono stati riconosciuti sulla superficie della proteina. Metalli legati alla superficie sono stati trovati anche in strutture omologhe. Per esempio, il dominio fl avodoxin-like di Synechococcus sp (PDB ID: 3HLY) ha un Ca 2+ , e M. thermoacetica FprA (PDB ID: 1YCF, 1YCG, e 1YCH) ha diversi Zn 2+ legati in superficie (Silaghi-Dumitrescu et al., 2005). Gli ioni metallici sulle strutture provengono dalla soluzione di cristallizzazione, ma alcuni dei residui leganti il metallo sono conservati o sostituiti con residui simili nel nostro modello (vedi Tabella supplementare 2 online). Presi insieme, questi residui potrebbero essere responsabili per l’associazione cationico-dipendente di Flv2 e Flv4 alla frazione di membrana. Sulla base dell’analisi del potenziale elettrostatico di superficie del modello, il monomero Flv4 ha una superficie più carica negativamente (Figura 8B) e contiene più siti di legame metallico putativo sulla superficie che il monomero Flv2 (vedi Tabella supplementare 2 online). Tenendo conto del fatto che la concentrazione di cationi utilizzati nel buffer di isolamento è molto più alto rispetto alle reali condizioni fisiologiche (Figure 2B a 2D), il legame di Flv2/Flv4 alla membrana in vivo potrebbe essere transitoria e reversibile. La specializzazione di Flv2/Flv4 alla membrana plasmatica al momento della rottura della cellula (Figura 2D) potrebbe anche essere legata alla sua carica superficiale, poiché la superficie interna della membrana plasmatica è più negativa rispetto alla membrana tilakoide destra-side-out (Barber, 1982; Körner et al., 1985). Tuttavia, la carica superficiale della membrana tilaconica può essere drammaticamente cambiata durante la fotosintesi, il che può mediare il legame di transito di Flv2/Flv4 anche con la membrana tilaconica. La proteina Sll0218 è stata localizzata senza ambiguità in un complesso ad alta massa molecolare nella membrana tilakoide. Tuttavia, lo strano comportamento della proteina Sll0218 nel sistema convenzionale di partizionamento a due fasi delle sottofrazioni di membrana ha suggerito che la proteina Sll0218 non è distribuita uniformemente nella membrana tilaconica. È associata a un grande complesso, che è solo marginalmente più piccolo del principale dimero PSII. La diminuzione del rapporto tra il dimer PSII e i complessi monomerici PSII avviene solo nei mutanti privi della proteina Sll0218 (D sll0218-19 e D fl v4), ma non in D fl v2 (Figura 5, Tabella 1). Pertanto, postuliamo che la Sll0218 può funzionare come un chaperon nella stabilizzazione del dimero PSII assemblato in condizioni di livello di aria di CO 2 . Anche se il complesso PSII è stato isolato sia in forma monomerica che dimerica (Rögner et al., 1987; Hankamer et al., 1997; Adachi et al., 2009), è ampiamente accettato che in vivo il complesso PSII funziona come un dimero nei cianobatteri così come nelle piante superiori (Hankamer et al, 1999; Kuhl et al., 2000), mentre il PSII monomerico può essere un intermedio del normale assemblaggio e riparazione del PSII (Aro et al., 2005; Nixon et al., 2010). Anche se la dimerizzazione in vivo del PSII nei cianobatteri è stata messa in discussione a causa dell’uso di detergenti per la solubilizzazione e l’analisi in vitro dei complessi tilakoidi (Takahashi et al., 2009; Watanabe et al., 2009), ci sono prove convincenti per la formazione di dimeri attraverso approcci mutanti. Infatti, le piccole sub-unità PSII PsbM e PsbT, situate nell’interfaccia monomero-monomero, si sono dimostrate cruciali per il corretto assemblaggio e la riparazione del PSII (Ohnishi e Takahashi, 2001; Iwai et al., 2004; Bentley et al., 2008). Poiché la proteina Sll0218 è espressa solo in condizioni di bassa (cioè, livello dell’aria) CO 2, postuliamo che l’assemblaggio dei dimeri PSII differisce a seconda della presenza o assenza delle proteine Sll0218 (vedi sotto). L’ottimizzazione della fotosintesi richiede una stretta regolazione tra l’assorbimento e la conversione dell’energia solare in energia chimica e il suo utilizzo da parte delle vie metaboliche a valle. Per i fotoautotrofi acquatici, come i cianobatteri, la CO 2 è un substrato essenziale ma spesso insufficiente. In ambienti naturali, l’insufficiente disponibilità di CO 2 , specialmente se combinata con un’elevata irradiazione, comporta un’elevata pressione di eccitazione sui fotosistemi (Huner, 1998) e limita il tasso di fotosintesi. Per far fronte a ciò, diversi meccanismi di concentrazione di CO 2 sono fortemente indotti in condizioni di basso Ci nei cianobatteri per aumentare la concentrazione di CO 2 intorno alla ribulosio-1,5-bis-fosfato carbossilasi/ossigenasi e allo stesso tempo indurre un flusso ciclico di elettroni per generare più ATP (rivisto in Kaplan e Reinhold, 1999; Giordano et al., 2005; Badger et al., 2006; Price et al., 2008). Studi di microarray e di proteomica hanno rivelato uno stimolo a bassa CO 2 (Wang et al., 2004; Eisenhut et al., 2007; Battchikova et al., 2010), comprendente anche l’operone sll0217-19 (fl v4- fl v2), che è regolato altrettanto fortemente quanto i geni inducibili del meccanismo di concentrazione della CO 2 . I geni fl v2 e fl v4 hanno anche un’elevata risposta alla luce (Hihara et al., 2001; Zhang et al., 2009). I mutanti di inattivazione fl v4 e fl v2 hanno rivelato un’alta suscettibilità alla fotoinibizione del PSII in condizioni di livello di CO 2 in aria (Zhang et al., 2009). Inoltre, i nostri recenti studi sull’espressione dell’operone hanno rivelato una stretta regolazione di questo operone fl v4- fl v2 da parte di piccoli RNA regolatori (M. Eisenhut, J. Georg, S. Klähn, I. Sakurai, H. Silén, P. Zhang, W.R. Hess, e E.-M. Aro, dati non pubblicati). Tale forte induzione e regolazione da parte degli RNA antisenso dell’operone fl v4- fl v2 insieme alla protezione osservata del PSII sotto il livello atmosferico di CO e l’alta …