Kasvua ja etanolin tuotantoa varten S. cerevisiae NCYC 2826:n kasvu vehnän olkihydrolysaatilla
Kuvassa 1A on esitetty S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826:n kasvu, jota kasvatettiin 30 °C:ssa 36 tunnin ajan viljelmässä, joka sisälsi hydrolysaattia, jonka glukoosikonsentraatio oli 123 mM ja joka oli valmistettu ”Menetelmät”-luvussa kuvatulla tavalla. S. cerevisiae -kanta valittiin, koska sen on raportoitu sietävän hyvin etanolia ja olevan kestävä teollisissa fermentoinneissa. Kuvasta 1A käy ilmi, että kun S. cerevisiae NCYC 2826:ta kasvatettiin pelkällä vehnän olkihydrolysaatilla, kasvuvauhti oli hidas μ 0,036 h-1 ja lopullinen optinen tiheys (OD) 0,8. Hiivan ravinnepohjan (Yeast Nutrient Base, YNB) lisääminen väliaineeseen kasvatti μ:n 0,135 h-1:een ja lopullisen OD:n 1,5:een, kun taas 2,3 mg ml-1 urean lisääminen vehnän olkihydrolysaattiin johti μ:n 0,99 h-1:een ja lopullisen OD:n 1,3:een. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että urean lisäykset voivat lisätä etanolin tuotantoa hiivakäymisessä ja että urea itsessään on olennainen komponentti kaikkein pienimmissä hiivan kasvualustoissa. Tuloksemme tukevat näitä aiempia havaintoja ja vahvistavat urean tarpeen hiivan lähes optimaalisen kasvun kannalta. Viljelmien etanolipitoisuus mitattiin 36 tunnin kuluttua, ja 123 mM glukoosista saadun etanolin saanto oli noin 90 % kaikkien viljelmien teoreettisesta kokonaistuotosta. Vaikka etanolia tuotettiin vertailukelpoinen saanto näissä kolmessa viljelyolosuhteessa, kasvu oli hitaampaa ja lopullinen optinen tiheys pienempi vehnän olkihydrolysaatilla kuin silloin, kun viljelyyn lisättiin joko ureaa tai YNB:tä. Tämä viittaa siihen, että vaikka glukoosia oli saatavilla fermentointia varten, hydrolysaatti ei sisältänyt riittävästi ravintoaineita, jotta viljelmä olisi voinut jakautua maksimaalisella nopeudella ja saavuttaa optimaalisen tiheyden.
Vehnän olkihydrolysaatilla tapahtuneen solukasvun hidastumisen syyn selvittämiseksi S. cerevisiae NCYC 2826:ta kasvatettiin hydrolysaatilla, joka oli valmistettu 5, 10, 15 ja 20 prosentin lähtötilanteen olkipitoisuudesta ja jota oli täydennetty urealla (Urea), jonka pitoisuus oli 5, 10, 15 ja 20 prosenttia. Kuvasta 1B nähdään, että kun oljen lähtökonsentraatio kasvoi, myös kasvun viiveaika kasvoi 20 tuntiin, kun oljen lähtökonsentraatio oli 20 %. Myös lopullinen OD kasvoi olkipitoisuuden kasvaessa, mikä johtui vapautuneen glukoosin lisääntyneistä pitoisuuksista. Lisääntynyt viivefaasi on ominaista olkihydrolysaateissa usein esiintyvien furaaniyhdisteiden aiheuttamalle kasvun estolle. Hydrolysaatin furaanipitoisuuden analyysi osoitti, että HMF-pitoisuus oli häviävän pieni (tietoja ei ole esitetty), mutta furfuraalin pitoisuus kasvoi oljen alkupitoisuuden kasvaessa ja oli 0,5 mg ml-1 , kun oljen alkupitoisuus oli 20 % (kuva 2). Nämä tiedot viittaavat siihen, että S. cerevisiae NCYC 2826:n kasvua vehnän olkihydrolysaatilla rajoittaa hydrolysaatissa olevan furfuraalin pitoisuus.
Vehnän olkihydrolysaatissa olevan glukoosin (neliöt) ja furfuraalin (kolmiot) pitoisuus vehnän olkihydrolysaateissa, jotka on valmistettu ’ Menetelmät ’ -luvussa kuvatulla menetelmällä kasvavan alkuainekonsentraation mukaan.
Analyysi SGRP-kantasarjan kasvusta furfuraalilla
Sellaisten hiivakantojen tunnistamiseksi, jotka saattavat olla vastustuskykyisiä kontaminoivalle furfuraalille, menetelmissä kuvattua SGRP-kantasarjaa kasvatettiin YNB:ssä, 100 mM glukoosia ja 1,5 mg ml-1 furfuraalia. Taulukossa 1 esitetään analyysi SGRP-kantajoukon sietokyvystä 1,5 mg ml-1 furfuraalia kohtaan ”Menetelmät”-osassa kuvatun pisteytysjärjestelmän avulla. Keskimääräisten viiveaikojen sijasta tarvittiin pisteytysjärjestelmä, koska kannan replikaateilla, jotka eivät kasvaneet, ei ollut mitattavissa olevaa viiveaikaa, mutta ne oli silti sisällytettävä aineistoon.
Olimme aiemmin havainneet, että inokulaation kasvattaminen furfuraalia sisältäviin viljelmiin johti viiveen vaiheen lyhenemiseen, luultavasti maksimoimalla elinkelpoisten hiivasolujen määrän väliaineessa, mikä johti nopeampaan eksponentiaalisen vaiheen asettumiseen kasvuun (tietoja ei ole esitetty). Tämän vuoksi näissä kokeissa käytettiin 5 prosentin inokulaatiomäärää yön yli -viljelmästä. Taulukossa 1 esitetyt tiedot osoittavat, että kasvu jäljennöslevyillä oli erittäin vaihtelevaa ja myös kannasta riippuvaista, mikä osoittaa, että 1,5 mg ml-1 furfuraalipitoisuus riittää erottamaan S. cerevisiae- ja S. paradoxus -kantojen furfuraalin sietokyvyn. Kun kantojen kasvua testattiin YNB:ssä, joka sisälsi 100 mM glukoosia ja joko 2,0 tai 3,0 mg ml-1 furfuraalia, minkään analysoidun kannan kasvua ei havaittu juurikaan kummassakaan näistä olosuhteista. Näin ollen päätettiin valita kannat 1,5 mg ml-1 -tietojen perusteella ja tehdä niille yksityiskohtaisempi furfuraaliseulonta. Taulukossa 1 esitettyjen tietojen analyysi osoittaa, että S. cerevisiae -kannat kasvoivat yleisesti ottaen paremmin kuin S. paradoxus -kannat 1,5 mg ml-1 furfuraalilla. Lähes 20 prosenttia testatuista S. paradoxus -kannoista ei saanut parasta arvosanaa pisteytysjärjestelmässä, kun taas S. cerevisiae -kannoista alle 10 prosenttia, mikä näkyy myös S. cerevisiae -kannan korkeampana keskimääräisenä kokonaispistemääränä, joka oli 2,5 ± 1,4 verrattuna S. paradoxus -kannan 2,1 ± 1,4:ään. Kunkin kantaryhmän sisällä oli kuitenkin huomattavaa vaihtelua, sillä S. cerevisiae -kannan pisteet vaihtelivat 1,7:stä 3,7:ään ja S. paradoxus -kannan pisteet 0,3:sta 3,0:aan. Kantojen, joiden pistemäärä oli yli 2,9 ja keskihajonta alle 1,5, katsottiin sietävän merkittävästi furfuraalia. Näin ollen S. cerevisiae -kantoja NCYC 3284 (entinen maaperä, Yhdysvallat), NCYC 3290 (entinen bili-viini, Länsi-Afrikka), NCYC 3312 (entinen maaperä, Alankomaat) ja NCYC 3451 (entinen vierre, Irlanti) sekä S. paradoxus -kantoja NCYC 3277 (entinen tammen kuori, Yhdistynyt kuningaskunta) tutkittiin tarkemmin yksityiskohtaisemmassa furfuraaliseulassa.
Nousevien furfuraalipitoisuuksien vaikutus kasvuun ja etanolituotantoon
Kuvassa 3 on esitetty S. cerevisiae -kantojen NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 ja NCYC 3451 sekä S. paradoxus -kannan NCYC 3277, joka tunnistettiin taulukossa 1 SGRP:n kantasarjasta ja jolla on lisääntynyt resistenssi furfuraalia vastaan, kasvu eri furfuraalipitoisuuksien läsnä ollessa (0,1-4,0 mg millilitraa -1). Lisätiedosto 1: Kuvassa S1 esitetään vastaavat kasvutiedot logaritmisesti. Vertailun vuoksi mukana oli myös kontrollikanta S. cerevisiae NCYC 2826. Kaikkien kuuden kannan osalta kasvukäyrät alkoivat furfuraalipitoisuuden kasvaessa osoittaa viiveen lisääntymistä, kuten aiemmin on nähty furfuraalia sisältävissä kasvustoissa. Kaikki testatut kannat pystyivät kasvamaan YNB:ssä, jota täydennettiin 100 mM glukoosilla ja 0,1-1,5 mg ml-1 furfuraalilla. S. cerevisiae NCYC 2826, kontrollikantamme, pystyi kasvamaan vain enintään 1,5 mg ml-1:llä, mikä johti lopullisen OD:n pienenemiseen 30 prosenttia verrattuna kasvuun 0,1 mg ml-1 furfuraalilla. Taulukosta 2 käy ilmi, että NCYC 2826:n etanolituotanto näissä olosuhteissa väheni huomattavasti verrattuna noin 90 prosentin tuottoon, joka havaittiin, kun sitä kasvatettiin pelkällä YNB:llä ja glukoosilla tai vehnän olkihydrolysaatilla. S. cerevisiae NCYC 2826 eristettiin rypäleen puristemehusta, joten on epätodennäköistä, että se olisi kehittänyt kyvyn kasvaa ja fermentoida altistuessaan furfuraalille.
Populaatiogenomiikan tutkimuksessaan Liti et al. tunnistivat viisi hyvin määriteltyä, maantieteellisesti eristettyä S. cerevisiae -linjaa (Malesian, Pohjois-Amerikan, Sakén, Länsi-Afrikan ja ”Wine/Euroopan” linjat) sekä monia erilaisia näiden linjojen rekombinantti- eli mosaiikkikantoja. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella on ilmeistä, että furfuraaliresistenssi ei ole minkään tietyn S. cerevisiae -linjan fenotyyppinen ominaisuus. Neljästä tunnistetusta furfuraalille resistentistä SGRP S. cerevisiae -kannasta NCYC 3284 (YPS128) kuuluu pohjoisamerikkalaiseen sukulinjaan, NCYC 3290 (DBVPG 6044) kuuluu länsiafrikkalaiseen sukulinjaan, NCYC 3312 (DBVPG 1373) kuuluu viini-eurooppalaiseen sukulinjaan, kun taas NCYC 3451 (NCYC 361:n yksi-itiöinen johdannainen) on rekombinanttikanta.
S. cerevisiae NCYC 3451 osoitti suurinta furfuraaliresistenssiä (kuva 3F, lisätiedosto 1: kuva S1F) ja kykeni kasvamaan jopa 3,0 mg ml-1 furfuraalin läsnä ollessa. Furfuraali ei myöskään näyttänyt estävän etanolin tuotantoa tässä kannassa, ja suurin etanolin tuotto (95 ± 15 %; taulukko 2) saavutettiin 3,0 mg ml-1:n (furfuraali)pitoisuudella. Kuten jo mainittiin, NCYC 3451 on rekombinanttikanta, ja sillä on osoitettu olevan mosaiikkimainen genomi, joka on peräisin ainakin kolmesta eri sukulinjasta, nimittäin Sakésta, länsiafrikkalaisesta ja viini/eurooppalaisesta (Liti et al. ). Vaikka kanta on todettu eristetyksi vierrestä olutta pilaavana hiivana, sen erittäin monimutkainen genomirakenne viittaa vahvasti siihen, että se on teollista alkuperää (esimerkiksi leivonta- tai panimokanta), vaikka sitä ei ole todistettu. Neljästä muusta testatusta SGRP-kannasta S. cerevisiae -kannat NCYC 3290 ja NCYC 3312 pystyivät molemmat kasvamaan 2,5 mg ml-1 furfuraalilla (kuva 3D,C, lisätiedosto 1: kuva S1D ja S1C), kun taas S. cerevisiae -kannat NCYC 3284 (kuva 3E, lisätiedosto 1: kuva S1E) ja S. paradoxus -kanta NCYC 3277 (kuva 3B, lisätiedosto 1: kuva S1B) pystyivät kasvamaan vain 2,0 mg ml-1 furfuraalilla. Kaiken kaikkiaan furfuraalin läsnäolo ei vaikuttanut merkittävästi etanolin tuotantoon viidessä SGRP-kannassa. Itse asiassa NCYC 3312:n osalta 0,5 mg ml-1 furfuraalin läsnäolo johti huomattavaan etanolituoton kasvuun 41 ± 8 %:n odotetusta tuotoksesta 75 ± 5 %:iin (taulukko 2). Tämä havaittiin myös oluen pilaantumiskannassa NCYC 3451, mutta vähäisemmässä määrin (vain 14 %:n lisäys saannissa; taulukko 2). Hiljattain onkin osoitettu, että pienet määrät furfuryylialkoholia, joka on hiivassa tapahtuvan furfuraalin dehydraation tuote, voi itse asiassa johtaa etanolin tuotannon lisääntymiseen .
.