Infektio Giardia lambliaan on yksi yleisimmistä ripulitautien aiheuttajista maailmanlaajuisesti (22). Tämä alkueläinpatogeeni kolonisoituu ohutsuoleen ja voi kiinnittyä epiteeliin, mutta ei tunkeudu limakalvoon. Infektiot ovat yleensä itsestään ohimeneviä, sillä immunokompetentit isännät pystyvät hallitsemaan ja yleensä hävittämään G. lamblian. Tähän prosessiin osallistuvat CD4 T-solut ja erittyvän immunoglobuliini A:n (IgA) ja muiden, huonosti tunnettujen efektoreiden muodostuminen (6, 8, 9, 18). Huolimatta usein vakavista kliinisistä oireista, ripulista, vatsakivusta, imeytymishäiriöistä ja laihtumisesta, infektioon ei liity merkittävää limakalvotulehdusta (12). Nämä havainnot viittaavat siihen, että tulehduksen välittäjäaineilla ei ehkä ole merkitystä loisen aiheuttamassa ripulissa, vaikka giardiaasin ripulia ohjaavat mekanismit tunnetaankin huonosti. Giardian ei ole osoitettu vapauttavan enterotoksiineja, jotka voisivat selittää suolen nesteen imeytymisen tai erityksen häiriön. Imukykyinen pinta pienenee epiteelin mikrovillien häviämisen vuoksi hiirten Giardia-infektiossa (16), mikä voi johtaa osmoottisesti johtuvaan ripuliin, johon liittyy imeytymishäiriö, mutta absoluuttinen pinta-alan pieneneminen on vaatimatonta verrattuna ohutsuolen ennustettuun anatomiseen reserviin. G. lamblia -tartunnan saaneilla ihmisillä on radiologisessa tutkimuksessa merkkejä suoliston hypermotiliteetista (15), ja tämä ilmiö on havaittu myös kokeellisesti tartunnan saaneilla mongolialaisilla gerbiileillä (5). Näiden löydösten taustalla olevat mekanismit ja toiminnallinen merkitys ovat toistaiseksi epäselviä. Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena oli testata hypoteesia, jonka mukaan suoliston hypermotiliteetti edustaa isännän puolustusmekanismia Giardiaa vastaan, käyttämällä hiirimäisiä giardiaasi-malleja.

Aikuiset C57BL/6-, SCID- ja neuronaalisen typpioksidisyntaasin (nNOS) puutoshiiret saatiin Jackson Laboratorysta (Bar Harbor, ME). Giardia muris -infektioita varten kystat puhdistettiin sakkaroosiflotaatiolla, laskettiin hemosytometrillä faasikontrastimikroskoopin alla ja annettiin suun kautta veteen 104 kystaa/hiiri 0,2 ml:ssa (9). G. lamblia -infektioita varten GS/M-kannan (ATCC 50580) (11) trofotsoiitteja kasvatettiin TYIS-33-väliaineessa, ja niitä annettiin suun kautta 107 kystaa/hiiri 0,2 ml:ssa samaa väliainetta (9). Ohutsuolen motiliteetti määritettiin modifioidulla testiateria-menetelmällä. Hiiret paastotettiin yön yli ja niille annettiin 0,2 ml suspensiota, jossa oli 106 fluoresoivaa polystyreenihelmeä (halkaisijaltaan 10 μm Fluoresbrite YG -karboksylaattimikropalloa; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) ja 6 % karmiiniväriainetta 5-prosenttisessa arabikumissa fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Ohutsuoli poistettiin nopeasti 20 minuutin kuluttua, ja karmiiniväriaineen rintaman sijainti ja ohutsuolen koko pituus kirjattiin ylös. Tämän jälkeen suoli jaettiin kahdeksaan samankokoiseen palaan, joista jokainen avattiin pituussuunnassa, asetettiin 2 ml:aan PBS:ää ja jäähdytettiin jäässä 10 minuutin ajan. Seoksia ravisteltiin voimakkaasti trofotsoiittien ja helmien irrottamiseksi, minkä jälkeen ne laskettiin erikseen faasikontrasti- ja fluoresenssimikroskoopilla. Karmiiniväririntaman kulkema matka ilmaistiin prosentteina ohutsuolen koko pituudesta. Helmien lukumäärä segmenttiä kohti ilmaistiin prosentteina ohutsuolen helmien kokonaismäärästä. Sen arvioimiseksi, miten ohutsuolen motiliteetin estäminen vaikuttaa giardiaaliseen puhdistumaan, hiiret infektoitiin ensin suun kautta G. muris tai G. lamblia GS/M -bakteerilla, ja niitä hoidettiin suun kautta joka toinen päivä 7. päivästä alkaen 30 mg/kg loperamidia tai 4. päivästä alkaen 30 mg/kg loperamidia tai PBS:ää (kontrolli). Ohutsuolen trofotsoiittien määrä määritettiin G. muriksen osalta 21. päivänä ja G. lamblian osalta 9. päivänä.

Määrittääksemme, ovatko normaalit aikuiset hiiret sopiva malli tutkittaessa suoliston motiliteetin roolia giardia-infektion kontrolloinnissa, infektoimme 8-10 viikon ikäiset C57BL/6-hiiret luontaisesti esiintyvän hiirissä esiintyvän taudinaiheuttajan, G. muriksen, kystoilla. Ohutsuolen motiliteetti määritettiin testiateria-menetelmällä, jossa käytettiin karmiiniväriainetta nestemäisen faasin merkkiaineena (14) ja 10 μm:n kokoisia polystyreenihelmiä Giardia-trofotsoiittien kokoon verrattavissa olevien hiukkasten merkkiaineena (19). G. muris -tartunta kiihdytti ohutsuolen läpikulkua, sillä sekä karmiiniväriaineen (kuva (kuva 1A)1A) että polystyreenihelmien (kuva (kuva (kuva 1B)1B) rintamat olivat kulkeneet tartunnan saaneilla hiirillä huomattavasti pidemmälle kuin infektoimattomilla kontrolleilla. Tämän ilmiön aikajaksoanalyysi osoitti, että hypermotiliteettia esiintyi viikon kuluessa tartunnasta, mutta se saavutti huippunsa 2-3 viikossa, jolloin trofotsoiittien lukumäärä oli vähentynyt verrattuna lukumäärään maksimaalisen tartunnan aikaan 1 viikossa (kuva (kuva 1A).1A). Näin ollen ohutsuolen motiliteetin maksimimuutokset olivat viivästyneet suhteessa trofotsoiittitaakan huippuun, mikä viittaa siihen, että nämä muutokset voivat johtua muusta mekanismista kuin suorasta giardiaalisesta stimulaatiosta.

Tämä havainto muistuttaa raportteja, joissa on raportoitu Giardian aiheuttamasta suoliston epiteelin mikrovillien häviämisestä, jossa isännän adaptiivisen immuunivasteen on todettu olevan vastuussa (16, 17). Arvioidaksemme, voivatko samankaltaiset mekanismit olla mukana aiheuttamassa ohutsuolen hypermotiliteettia, arvioimme hiiriä, joilla oli vaikea yhdistetty immuunipuutos (SCID-hiiret). Näiltä hiiriltä puuttuu toimivia T- ja B-soluja DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin katalyyttisen alayksikön PRKDC:n vian vuoksi. PRKDC:tä tarvitaan normaaliin V(D)J-rekombinaatioon, eivätkä ne pysty hävittämään Giardiaa (9, 18). SCID-hiirten G. muris -infektio ei muuttanut ohutsuolen läpikulkua, mikä oli jyrkässä ristiriidassa immunokompetenttien kontrollien havaintojen kanssa (kuva (kuva 2).2). Nämä tulokset osoittavat, että giardiaasin aiheuttama ohutsuolen hypermotiliteetti oli riippuvainen patogeeniin kohdistuvan normaalin adaptiivisen immuunivasteen induktiosta.

Testataksemme, vaikuttiko havaittu ohutsuolen hypermotiliteetti Giardian puhdistumiseen, hoidimme hiiriä loperamidilla, lääkkeellä, joka estää suoliston läpikulkuliikkuvuutta aktivoimalla μ-opioidireseptoreja ruoansulatuskanavalla (2, 13, 21). Lääkehoito aloitettiin G. muris -infektion huippuhetkellä (päivä 7), jotta varmistettiin, että farmakologisesti aikaansaadut muutokset liikkuvuudessa eivät häiritsisi infektion alkuvaihetta. Ohutsuolen motiliteetin estäminen loperamidilla heikensi huomattavasti giardiaalista puhdistumaa, ja trofotsoiittien määrä oli 25-kertaisesti suurempi loperamidilla hoidetuissa hiirissä kuin PBS:llä hoidetuissa kontrolleissa 21 vuorokauden kuluttua (kuva (kuva 3).3). Loperamidihoidolla ei ollut vaikutusta adaptiivisen immuniteetin kehittymiseen, sillä hoito ei vaikuttanut suolen limakalvo-eritteiden antigiardiaalisen IgA:n tittereihin (tietoja ei ole esitetty). Lisäksi tämä koestrategia osoitti samanlaisen estävän vaikutuksen hiirien infektioon G. lamblia GS/M:llä, ihmisen giardiapatogeenillä, joka voi infektoida normaaleja aikuisia hiiriä (3, 9). PBS:llä hoidetuilla hiirillä infektio oli suurelta osin hävinnyt 9 päivään mennessä, kun taas loperamidilla 4. päivästä alkaen hoidetuilla hiirillä oli edelleen merkittävä määrä G. lamblia -trofotsoiitteja ohutsuolessa (kuva (kuva 3).3). Näin ollen ohutsuolen motiliteetin estäminen vaaransi Giardian puhdistumisen hiiri-isännässä riippumatta giardia-lajista. Lisämenetelmänä suoliston motiliteetin merkityksen määrittämiseksi giardia-isännän puolustuksessa käytimme geneettistä lähestymistapaa, jossa nNOS-geenin häiritseminen häiritsee tehokasta propulsiota hiirten suolistossa (20). Motiliteettianalyysi vahvisti, että nNOS-puutteisilla hiirillä esiintyi konstitutiivinen viive ruoansulatuskanavan läpikulussa verrattuna niiden villityyppisiin lajitovereihin (Kuva (Kuva 4A).4A). Samanaikaisesti knockout-hiiret eivät pystyneet poistamaan G. lamblia -infektiota normaalisti (kuva (kuva 4B).4B). Näin ollen farmakologisia ja geneettisiä lähestymistapoja käyttäen havaitsimme, että vähentynyt suoliston motiliteetti liittyi isännän puolustuksen heikentymiseen Giardiaa vastaan.

Tutkimuksemme osoittaa, että suoliston hypermotiliteetti on tärkeä isännän puolustus Giardiaa vastaan, mihin johtopäätökseen on päädytty myös toisessa tuoreessa raportissa (10). Tämä puolustus näyttää riippuvan normaalin adaptiivisen immuunivasteen kehittymisestä loista vastaan, sillä sitä ei esiintynyt hiirillä, joilta puuttui T- ja B-soluja, vaikka periaatteessa on mahdollista, että T- tai B-solut edistävät hypermotiliteettia riippumatta niiden roolista adaptiivisessa giardian vastaisessa immuniteetissa. Immuunista riippuvainen hypermotiliteetti toimii isännän puolustautumisessa muita suolistoperäisiä loisia, erityisesti helminttejä vastaan. Esimerkiksi pyöreämadon Trichinella spiralis, joka viettää merkittävän osan elinkierrostaan ohutsuolessa, hävittäminen korreloi vahvasti lisääntyneen suoliston motiliteetin kanssa (4, 23). Samoin rotilla esiintyvän koukkumadon Nippostrongylus brasiliensis karkottamiseen liittyy ohutsuolen hypermotiliteetti, mikä viittaa siihen, että sillä on merkitystä isännän puolustautumisessa tätä helminttiä vastaan (7). Yhteistä kaikille näille suolistopatogeeneille on niiden ensisijainen, joskaan ei yksinomainen, lokalisoituminen suolen luumeniin. Anatomisesta näkökulmasta katsottuna tämä infektiopaikka sijaitsee varsinaisen epiteelillä vuoratun kehon ulkopuolella, eivätkä monet immuunijärjestelmän efektorisolut ja -molekyylit, kuten neutrofiilit tai komplementti, jotka toimivat tehokkaasti elimistössä, pääse sinne helposti. Itse asiassa tehokas mikrobien vastainen puolustus suolen luumenissa on erityinen haaste isännälle, jolla on rajallinen valikoima puolustuskeinoja tässä paikassa. Näistä erittyvää IgA:ta pidetään yleisesti tärkeimpänä luminaalisena puolustusmekanismina, mutta sen todellinen merkitys suolistopuhdistuksessa näyttää vaihtelevan ja saattaa riippua huonosti määritellyistä isännän ja loisen tekijöistä (6, 9, 18). Tietomme ja aiemmat helminttejä koskevat työt (4, 23) viittaavat siihen, että suolen hypermotiliteetti on toinen tärkeä puolustusmekanismi suolen luumenin kolonisaatiota vastaan.

Immuuni-riippuvainen hypermotiliteetti voi tarjota mekanistisen selityksen giardiaasiin liittyvälle ripulille, kuten aiemmissa raporteissa on todettu (5, 15). Periaatteessa ripuli voi johtua vähentyneestä nesteen imeytymisestä tai lisääntyneestä erityksestä tai näiden kahden mekanismin yhdistelmästä. Giardiaasin lisääntyneestä ionien ja nesteen erityksestä on vain vähän näyttöä, joten todennäköiseksi syyksi jää heikentynyt nesteen imeytyminen. Lyhentyneen kontaktiajan luminaalisten nesteiden kanssa, jotka voivat olla nautittuja tai peräisin mahalaukun tai haiman eritteistä, odotetaan heikentävän ionien kuljetuksen tehokkuutta epiteelin läpi, erityisesti kun hypermotiliteetti yhdistetään raportoituihin imeytymiskykyisten epiteelipintojen menetyksiin (16). On kuitenkin huomattava, että hiirillä ei esiinny avointa ripulia Giardia-infektion yhteydessä. On kuitenkin mahdollista, että suolen nestetasapaino on epätasapainossa sekä ihmis- että eläinisännillä ja että se kompensoituu hiirillä mutta ei ihmisillä. Jos hypermotiliteetti todellakin vaikuttaa ripulin patogeneesiin, havaintomme, jonka mukaan SCID-hiirillä ei esiintynyt Giardian aiheuttamaa hypermotiliteettia, viittaisi siihen, että potilailla, joilla on soluvälitteisiä immuunipuutoksia, joihin liittyy lisääntynyt alttius Giardia-infektioille (esim. krooninen vaihteleva immuunipuutos), voi olla pienempi todennäköisyys sairastua infektioon liittyvään ripuliin. Lisäksi tuloksemme viittaavat siihen, että on syytä olla varovainen harkittaessa suoliston motiliteetin estäjien käyttöä Giardian aiheuttaman ripulin hoidossa (1), sillä tällainen hoito voi pitkittää taustalla olevaa infektiota.