A. Kaavamainen esitys DCX-domeeneja sisältävistä ihmis- ja hiiriproteiineista. DCX-domeenit, jotka muistuttavat enemmän DCX:n N-terminaalista toistoa, on merkitty vihreällä, kun taas ne, jotka muistuttavat enemmän C-terminaalista toistoa, on merkitty violetilla. Proteiinikinaasidomeenit on merkitty keltaisella. Risiinidomeeni on merkitty ruskealla. Ihmisen proteiinit ovat ylhäällä, hiiren proteiinit alapuolella. B. Kaavamainen esitys ihmisen ja hiiren DCX-domeenigeenien kromosomaalisesta sijainnista UCSC-paikan avulla .

Seriini-/treoniiniproteiinikinaasidomeenit löytyivät kolmesta ihmisen/hiiren proteiinista (DCLK, DCLK2 ja DCLK3), ja risiinidomeeni, jonka ennustetaan sitovan hiilihydraatteja, löytyi ihmisen/hiiren proteiinista, johon viitataan nimellä FLJ46154 . Ihmisen FLJ46154- ja DCDC2B-proteiinien rakenne erosi muista proteiineista, joissa on tandemtoistoja; ne sisälsivät toistoa, joka muistutti enemmän DCX:n C-terminaalista toistoa, joka esiintyi tämän proteiinin N-terminaalisessa osassa, ja toista toistoa, joka muistutti enemmän DCX:n N-terminaalista toistoa. Näiden kahden proteiinin hiiren ortologeissa oli vain yksi DCX-domeeni. Kaikki hiiren geenit sijaitsevat kromosomialueilla (kuva 1b), jotka ovat synteettisiä ihmisen ortologien kanssa (lisäkuva 2). Tähän sisältyy myös DCDC1:n ja BAC26042:n sijainti, mutta ne eivät kuitenkaan ole todellisia ortologeja, koska sekvenssin samankaltaisuus on hyvin vähäistä (52 %, 46 aminohappoa 86:sta aminohaposta) vain DCX-domeenin osalta, ja jäljempänä kuvattu fylogeneettinen ja evolutiivinen analyysi osoittaa, että ne ovat erilaisia. BAC26042 on ainutlaatuinen myös siksi, että se on fyysisesti lähellä FLJ46154:ää, sillä näiden kahden geenin välinen etäisyys on vain 2 kb, mikä viittaa siihen, että niillä saattaa olla yhteisiä säätelyelementtejä.

Tässä tutkimuksessa keskitytään DCX-domeeneihin, eikä se käsittele täyspitkiä proteiineja. Yksittäisille DCX-domeeneille tehtiin fylogeneettinen analyysi, jossa N- ja C-terminaaliset osat erotettiin toisistaan (kuva 2). Ihmisen ja hiiren DCX-domeenien fylogeneettisestä analyysistä ilmeni useita mielenkiintoisia piirteitä. Suurimmalla osalla ihmisen geeneistä oli hiiren ortologi. Kaksi geeniä ei noudata tätä sääntöä, koska niillä ei ole yksiselitteisiä ortologeja (ihmisen DCDC1 ja hiiren BAC26042). Lisäksi useimmissa tapauksissa N-terminaalisesti sijaitsevat DCX-domeenit muistuttivat enemmän muita N-terminaalisia domeeneja kuin saman proteiinin C-terminaalisia domeeneja. Kaksi jo mainittua poikkeusta olivat ihmisen DCDC2B ja FLJ46154. BLAT- ja fylogeneettisen analyysin yhdistävä sekvenssianalyysi tunnisti taulukossa 1 luetellut ortologiset sukulaisuussuhteet.

Maksimimmaisen todennäköisyyden (ML) fylogeneettisen puun, joka sisältää DCX-domeeniproteiineja ihmisestä ja hiirestä, bootstrap-arvot on merkitty.

Seuraavaksi laajensimme sekvenssianalyysia ottamalla mukaan useita muita kuin nisäkkäiden genomeja. Aluksi analyysi käsitti proteiinit, jotka löytyivät konservoitujen domainien tietokannasta CDD . Myöhemmin näitä hakuja laajennettiin laajoilla BLAST-, TBLASTN- ja BLAT-hauilla. BLAT-haun avulla lisättiin opossumin, rotan ja rhesusapinan sekvenssit. Cionan sekvenssit lisättiin käyttämällä TBLATN-analyysiä genomitietoja vastaan, ja mukaan otettiin vain EST:iä vastaavat sekvenssit. Näin ollen tähän fylogeneettiseen analyysiin sisältyi DCX-motiivia sisältäviä proteiineja ihmisestä, simpanssista, hiirestä, lehmästä, koirasta, kanasta, kalasta, matoista, hyönteisistä, sammakoista, sienistä ja merisimpukoista (moninkertaiset kohdistukset on esitetty lisäkuvassa 3). Tandem-DCX-domeeniproteiinien (67 proteiinia) analyysi johti juurruttamattomaan puuhun, jonka bootstrap-arvot on esitetty kuvassa 3.

ML-puu tandem-DCX-domeeniproteiineista eri lajeista. Bootstrap-arvot on merkitty.

Neljä proteiiniryhmää on helppo luokitella tandem DCX-domeenipuussa, joka sisältää 67 proteiinia. Ylhäältä alaspäin RP1:n ja RP1L1:n ryhmään kuuluvat ortologit sammakosta Xenopus laevis, kaloista (seeprakala Danio rerio ja pufferfish Tetraodon nigrovidis), kanasta, lehmästä, koirasta, hiirestä, rotasta, simpanssista ja ihmisestä. Toiseen ryhmään kuuluvat DCDC2A:n (joka tunnettiin aiemmin nimellä DCDC2, HUGO:n geeninimikkeistökomitean hyväksymä nimi) kaltaiset proteiinit nisäkkäiltä, mukaan lukien opossumi (pussieläin), sekä kanalta, kalalta, sammakolta ja yksinkertaisemmilta organismeilta, kuten ascidia Halocynthia roretzi ja merisimpukka Ciona intestinalis. Kolmannessa proteiiniryhmässä ei ole nisäkkäiden proteiineja, mutta se sisältää proteiineja sosiaalisesta ameebasta Dictyostelium discoideumista ja yhden proteiinin Ciona intestinaliksesta. Samankaltaisia proteiineja tunnistettiin hedelmäkärpäsestä, Drosophila melanogasterista, malariahyttysestä, Anopheles gambiae, ja mehiläisestä, Apis mellifera. Lisäksi tässä ryhmässä havaittiin kaksi samanlaista proteiinia matoista Caenorhabditis elegans (ZYG-8) ja Caenorhabditis briggsae. Neljänteen proteiiniryhmään kuuluvat DCX:n, DCLK:n ja DCLK2:n kaltaiset proteiinit. Tähän ryhmään kuului nisäkkäiden, kanan ja kalojen proteiineja sekä yksi proteiini Ciona intestinaliksesta. Tätä kahden domeenin proteiinien analyysia seurasi N- ja C-terminaalisen domeenin proteiinien analyysi (lisäkuvat 4-5). N-ryhmässä analysoitiin sata seitsemää proteiinia ja C-ryhmässä sata yhtä proteiinia, mikä viittaa siihen, että DCX:n N-terminaalisen osan kaltaisia proteiineja on hieman enemmän. Yleinen jako neljään ryhmään säilyi. N-terminaalisen fylogeneettisen puun muodostavien proteiinien tarkastelussa havaittiin, että uusia proteiineja lisättiin lähinnä kolmanteen ryhmään, joka sisälsi Dictyostelium discoideum -proteiinin (johon kuului 8 jäsentä). Tähän ryhmään lisättiin myös kärpästen ja matojen proteiineja. Hedelmäkärpäsen genomi sisältää viisi DCX-proteiinia, joista neljä on yksittäisiä toistoja. Lisäksi tähän ryhmään lisättiin useita nisäkkäiden proteiineja. Ryhmään lisättiin 26 jäsentä N-ryhmässä ja 19 jäsentä C-ryhmässä. Tähän ryhmään kuului yksi proteiini yksisoluisesta organismista Plasmodium falciparum, malariaparasiitista.

C-terminaalisen fylogeneettisen puun muodostavien proteiinien tarkastelussa havaittiin ryhmä, joka sisälsi kaikki DCLK3-proteiinit. On huomattava, että tämä ryhmä on kokonaisuutena varsin erilainen kuin DCX, DCLK ja DCLK2. Tähän ryhmään kuuluvat proteiinit sisältävät yhden DCX-domeenin, ja ne ovat peräisin nisäkkäiltä (ihminen, simpanssi, lehmä, rotta ja opossumi), mutta myös hedelmäkärpäsiltä, mehiläisiltä ja malariahyttysiltä. Poikkeuksena on tätä ryhmää kuvaava cionan proteiini (Sca_10), jossa on tandemtoisto. Yksi ryhmistä sisältää sekä DCDC2A- että DCDC2B-proteiineja, ja vielä toinen ryhmä sisältää useampia DCDC2B-proteiineja, mikä viittaa todennäköisesti vähemmän evolutiivisesti konservoituneisiin sekvensseihin tämän proteiinien alaryhmän C-terminaalisissa domeeneissa.

DCX-domeeniproteiineja analysoitaessa havaittiin tandem- tai yksittäisten DCX-domeenien esiintyminen vastaavissa ortologeissa. Yksinkertaisin tapa selittää nämä erot voi olla intergeenisten sekvenssien häviäminen. Eksoni-intronirajojen analyysiin otettiin mukaan kaikki nisäkäslajit ja kana, koska se on nisäkkäisiin kuulumaton selkärankainen, joka on riittävän lähellä nisäkästä, jotta vertailu on mahdollista (taulukko 2). Yleisesti ottaen introni-eksonirajojen sijainti on hyvin konservoitunut. Joissakin tapauksissa ylimääräisen eksonin läsnäolo ei muuta DCX-domeeniin kuuluvien aminohappojen pituutta. Näin on DCDC2C:n tapauksessa; useimmat lajit sisältävät yhden eksonin, kun taas lehmän ortologin vastaava aminohapposekvenssi on jaettu kahteen eksoniin. Useimmissa tapauksissa eksonin puuttuminen merkitsee kuitenkin aminohappotiedon vähenemistä. Esimerkiksi FLJ46154 sisältää useimmissa lajeissa kolme eksonia, kun taas hiiressä ja rotan vastaavassa sekvenssissä vain kaksi. Näin ollen hiirellä ja rotalla tunnistettiin vain yksi DCX-domeeni alueella, joka vastaa ihmisen FLJ46154 DCX-domeenia. Tämä analyysi mahdollistaa myös keskeisten ajankohtien tunnistamisen DCX-domeeniproteiinien evoluutiossa. Nisäkkäiden ja lintujen yhteisen selkärankaisen esi-isän uskotaan nyt ulottuvan 310 miljoonaa vuotta taaksepäin, pussieläimet erosivat pääryhmästä (istukkaat) noin 180 miljoonaa vuotta sitten, ja ihminen ja jyrsijät erosivat evolutiivisesta sukupuusta noin 87 miljoonaa vuotta sitten. Edellä esitetty analyysi osoitti, että on todennäköistä, että BAC26042 on kadonnut evoluution aikana (hiirellä on kaksi eksonia, kun taas rotalla ja rhesusapinalla on vain yksi eksoni). Analyysia on vaikeuttanut rotan ennustettu sekvenssi (XM_230359), joka on fuusioitu sekvenssi, joka sisältää sekä FLJ46154 että BAC26042. Meillä on kuitenkin kokeellisia todisteita, jotka eivät tue tämän fuusioidun sekvenssin olemassaoloa. Hiiren FLJ46154-proteiinia vastaan tuottamamme vasta-aineet tunnistavat hiiren aivouutteessa olevan FLJ46154:lle ennustetun kokoisen proteiinin (lisäkuva 6). Näin ollen olemme suorittaneet analyysimme mRNA- ja EST-tietoihin perustuvan ihmisen datan ja EST-tietoihin perustuvan hiiren datan perusteella, joita kokeelliset tietomme tukevat. DCLK3 syntyi nisäkkäiden ja lintujen jakautumisen jälkeen. BAC26042, FLJ46154 ja DCDC2C syntyivät sen jälkeen, kun sammakkoeläimet erosivat istukkaiden pääryhmästä. DCDC1 syntyi ihmisten ja jyrsijöiden jakautumisen jälkeen. Tämän analyysin mukaan tämän superperheen konservoituneimmat geenit ovat DCX, DCLK ja DCDC2A.

Kahden ryhmän analyysin jälkeen, mukaan lukien N- ja C-terminaaliset domeenit, tehtiin analyysi kaikkien DCX-proteiinien osalta (tietoja ei ole esitetty). Kuten aiemmin havaittiin ihmisen ja hiiren proteiineista (kuva 2), N- ja C-terminaaliset domeenit olivat samankaltaisempia keskenään kuin saman proteiinin sisällä oleva vastaava toisto. Tämä tulos viittasi siihen, että DCX-domeenin duplikaatiot olivat ikivanhoja, ja todennäköisesti nämä kaksi toistoa ovat eronneet toiminnoiltaan. N-terminaalisten ja C-terminaalisten DCX-motiivien subspesialisaatio voidaan visualisoida logosekvenssien tasolla. Aiemmin tunnistettiin neljä konservoitunutta lohkoa (A-D) DCX-motiivin sisällä , nämä konservoidut lohkot on esitetty kuvan 4 alaosassa. Kun N-terminaalista aluetta analysoitiin erillään C-terminaalisesta alueesta, oli ilmeistä, että A ja osat B- ja C-alatunnuksista määrittelevät N-terminaalin, kun taas osa C-alatunnuksesta määrittelee C-terminaalin (kuva 4). Tämä tulos saatiin käyttämällä Lawrencen Gibbs sampler -motiivien etsintäalgoritmia. Samanlaisia tuloksia saatiin Smithin MOTIF-motiivinhakualgoritmilla (tietoja ei ole esitetty). Tämä analyysi osoittaa, että vaikka tandem-domeenit jakavat lyhyen samankaltaisten aminohappojen sekvenssin, N-terminaalisella domeenilla on ainutlaatuinen hyvin konservoitunut aminohappolohko.

N-terminaalisten ja C-terminaalisten DCX-motiivien sekvenssilogot. DCX-motiivien moninkertaiset kohdistukset DCX-motiiveista on esitetty sekvenssilogoina. Kunkin aminohapon korkeus edustaa informaatiobittejä ja on verrannollinen sen säilyvyyteen kyseisessä kohdassa (y-akseli) sen jälkeen, kun sekvenssit on painotettu ja frekvenssit korjattu odotetulla aminohappofrekvenssillä. Logojen alapuolella on aminohappojen numerointi sisäisten A-D-osa-alueiden sisällä. Tämä SeqLogo edustaa Lawrence Gibbs sampler -motiivinhakualgoritmia.

Ekspressioanalyysi in situ -hybridisaatiolla

Kun otetaan huomioon eri DCX-domainin paralogien samankaltaisuudet ja niiden yhteiset funktiot signaalinsiirtoon ja mikrotubuluksen säätelyyn liittyvissä asioissa , on tärkeää määritellä, milloin ja missä nämä geenit ilmenevät. Tämä auttaa rajaamaan niiden mahdollisia toimintoja. Esimerkiksi sen erottaminen, ilmentyykö tietty geeni proliferoivissa, migroivissa vai erilaistuvissa soluissa, on ratkaisevaa, kun yritetään selvittää geenin toimintaa. Lisäksi yhteisekspressio tietyssä kudoksessa voi viitata siihen, että paralogit voivat tehdä yhteistyötä tai olla redundantteja.

Analyysimme tehtiin in situ -hybridisaatiolla E14.5:ssä, vaiheessa, jossa monet aikuiselle organismille tyypilliset erilaistuneet solutyypit ovat muodostuneet, mutta samaan aikaan tällaiset raskauden puolivälissä olevat alkion kudokset sisältävät vielä esiasteen soluja. Tämä analyysi tehtiin, jotta saataisiin aikaan ”tilannekuva” ekspressioprofiilista. Lukuun ottamatta ubiikkisesti ilmentyvää Dcdc2B:tä (kuva 5D), DCX-toistoja sisältäviä proteiineja koodaavien geenien ilmentymismallit ovat enemmän tai vähemmän alueellisia. Dcx, Dclk ja Dclk2 ilmentyvät keskus- ja ääreishermostossa, mukaan lukien aivoissa, selkäytimessä, kallo- ja takajuuriganglioissa sekä parasympaattisissa ganglioissa (Kuva 5A-C). Suuritehokuvasta (Kuva 5E-H) nähdään, että kehittyvässä neokorteksissa Dcx- ja Dclk-transkriptioita on paljon enemmän esilevyssä, mutta yksittäisiä Dcx- ja Dclkgeenejä ilmentäviä soluja voidaan havaita kammiovyöhykkeessä. Sekä Dclk2 että Dcdc2B ekspressoituvat kehittyvässä neokorteksissa suurelta osin yhtenäisesti ja matalalla tasolla, mutta voimakkaammin ventrikulaarisessa vyöhykkeessä kuin Dcx ja Dclk. Hermoston ulkopuolella merkittäviä Dcx:n ja Dclk:n ilmentymiskohtia ovat luurankolihakset, kielen lihakset ja hajuepiteelin yksittäiset solut (kuva 5A,B). Viimeksi mainitussa kudoksessa ilmentyy myös Dclk2 (Kuva 5C).

BAC26042:lla, FLJ46154:llä ja Dcdc2A:lla on hyvin alueelliset ilmentymismallit, jotka aivoissa näyttävät olevan samanlaisia BAC26042:n ja FLJ46154:n osalta (Kuva 5I-K). Kuvissa 5I ja 5J esitetään etuaivojen sagittaalileikkaukset, joissa BAC26042- ja FLJ46154-transkriptejä esiintyy septumissa, ventraalisen talamuksen eri soluryhmissä ja posteriorisessa hypotalamuksessa. Muita ilmentymiskohteita ovat ryhmä hermosoluja hajulohkon tyvessä (Kuva 5I,J), pretectaalinen alue, kasvojen ydin ja hajanaisia hermosoluja selkäytimen ventraali- ja dorsaaliosissa (tietoja ei ole esitetty). Dcdc2A:n ilmentyminen CNS:ssä rajoittuu ryhmään hajanaisia neuroneja kehittyvän pikkuaivojen lateraalisimmassa osassa (kuva 5K). BAC26042 ja Dcdc2A ilmentyvät suonikalvopleksissä (Kuva 5I,K).

Suurin osa DCX-toistoa koodaavista geeneistä ilmentyy kehittyvässä verkkokalvossa. Esiin tulee kolmenlaisia kuvioita: Dcx-, Dclk- ja Dclk2-transkriptiot ilmentyvät voimakkaasti postmitoottisessa sisimmässä neuroblastisessa kerroksessa (kuva 5L-N), kun taas BAC26042 ja FLJ46154 ilmentyvät myös tässä kerroksessa, mutta rajoitetummin lähellä sen pintaa ja pinnalla (kuva 5P,Q). Lopuksi Rp1l1-transkriptioita löytyy ulommasta neuroblastisesta kerroksesta, joka sisältää proliferoivia soluja (kuva 5O). Ulommassa neuroblastisessa kerroksessa havaitaan säteittäisesti järjestäytyneitä Dcx:ää, Dclk:tä tai Dclk2:ta ilmentäviä soluja, mikä muistuttaa tilannetta, joka on nähtävissä neokorteksin ventrikulaarisessa vyöhykkeessä (Kuva 5E-G).

Lisäksi keuhkoissa ja munuaisissa ilmentyy Dcx:ää, Dclk:ta ja Dcdc2A:ta. Dclk2:n transkriptioita löytyy myös kehittyvästä munasarjasta, ja heikkoa ilmentymistä nähdään myös kaikkialla munuaisissa (tietoja ei ole esitetty).

Analyysimme sisälsi useimmat taulukossa 1 luetelluista 11 geenistä, poikkeuksena Dclk3 ja Dcdc2C, joille emme vielä löytäneet sopivia malleja. Myös Rp1:tä tutkittiin, mutta se ei ilmentynyt E14,5:ssä, lukuun ottamatta ilmentymistä, jota havaittiin joissakin selkäytimen keskilinjan soluissa (tietoja ei ole esitetty). Yhteenvetona tutkimuksistamme havaitsimme, että kudokset, joiden on määrä reagoida sähköisiin ärsykkeisiin – keskus- ja ääreishermosto ja luurankolihakset – edustavat DCX-toistoa koodaavien geenien silmiinpistävimpiä ilmentymispaikkoja. Näiden kudosten ulkopuolella ekspressio on enimmäkseen vähäistä eikä yleensä alueellista, poikkeuksena munuaiset ja keuhkot.

Ekspressioanalyysi ihmisellä ja hiirellä

Hiirimalleja käyttävien funktionaalisen genomiikan lähestymistapojen merkitys ihmisen sairauksien tutkimisessa riippuu ilmeisesti geenien ekspression samankaltaisuudesta näissä kahdessa lajissa. Niinpä vertasimme tässä tutkimuksessa tutkittujen DCX-geenien superperheen ihmisjäsenten ilmentymistä niiden hiiren ortologeihin. Tähän tarkoitukseen käytimme Unigene-tietokannan ekspressiotietosivustoa. Sekä ihmisen että hiiren DCX-toistoja sisältävien proteiinien kudosriippuvaiset ekspressioprofiilit luotiin Unigenen tarjoamasta EST-laskennasta. Koska hiiren ja ihmisen välinen vertailu oli keskeinen piirre, analyysi rajattiin kudoksiin, joiden EST-lukujen kokonaismäärä oli suuri ja jotka olivat yhteisiä molemmille organismeille. Analysoimme tiedot kymmenestä eri ihmisen geenistä ja kahdeksasta hiiren geenistä. Kahdesta ihmisgeenistä ei ollut vastaavaa ekspressiotietoa hiirellä: DCDC2B, jolla on hiiren ortologi, jota ei ole UNIGENE-luettelossa, ja DCDC1, jolla ei ole hiiren ortologia. Tämän analyysin tuloksena saadut klusteroidut ekspressiotiedot on esitetty kuvassa 6A, ja näihin tietoihin perustuva geeni-geenikorrelaatio on esitetty kuvassa 6B.

A) Klusteroidut Unigene-geenien ja kudosten väliset ekspressiotiedot. B) Unigene-ekspressioaineistoon perustuvat geeni-geenikorrelaatiot.

Testasimme korrelaation merkitsevyyttä satunnaispermutaatioanalyysillä. Korrelaatiot laskettiin uudelleen 1000 kertaa sen jälkeen, kun kullekin geenille oli järjestetty uudelleen riippumattomasti kaikki kudokset satunnaisesti. Havaitsimme, että kaikki korkeat korrelaatiot (>0,5) olivat merkitseviä (p < 0,01). Havaittiin kaksi klusteria, jotka paljastivat erittäin korkean korrelaation. Suurimpaan ryhmään kuuluivat ihmisen RP1 ja RP1L1 sekä niiden hiiren ortologit. Lisäksi DCDC1, jonka on tähän mennessä raportoitu ilmentyvän pääasiassa kiveksissä ja alkion aivoissa, sisältyi tähän ryhmään. Tälle ryhmälle on ominaista korkea ekspressio silmässä, mikä on yleistä useimmille DCX-proteiineille, ja se on havaittu in situ -analyysissämme. Silmässä tapahtuvan ilmentymisen lisäksi nämä geenit ilmentyvät alhaisemmalla tasolla vain muutamassa muussa kudoksessa. Tässä ryhmässä ei ole selvää eroa geenin ja geenin välisessä korrelaatiossa hiiren ja ihmisen ilmentymisessä. Tämän ryhmän eri jäsenten välinen korrelaatio on kaikissa tapauksissa >0,9. Sekä ihmisen että hiiren FLJ46154 liittyy tähän ryhmään, mutta ihmisen ja hiiren FLJ46154:n välinen korrelaatio on alhainen (0,3). Näiden kahden geenin proteiinituotteet ovat myös eronneet toisistaan, ja hiiren proteiinista on kadonnut DCX-domeeni. Näin ollen voi olla mahdollista, että myös näiden geenien säätelyalueet ovat säilyneet vähemmän.

Toiseen ryhmään, jossa geenien väliset korrelaatiot ovat korkeat, kuuluvat hiiren geenit Dcx, Dclk ja Dclk2 sekä niiden ihmisen ortologit. Ihmisen DCLK2:lla oli hiukan alhaisemmat korrelaatiot hiiren ortologinsa kanssa (0,4) kuin muilla tämän ryhmän geeneillä. Tämä saattaa johtua sen yleisesti ottaen alhaisemmasta ilmentymistasosta (kuva 6A). In situ -aineistomme osoittivat myös suurta samankaltaisuutta Dcx:n, Dclk:n ja Dclk2:n yhteisekspressiossa. Lisäksi toiminnallinen analyysimme osoitti, että tällä ryhmällä on enemmän yhteisiä ominaisuuksia ja vain ne ovat vuorovaikutuksessa telineproteiini neurabin 2:n kanssa. Kolmas ryhmä geenejä, joilla on alhaisemmat korrelaatiotasot, ovat DCDC2A, DCLK3, Dcdc2A ja Dclk3. Tässä ryhmässä vastaavien ortologien välinen korrelaatio ei ylitä 0,5:tä. On huomattava, että eri geenien välillä on lisäksi joitakin korkeita korrelaatioita, esimerkiksi; DCLK3 ja Flj46154 tai FLJ46154 ja DCX, DCLK ja Dcx.