Taustatiedot

DNA:n transfektio elektroporaation avulla on vakiintunut tekniikka, jota voidaan soveltaa ehkä kaikkiin solutyyppeihin. Se tuottaa hyvin usein stabiileja transformantteja ja sillä on suuri tehokkuus ohimenevässä geeniekspressiossa. Elektroporaation on nyt osoitettu olevan tehokas keino siirtää plasmidi-DNA:ta in vivo useisiin kudostyyppeihin. Elektroporaatiossa hyödynnetään sitä, että solukalvo toimii sähköisenä kondensaattorina, joka ei pysty johtamaan virtaa (paitsi ionikanavien kautta). Kalvojen altistaminen korkeajännitteiselle sähkökentälle johtaa niiden tilapäiseen hajoamiseen ja huokosten muodostumiseen, jotka ovat riittävän suuria päästämään makromolekyylejä (sekä pienempiä molekyylejä, kuten ATP:tä) soluun tai poistumaan solusta. Kalvohuokosten uudelleen sulkeutuminen on luonnollinen hajoamisprosessi, joka viivästyy 0 °C:ssa.

Huokosten aukioloaikana nukleiinihappo voi päästä soluun ja lopulta ytimeen. Lineaarinen DNA, jolla on vapaat päät, on rekombinogeenisempi ja integroituu todennäköisemmin isäntäkromosomiin, jolloin saadaan stabiileja transformantteja. Superkierteinen DNA pakkautuu helpommin kromatiiniin ja on yleensä tehokkaampi ohimenevässä geeniekspressiossa.

Korkeajännitteisten sähköiskujen käyttö DNA:n tuomiseksi soluihin tehtiin ensimmäisen kerran Wongin ja Neumannin toimesta fibroblasteilla (Wong ja Neumann, 1982; Neumann ym., 1982). Sen jälkeen tekniikka yleistettiin (Potter ym., 1984) koskemaan kaikkia solutyyppejä – myös sellaisia solutyyppejä, kuten lymfosyyttejä, joita, toisin kuin fibroblasteja, ei voida transfektoida muilla menetelmillä (esim,

Oliver Smithies ja kollegat käyttivät sitten elektroporaatiota DNA:n siirtämiseksi alkion kantasoluihin (ES-soluihin) ja suunnittelivat kohdevektoreita, joiden avulla siirretty DNA saattoi yhdistyä homologisten alueiden kanssa genomissa ja joko siirtää muuttuneen geenin tai häiritsevän sekvenssin, jolloin saatiin aikaan ES-soluja, joissa oli tietty geeni ”tyrmätty” tai ”tyrmätty”. Muutettuja ES-soluja käytettiin sitten vastaavien knockin- tai knockout-hiirten tuottamiseen. Elektroporaatiota tarvittiin näihin geeninsiirtosovelluksiin, koska se tuo DNA:n soluihin alastomassa muodossa, joka voi helposti osallistua homologiseen rekombinaatioon. Tämä elektroporaation laajentaminen johti siihen, että tohtori Smithies sai vuonna 2007 lääketieteen tai fysiologian Nobel-palkinnon. ES-solujen elektroporaatiomenetelmä on periaatteessa sama kuin muiden nisäkässolujen. Jos halutaan homologinen geenien korvaaminen, on suunniteltava vektorit, jotka mahdollistavat ”positiivis-negatiivisen” seulonnan (Bronson ja Smithies, 1994; Joyner 2000) siten, että toisessa valinnassa otetaan talteen kaikki solut, joissa elektroporattu DNA on asettunut genomiin, ja toisessa valinnassa valitaan ES-kloonit, joihin DNA on asettunut satunnaisesti. Knockin/out-hiiret voidaan sitten tuottaa fuusioimalla valitut kloonatut ES-solut alkioihin, istuttamalla ne uudelleen kehityksen mahdollistamiseksi ja jalostamalla tuloksena syntyneet kimeerit, jotta saadaan hiiriä, joiden kaikki solut kantavat muuttunutta geeniä.

Vaikka kokonaisten kasvien tai lehtikudoksen on raportoitu olevan transfektoitavissa elektroporaatiolla, kasvisoluista on yleensä tehtävä protoplastit, ennen kuin DNA:ta voidaan helposti viedä niihin (vaihtoehtoinen protokolla; Fromm ym., 1985; Ou-Lee ym., 1986). Nisäkässolujen tavoin kasvien protoplastit voidaan elektroporoida erilaisissa sähköisissä olosuhteissa (kriittiset parametrit). Onnistuneen geeninsiirron aikaansaamiseksi on käytetty sekä korkeaa jännitettä pienellä kapasitanssilla (lyhyt pulssin kesto) että matalaa jännitettä suurella kapasitanssilla (pitkä pulssin kesto) (Chu et al., 1991). In vivo EP:tä käytettiin alun perin kemoterapeuttisten aineiden siirtämiseen kiinteisiin kasvaimiin, ja se eteni prekliinisistä tutkimuksista kliinisiin tutkimuksiin (Gothelf, et al., 2003). Plasmidi-DNA:n in vivo-toimituksesta elektroporaation avulla raportoitiin ensimmäisen kerran 1990-luvun alussa tai puolivälissä (Titomarov ym. 1991; Heller ym. 1996; Nishi ym. 1996), ja se oli looginen edistysaskel, joka perustui elektroporaation avulla tehtyjen in vitro -transfektioiden onnistumiseen ja sen osoittamiseen, että menettely voidaan suorittaa turvallisesti in vivo, kun siihen liittyy pienten molekyylien, kuten kemoterapia-aineiden, toimitus. In vivo -elektroporaation käyttö plasmidi-DNA:n levittämiseen on lisääntynyt valtavasti prekliinisten tutkimusten määrässä, ja se on hiljattain siirretty kliiniseen käyttöön (Heller ym. 2006a ja Bodles-Brakhop ym. 2009).

Elektroporaation laajamittaisen käytön on tehnyt mahdolliseksi suurelta osin se, että saatavilla on kaupallisia laitteita, jotka ovat turvallisia ja helppokäyttöisiä ja joilla saadaan erittäin hyvin toistettavia tuloksia. Näiden laitteiden mallit vaihtelevat huomattavasti, mutta ne jakautuvat kahteen perusluokkaan, joissa käytetään erilaisia keinoja pulssin keston ja jännitteen (kaksi sähköistä parametria, jotka säätelevät huokosten muodostumista) hallintaan. Toisessa käytetään kondensaattoripurkausjärjestelmää eksponentiaalisesti laskevan virtapulssin tuottamiseksi, ja toisessa käytetään todellista neliöaaltoa (tai sen likiarvoa). Kondensaattoripurkauslaitteet lataavat sisäisen kondensaattorinsa tiettyyn jännitteeseen ja purkavat sen sitten solu-DNA-suspension läpi. Sekä kondensaattorin kokoa että jännitettä voidaan muuttaa. Koska virtapulssi on eksponentiaalisesti hajoava funktio 1) alkujännitteestä, 2) laitteen kapasitanssiasetuksesta ja 3) piirin (mukaan lukien näyte) resistanssista, kondensaattorin koon muuttaminen siten, että jännitteeseen voidaan varastoida enemmän (tai vähemmän) varausta, johtaa pidempiin (tai lyhyempiin) hajoamisaikoihin ja siten erilaiseen tehokkaaseen pulssin kestoon. Sitä vastoin neliöaaltogeneraattorit ohjaavat sekä jännitettä että pulssin kestoa kiinteän tilan kytkentälaitteilla. Ne voivat myös tuottaa nopeasti toistuvia pulsseja. In vivo -sovelluksissa suositaan neliöaaltogeneraattoreita. Pulssien keston ja amplitudin lisäksi myös pulssien lukumäärä ja elektrodien konfiguraatio vaikuttavat annostelun tehokkuuteen.

Useimmissa in vitro -elektroporaatiokokeissamme on käytetty Bio-Rad Gene Pulseria, joka on kondensaattoripurkauslaite, mutta ne ovat suoraan sovellettavissa muihin kondensaattoripurkauslaitteisiin ja jonkin verran sovitettuna neliöaaltogeneraattoreihin. Kondensaattoripurkauslaitteita on saatavana myös GIBCO/BRL:ltä, BTX:ltä, Hoeffer Scientificiltä ja International Biotechnologiesilta (toimittajien osoitteet ovat LIITTEESSÄ 4). Näillä laitteilla, joko yhtenä yksikkönä tai lisäkomponenttien avulla, voidaan tuottaa erilaisia elektroporaatio-olosuhteita, jotka soveltuvat useimpiin sovelluksiin. Neliöaaltogeneraattoreita on saatavana BTX:ltä, Baekonilta, CytoPulse Sciencesilta, Sonidelilta, Bio-Radilta, Jouanilta ja IGEA:lta, ja ne mahdollistavat pulssin leveyden hyvän hallinnan, useita nopeita pulsseja ja voivat olla tehokkaampia sellaisten solujen kohdalla, jotka ovat hyvin herkkiä tai joita on muuten vaikea transfektoida. Elektroporaation käyttäminen geeniterapian toteuttamiseen elävissä eläimissä tai ihmisissä edellyttää myös elektroporaatioparametrien hyvää hallintaa, jotta voidaan varmistaa tehokas DNA:n siirto mahdollisimman vähäisin kudosvaurioin, ja tähän tarvitaan yleensä neliöaaltogeneraattoreita. Saatavilla on generaattoreita, joilla voidaan antaa pulsseja joko vakiojännitteellä tai vakiovirralla. Neliöaaltogeneraattoreiden lisäksi näiltä toimittajilta on saatavana myös in vivo -elektroporaatioon soveltuvia elektrodeja. Nämä laitteet ovat yleensä kalliimpia. On käynyt ilmeiseksi, että vaihtovirtapulssit, joiden taajuus on ~100 kHz, voivat olla tehokkain aaltomuoto elektroporaatiossa ja mahdollisesti myös elektrofuusioinnissa (Chang, 1989).

Vähemmistö in vivo -kokeistamme on käyttänyt BTX T820- tai T830-neliöaaltogeneraattoreita. Näissä kokeissa on käytetty kaupallisesti saatavilla olevia elektrodeja, kuten 2-neulasarjaa, kaliperielektrodeja ja pinssielektrodeja sekä räätälöityjä elektrodeja. Kuten edellä mainittiin, tärkeimmillä elektroporaatiolaitteiden toimittajilla on saatavilla erilaisia läpäiseviä ja läpäisemättömiä elektrodeja. Neliöaaltogeneraattorit mahdollistavat pulssiparametrien paremman hallinnan, mikä on erityisen tärkeää in vivo -toimituksessa. In vivo -elektroporaation käytön kasvu liittyy suoraan sen tehokkaaseen toimittamiseen lihakseen. Geenien toimittaminen lihaksensisäisesti elektroporaation avulla on ollut erityisen tärkeää rokotustarkoituksiin (Abdulhagg, et al., 2008). Lihaksen on myös osoitettu olevan erinomainen varasto geenipohjaisille proteiinikorvaussovelluksille (Trollet, et al., 2006). Lihakseen toimittamista voidaan käyttää myös syöpää vastaan tarkoitettujen rokotteiden toimittamiseen (Bodles-Brakhop, et al., 2009). Myös ihon kautta tapahtuva toimitus on saanut hyväksyntää monipuolisena kohteena. Ihoon annostelua voidaan käyttää ihosairauksien välittömään hoitoon, proteiinien annosteluun verenkiertoon systeemistä hoitoa varten, syöpähoitoon ja DNA-rokotteiden annosteluun (Hirao, ym., 2008, Roos, ym., 2006, Glasspool-Malone, ym., 2000).

Elektroporaatio voi olla helpompi toteuttaa kuin vaihtoehtoiset tekniikat, minkä vuoksi sitä hyödynnetään yhä enemmän. Tärkein ero elektroporaation ja kalsiumfosfaattikopreesipitaatiomenetelmien välillä on integroituneen DNA:n tila sen jälkeen, kun se on valikoitunut sopivaan antibioottimediaan. Kalsiumfosfaatin tapauksessa kunkin transfektoidun solun genomiin integroituneen DNA:n määrä on noin 3 × 106 bp. Tämän seurauksena transfektoitu DNA integroituu usein suuriksi tandemiryhmiksi, jotka sisältävät useita kopioita transfektoitua DNA:ta. Tämä olisi eduksi, kun halutaan transfektoida genomista DNA:ta vastaanottajasoluihin ja valikoida jonkin fenotyyppisen muutoksen, kuten pahanlaatuisen transformaation, aikaansaamiseksi; tällöin suuri määrä integroitunutta DNA:ta vastaanottajasolua kohti on välttämätöntä. Sitä vastoin elektroporaatiota voidaan säätää siten, että tuloksena on yhdestä moniin kopioihin siirrettyä DNA:ta vastaanottajasolua kohti. Tämä olisi eduksi geeniekspressiotutkimuksissa, koska geeniekspressiosta vastaavan tietyn kopion identiteettiä voidaan kontrolloida, ja kuten edellä käsiteltiin, se on olennaista ES-solujen geenikohdistamisessa siirtogeenisten hiirien tuottamiseksi.