Procedure di Immunoblotting

Questa tecnica analitica procede nei seguenti passi. Le proteine sono generalmente separate per dimensione usando l’elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato (SDS). Dopo questo, vengono trasferite su una membrana sintetica tramite metodi di blotting a secco, semi-secco o umido. Nel campo elettrico generato da un alimentatore, le proteine rivestite di SDS caricate negativamente migrano verso l’elettrodo positivo. Mentre le proteine migrano fuori dal gel, vengono catturate su una membrana. Il legame delle proteine alla membrana è un meccanismo irreversibile. Le membrane possono essere di nitrocellulosa, polivinilidene difluoruro (PVDF) o nylon. La membrana può quindi essere bloccata con albumina di siero o soluzione di latte per prevenire il legame non specifico degli anticorpi. Questo è seguito dal sondaggio con anticorpi specifici per la proteina da studiare sulla membrana, un metodo che è simile all’immunoistochimica, ma senza bisogno di fissazione. Questa tecnica sfrutta la specificità inerente al riconoscimento antigene-anticorpo. La rilevazione viene tipicamente eseguita utilizzando anticorpi secondari legati a cromogeni o perossidi per catalizzare una reazione cromogenica o chemiluminescente.