- IFN-γ ELISpot-määrityksen optimointi sen jälkeen, kun PBMC:tä oli stimuloitu T-aktivoiduilla® IE-1- ja pp65-CMV-antigeeneillä
- optimoidun CMV-ELISpot-määrityksen lineaarisuus ja tarkkuus
- Tekninen määrityksen validointi: positiivisuuden raja-arvon määrittäminen
- Funktionaalisen määrityksen validointi: T-aktivoidut antigeenit stimuloivat laajan kirjon kliinisesti relevantteja CMV-reaktiivisia efektorisoluja
IFN-γ ELISpot-määrityksen optimointi sen jälkeen, kun PBMC:tä oli stimuloitu T-aktivoiduilla® IE-1- ja pp65-CMV-antigeeneillä
ELISpot-määritykseen käytettiin tuoreeltaan eristettyjä PBMC:tä. Jotta vältettäisiin T-solujen toimintakyvyn heikkeneminen esimerkiksi aktivoituneiden granulosyyttien vuoksi, heparinoituja verinäytteitä käsiteltiin ilman muita lisäaineita 8 tunnin kuluessa. ELISpot-määritysprotokollaa kehitettäessä valittiin kokonaismääräksi 2 × 105 PBMC:tä kuoppaa kohti, koska tämä solumäärä on konfluenssia alhaisempi ja se voidaan tavallisesti saada alle 15 ml:n kokoverinäytteistä. CMV:n välitön varhaisproteiini IE-1 ja myöhäinen kuoriproteiini pp65 ovat hyvin karakterisoituja immunodominantteja T-soluantigeenejä. Täyspitkä IE-1 ja 181 aminohappoa sisältävä pp65:n C-terminaalinen fragmentti tuotettiin ja formuloitiin urean läsnäollessa (T-activation®) niiden stimuloivan kapasiteetin lisäämiseksi erityyppisille CMV:lle reagoiville soluvälitteisen immuniteetin efektorisoluille . Optimaalinen T-activated® -antigeenin pitoisuus määritettiin ensin suorittamalla annosvastekokeita. Yhden terveen CMV-seropositiivisen luovuttajan tuoreet PBMC:t stimuloitiin 31,6 fg/ml-31,6 μg/ml T-activated® pp65:llä tai 0,01-31,6 μg/ml T-activated® IE-1:llä, ja IFN-γ:tä erittävien solujen määrä määritettiin IFN-γ ELISpotilla. T-aktivoitu® pp65 osoitti paljon voimakkaampaa kykyä stimuloida IFN-γ:tä erittäviä efektorisoluja kuin T-aktivoitu® IE-1, sillä se saavutti reaktiivisuuden tasotason välillä 0,316-3,16 ng/ml pp65:llä vs. noin 31,6 μg/ml IE-1:llä (kuva 1). Näin ollen T-aktivoidun® antigeenin pitoisuudet 3 μg/ml pp65 ja 15 μg/ml IE-1 valittiin PBMC-stimulaatioita ja ELISpot-määrityksiä varten.
Määrityksen herkkyys ja spesifisyys määritettiin stimuloimalla 10:ltä CMV-seropositiiviselta ja CMV-seronegatiiviselta terveeltä luovuttajalta eristettyä PBMC:tä määritellyillä pp65- ja IE-1 T-aktivoidun® antigeenin pitoisuuksilla. Reaktiivisten efektorisolujen määrä kvantifioitiin IFN-γ ELISpotilla. Merkittävä stimulaatio määriteltiin Mann-Whitneyn U-testillä tilastollisesti merkitseväksi eroksi stimuloimattomien ja CMV-antigeenin stimuloimien olosuhteiden SFC-arvojen välillä (kukin nelinkertaisena). T-activated® pp65 ja IE-1 saivat aikaan merkittävän reagoivien efektorisolujen aktivoitumisen 10:ssä 10:stä ja 9:ssä 10:stä yksittäisten CMV-seropositiivisten luovuttajien PBMC-valmisteista (kuva 2). Tässä ryhmässä T-aktivoitu® pp65 osoitti yleisesti ottaen suurempaa kykyä aktivoida reagoivia soluja: mediaani oli 399 SFC/200 000 PBMC (vaihteluväli 12-864 SFC/200 000 PBMC) verrattuna T-aktivoituun® IE-1:een, jonka mediaani oli 26 SFC/200 000 PBMC (vaihteluväli 1,3-96 SFC/200 000 PBMC). CMV-seropositiivisten luovuttajien yksittäisissä näytteissä havaittiin kuitenkin huomattava, jopa 96 SFC/200 000 PBMC:n vaste T-aktivoituun® IE-1:een (kuva 2). Kaikki 10 PBMC-näytettä (100 %) eri CMV-seronegatiivisilta luovuttajilta osoittivat negatiivisia testituloksia pp65-stimulaation jälkeen (mediaani 0,3 SFC/200 000 PBMC; vaihteluväli 0-2,8), kun taas yhdeksän kymmenestä (90 %) CMV-seronegatiivisilta henkilöiltä saaduista PBMC-näytteistä oli negatiivisia IE-1-stimulaation jälkeen (mediaani 2,9 SFC/200 000 PBMC; vaihteluväli 0,3-6,8). Pilkkujen määrä CMV-seronegatiivisissa IE-1-stimuloidussa PBMC:ssä oli suurempi kuin CMV-seronegatiivisissa pp65-stimuloidussa PBMC:ssä, mutta se ei ylittänyt 7 SFC/200 000 PBMC:tä (kuvio 2).
IFN-γ:n on osoitettu erittyvän jatkuvasti antigeenistimulaation aikana. Siten signaalin voimakkuus IFN-γ ELISpotissa on riippuvainen stimulaation kestosta . Kirjallisuudessa ilmoitettu antigeenistimulaation kesto IFN-γ ELISpotissa vaihtelee yleensä 16-24 tunnin välillä . Inkubaatioajan vaikutuksen selvittämiseksi testituloksiin IFN-γ ELISpot -testit suoritettiin kolmelta riippumattomalta CMV-seropositiiviselta terveeltä luovuttajalta peräisin olevalle PBMC:lle sen jälkeen, kun sitä oli stimuloitu T-aktivoidulla® pp65- ja IE-1-antigeenillä 17, 19 ja 21 tunnin ajan. SFC-lukumäärissä ei havaittu tilastollisesti merkitseviä eroja näiden kolmen olosuhteen välillä (kuva 3), mikä osoittaa signaalin pysyvyyttä tällä aikavälialueella. Näin ollen optimoituun ELISpot-määritykseen valittiin inkubaatioaika 19 h.
Antigeenistimulaation keston vaikutus IFN-γ ELISpot-testituloksiin. SFC-lukemat (neljän toistokerran keskiarvot) IFN-γ ELISpotissa sen jälkeen, kun kolmelta CMV-seropositiiviselta terveeltä luovuttajalta (d120, 32-vuotias mies; d254, 62-vuotias nainen; d270, 22-vuotias nainen) peräisin olevia PBMC-näytteitä oli stimuloitu T-aktivoidulla® IE-1:llä tai pp65:llä 17, 19 ja 21 tunnin ajan. Stimuloimatonta PBMC:tä (neg.) käytettiin negatiivisena kontrollina. Stimulaation kestojen väliset erot testattiin käyttäen ei-parametrista kaksipuolista yksisuuntaista ANOVA Kruskal-Wallisin testiä (*P < 0,05). P-arvoja < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevinä
Lukuiset protokollan muuttujat voivat vaikuttaa ELISpot-testituloksiin. Esimerkiksi primaarisoluviljelyssä käytetty väliaine sisältää usein seerumia, joka sisältää erilaisia eristä riippuvaisia, ei-karakterisoituja bioaktiivisia molekyylejä eri pitoisuuksina . Standardoitujen soluviljelyolosuhteiden määrittelemiseksi tutkittiin erilaisten seerumia sisältävien väliaineiden (RPMI 1640, jota on täydennetty 5 %:lla joko FCS:llä, ihmisen AB:llä, synteettisellä NTA:lla tai synteettisellä NTS:llä) ja seerumivapaiden väliaineiden (AIM-V®, UltraCulture) vaikutusta määritystulokseen. Seerumivapaalla väliaineella saatiin parhaat efektorisoluvasteet, jotka olivat verrattavissa 5 %:lla FCS:llä täydennetyn RPMI 1640:n vasteeseen (kuva 4a). Lisäksi AIM-V®:n taustasignaalit olivat alhaisimmat stimuloimattomissa olosuhteissa (kuva 4b), mikä maksimoi signaali-kohinasuhteen. Näin ollen ELISpot-protokollaa vakiinnutettiin edelleen käyttämällä AIM-V®:n seerumivapaata väliaineita.
Erilaisten soluviljelyalustojen arvioiminen IFN-γ ELISpotin suorituskyvyn kannalta. a Boxplot-kaavio, jossa esitetään ELISpot-tulokset stimuloitaessa 10 CMV-seropositiivisen terveen verenluovuttajan (mediaani-ikä ja vaihteluväli 31 (26-54) vuotta; 40 % miehiä ja 60 % naisia) PBMC:tä T-aktivoidulla® pp65:llä eri soluviljelymedioissa. Mediaaniarvot (vaakasuorat mustat viivat) on merkitty sulkuihin. Stimuloitujen olosuhteiden väliset erot väliaineolosuhteiden välillä testattiin käyttämällä ei-parametrista kaksipuolista yksisuuntaista ANOVA Kruskal-Wallisin testiä (p = 0,613). b AIM-V:ssä tai UltraCulture (UC) -seerumittomassa väliaineessa inkuboitujen ei-stimuloitujen solujen ELISpot-tulokset esitetään erikseen laajennetulla Y-akselin asteikolla. Molempien olosuhteiden väliset erot testattiin käyttämällä ei-parametrista kaksipuolista MWU-testiä (p = 0,074). P-arvoja < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevinä. Seerumia sisältävät väliaineet koostuivat RPMI 1640:stä, jota oli täydennetty 5 % seerumilla (R5): FCS, NTA, NTS tai ihmisen AB (hAB)
ELISpot-määritykset voidaan tehdä erilaisilla kalvomateriaaleilla, mukaan lukien nitroselluloosa (NC), sekaselluloosaesteri (MCE) ja polyvinyylideenifluoridi (PVDF). Vertailimme IFN-γ ELISpot-tuloksia kuuden terveen henkilön PBMC-näytteistä (neljä toistoa kustakin, kaksi valmistetta per luovuttaja) käyttäen yleisimmin käytettyjä MCE-levyjä, PVDF-levyjä ja Milliporen (Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Saksa) PVDF-nauhoja. PVDF-kalvot on aktivoitava etanolilla ennen sieppausvasta-aineen sitomista. Lisäksi PVDF-pohjaisia levyjä käytettäessä tarvittiin tiukempia pesuvaiheita ennen spot-kehitystä kuin MCE-levyjä käytettäessä, jotta vältettäisiin kalvojen ei-toivottu taustavärjäytyminen. Havaittujen täplien resoluutio terävyyden ja homogeenisuuden osalta oli kuitenkin parempi PVDF-kalvoilla (ei esitetty), mikä johti suurempiin täplien lukumääriin kuin MCE-kalvoilla (jopa 10-kertainen määrä IE-1-stimulaatioiden tapauksessa, jolloin SFC:n mediaani oli 155 vs. 13/200 000 PBMC:tä; kuva 5). Koska PVDF 8-kuoppaliuskat olivat suorituskykyisempiä ja koska niiden käyttö saattaisi mahdollistaa kustannusten alentamisen erityisesti silloin, kun kliinisessä rutiinissa testataan yksittäisiä potilasnäytteitä, PVDF 8-kuoppaliuskaformaatti valittiin optimoitua määrityskehitystä varten.
Mikrotiterilevyjen optimaalinen päällystäminen sieppausvasta-aineella on ratkaisevan tärkeää testin vankan suorituskyvyn kannalta. PVDF-kalvoon sitoutuneen IFN-γ-sieppausvasta-aineen tiheyden ei pitäisi olla rajoittava, ja sen pitäisi erityisesti mahdollistaa suurten pistemäärien luotettava havaitseminen. PVDF-liuskat päällystettiin anti-IFN-γ-vasta-aineen kasvavilla pitoisuuksilla (2,5-7,5 μg/ml). PBMC viideltä CMV-seropositiiviselta luovuttajalta kylvettiin päällystettyihin kuoppiin ja jätettiin joko stimuloimatta tai stimuloitiin T-aktivoidulla® IE-1:llä tai pp65:llä. Vasta-ainepitoisuuksien lisääminen välillä 2,5-7,5 μg/ml ei vaikuttanut taustavärjäytymiseen stimuloimattomissa PBMC:ssä (SFC:n mediaani 0-0,5/200 000 PBMC:tä IFN-γ:n sieppausvasta-ainepitoisuudesta riippumatta; kuvat 6a-b). Vastaavasti IE-1-spesifiset matalat tai kohtalaiset SFC-tasot (mediaanit 19-26 SFC/200 000 PBMC) olivat vertailukelpoisia kaikissa päällystysvasta-aineolosuhteissa (kuva 6a). Sama päti pp65-spesifisiin vasteisiin aina ~300 SFC/200 000 PBMC:hen asti (luovuttajat d032, d120 ja d241; kuva 6c). Sitä vastoin yksittäisillä luovuttajilla, joiden pistemäärät olivat suurempia (esim. d172, d202; kuva 6c), pp65-reaktiivisten solujen havaitseminen lisääntyi annosriippuvaisesti päällystyksessä käytetyn IFN-γ-sieppausvasta-aineen konsentraation myötä, erityisesti välillä 2,5-5 μg/ml vasta-ainetta. Vasta-ainepitoisuuksilla 5 μg/ml ja sitä suuremmilla pitoisuuksilla pistemäärät pysyivät vakaina (kuvat 6b-c). Näiden tulosten perusteella optimoidussa ELISpot-protokollassa pinnoitukseen valittiin 5 μg/ml IFN-γ-sieppausvasta-aineen pitoisuus.
Ifn-γ-sieppausvasta-aineen titraus. Viiden CMV-seropositiivisen terveen luovuttajan (mediaani-ikä ja vaihteluväli 31 (22-49) vuotta; 1 mies ja 4 naista) PBMC:t (neljä toistoa kukin) kylvettiin PVDF-mikrotiteriliuskoille, jotka oli päällystetty IFN-γ-kiinnitysvasta-aineen kasvavilla pitoisuuksilla (2,5-7,5 μg/ml). Solut jätettiin stimuloimatta (neg.) (a, b) tai stimuloitiin T-aktivoidulla® IE-1 (a) tai pp65 (b, c) CMV-antigeenillä, kuten edellä. SFC-keskiarvot 200 000 PBMC:tä kohti esitetään laatikkokuvioina viiden luovuttajan kollektiivista (mediaaniarvot ilmoitettu suluissa) (a, b) ja histogrammeina (c) pp65-stimuloidusta PBMC:stä yksittäisten luovuttajien (d032, d120, d172, d202, d241). Päällystysolosuhteiden väliset erot testattiin käyttäen ei-parametrista kaksipuolista yksisuuntaista ANOVA Kruskal-Wallisin testiä (*P < 0.05; **P < 0.01)
ELISpot-määritykset perustuvat vangitun sytokiinin havaitsemiseen sytokiinispesifisillä vasta-aineilla, jotka voidaan joko kytkeä suoraan toimittajaentsyymiin (yksivaiheinen määrityskehitys), kuten emäksiseen fosfataasiin (AP), tai biotinyloidun sekundäärisen vasta-aineen ja streptavidiinikonjugoidun toimittajaentsyymin yhdistelmällä (kaksivaiheinen määrityskehitys). Yksivaiheinen määrityskehitys säästää käsittelyaikaa ja ehkäisee käyttäjän virheitä. AP-konjugoitua mAb:tä (7-B6-1) (MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, Saksa) käytettiin havaintokonjugaattina standardoidussa ELISpot-protokollassa. Erilaisia inkubaatioparametreja (esim. 0,5 – 3 h 37 °C:ssa, 2 h huoneenlämmössä ) testattiin. Pistemäärät olivat vertailukelpoisia kaikissa olosuhteissa. Pilkkujen morfologia ja siten asianmukainen havaitseminen oli kuitenkin parasta, kun AP-konjugaattia inkuboitiin 2 tuntia RT:ssä, verrattuna muihin olosuhteisiin (ei esitetty). Tunnistuskonjugaatin konsentraation nostaminen 0,025 U/ml:stä 0,4 U/ml:iin johti pp65:n SFC:n mediaaniarvojen lievään nousuun, ja enimmäispistemäärät ylittivät kaksivaiheisella määrityskehityksellä saadut arvot (ei esitetty). Sen vuoksi valittiin yksivaiheinen määrityskehitys 2 h:n ajan RT:ssä 0,4 U/ml:n detektiokonjugaatilla.
Lopuksi SFC-värjäysreaktion standardointia käsiteltiin määrityksen optimoinnin loppuun saattamiseksi. AP-substraatin kanssa inkuboinnin kesto vaikuttaa täplien kokoon ja/tai taustatasoon ja on siten kriittinen tekijä luotettavan täplien laskennan kannalta. Värjäysliuoksena käytettiin yksivaiheista kromogeenistä alkalista fosfataasisubstraattia NBT/BCIP (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA), ja inkubointiaikoja arvioitiin pimeässä 2-13 minuutin välillä. SFC-lukemat olivat vertailukelpoisia kaikissa olosuhteissa. Lyhyemmät inkubaatioajat johtivat kuitenkin pienempiin täplien halkaisijoihin, kun taas pidemmät inkubaatioajat lisäsivät taustatasoja (tietoja ei ole esitetty). Siksi optimoidulle ELISpot-protokollalle määriteltiin kuuden minuutin värjäytymisaika pimeässä.
optimoidun CMV-ELISpot-määrityksen lineaarisuus ja tarkkuus
Optimoitua ELISpot-protokollaa käytettiin määrittämään PBMC:n työalue, jolla varmistetaan määrityksen lineaarisuus. Yhden terveen CMV-seropositiivisen luovuttajan PBMC:t kylvettiin tiheydellä, joka vaihteli välillä 2 × 104-2,5 × 105 PBMC:tä kuoppaa kohti. Kun solumäärät olivat 6 × 104-2 × 105 PBMC:tä kuoppaa kohti, ELISpot-laskenta oli suoraan verrannollinen kylvettyjen PBMC:ien määrään sen jälkeen, kun soluja oli stimuloitu joko IE-1:llä (lineaarinen regressioanalyysi; R2 = 0,97) tai pp65:llä (R2 = 0,99) (kuva 7a). IE-1-stimulaatiosta johtuvan yleensä alhaisemman pistemäärän vuoksi standardoidussa ELISpot-määrityksessä käytettiin 2 × 105 PBMC:tä kuoppaa kohti, jotta varmistettiin riittävät SFC-arvot.
IFN-γ-ELISpot-määrityksen lineaarisuus. a Työskentelyalue PBMC:n määrä ELISpot-määritystä kohti. Yhden CMV-seropositiivisen terveen luovuttajan PBMC:tä kylvettiin kasvava määrä kuoppaa kohti, ja ELISpot-määritykset suoritettiin kuvatulla tavalla T-aktivoidulla® IE-1:llä tai pp65:llä stimuloinnin jälkeen. Keskimääräiset SFC-arvot ja standardipoikkeama, jotka saatiin 60 000-200 000 PBMC:llä kuoppaa kohti, on kuvattu. Y-akselien mittakaavaa säädettiin pp65:n (vasemmalla) ja IE-1:n (oikealla) osalta tietojen erottelukyvyn parantamiseksi. b CMV-reaktiivisten PBMC:iden määrän ja lasketun SFC:n välinen lineaarisuus. Ilmoitettu määrä PBMC:tä yhdeltä CMV-seropositiiviselta terveeltä luovuttajalta sekoitettiin yhdeltä CMV-seronegatiiviselta luovuttajalta saatuihin PBMC:iin (enintään 200 000 PBMC:tä yhteensä) ja stimuloitiin T-aktivoidulla® pp65-antigeenillä optimoidun protokollan mukaisesti. Nelinkertaisten mittausten keskimääräiset SFC-arvot ja keskihajonta esitetään kahdelle luovuttajaparille (d034 + d219, d204 + d067). Molemmissa paneeleissa regressiosuorat ja vastaavat determinaatiokertoimet R2 on luotu GraphPad Prism 5:n regressiosuoratyökalulla.04
CMV-reaktiivisten efektorisolujen lukumäärän ja lasketun SFC:n välisen lineaarisuuden lisätarkistamiseksi kylvettiin kasvava määrä PBMC:tä yhdeltä CMV-seropositiiviselta terveeltä luovuttajalta, ja PBMC:n kokonaismäärä säädettiin 2 x 105:een kuoppaa kohti käyttämällä PBMC:tä yhdeltä CMV-seronegatiiviselta luovuttajalta. Näihin kokeisiin valittiin kaksi luovuttajaparia (d034 + d219, d204 + d067), jotka eivät osoittaneet allo-reaktiivisuutta 19 tunnin yhteiskulttuurissa. Alhaisten SFC-lukujen vuoksi (alle 20 SFC/200 000 PBMC) IE-1-stimulaatiotulokset osoittivat suurempaa vaihtelua verrattuna pp65:een, eikä niiden perusteella voitu laskea luotettavaa lineaarisuutta (R2-arvot alle 0,96; tietoja ei ole esitetty). ELISpot-määrityksen tulokset pp65-stimulaation jälkeen osoittivat hyvää lineaarista korrelaatiota molemmille luovuttajapareille, ja R2-arvot olivat lineaarisessa regressioanalyysissä 0,99 (d034 + d219) ja 0,98 (d204 + d067) (kuva 7b).
Optimoidun määrityksen tarkkuutta ja toistettavuutta arvioitiin laskemalla määrityksen sisäinen, määritysten välinen, operaattoreiden välinen ja toimipisteiden välinen vaihtelu. Kussakin tapauksessa testattiin kolmelta CMV-seropositiiviselta terveeltä luovuttajalta peräisin olevaa PBMC:tä nelinkertaisesti, ja vaihtelua arvioitiin laskemalla variaatiokerroin (CV), joka määritellään keskihajonnan ja keskiarvon suhteena. CV:tä ei laskettu ELISpot-arvoille < 10 SFC/200 000 PBMC (ks. positiivisuuden raja-arvon laskeminen jäljempänä). Tutkimuksen sisäinen CV oli 14 % IE-1-stimulaatiossa ja 6 % pp65-stimulaatiossa (Additional File 1: Table S1). Tutkimusten välinen CV ei ylittänyt 17 % IE-1:n ja 22 % pp65:n osalta (Additional File 1: Table S2). Toimijoiden välinen CV oli alle 13 % IE-1:llä ja 18 % pp65:llä (lisätiedosto 1: taulukko S3). Lopuksi arvioitiin tutkimuskohteiden välinen vaihtelu, joka on olennaista määrityksen validoinnissa diagnostisia tarkoituksia varten. Kokoverinäytteet kerättiin samanaikaisesti kolmelta CMV-seropositiiviselta terveeltä luovuttajalta ja lähetettiin (vakio-olosuhteissa RT:ssä) neljään eri laboratorioon Saksassa. PBMC:t eristettiin tuoreeltaan ja ELISpot-määritykset tehtiin optimoidun protokollan mukaisesti yhteensä 7 toimijan toimesta. Kohteiden välinen CV oli korkeintaan 39 % IE-1:n osalta ja 28 % pp65:n osalta (Lisätiedosto 1: Taulukko S4).
Vähintään neljän riippumattoman mittauksen arviointia on suositeltu tilastollisesti merkitsevien ELISpot-tulosten saamiseksi. Selvittääksemme toistojen sisäisen vaihtelun vaikutuksen määrityksen tulokseen vertasimme ELISpot-tuloksia kunkin kontrolli- ja antigeenistimulaation viisinkertaisista ja nelinkertaisista mittauksista. Testituloksissa ei havaittu merkittävää vaihtelua (tietoja ei ole esitetty). Näin ollen stimuloimattomien ja T-aktivoitujen® IE-1- ja pp65-stimuloitujen olosuhteiden nelinkertaiset mittaukset mahdollistavat määrityksen luotettavuuden sekä käytännöllisyyden yhdessä 8-kuoppaliuskojen käytön kanssa.
Stafylokokki-enterotoksiini B (SEB) on voimakas superantigeeni ja fytohemagglutiniini (PHA) voimakas mitogeeni, jotka molemmat indusoivat massiivista IFN-γ:n erittymistä T-soluista . Näin ollen SEB ja PHA ovat sopivia positiivisia kontrolleja solujen elinkelpoisuuden, sytokiinien erittymisen onnistuneen stimuloinnin ja T-solujen yleisen toimivuuden kannalta. Tämä on erityisen tärkeää tulosten tulkinnan kannalta silloin, kun T-solujen esiintymistiheys on alhainen, esimerkiksi allogeenisen kantasolusiirron vastaanottajilla. Optimoidussa ELISpot-määrityksessä testinäytteiden stimulaatiot joko SEB:llä tai PHA:lla tehdään kahtena kappaleena.
Lisäksi luotiin efektorisoluista riippumaton operaattorikontrolli määrityksen asianmukaisen suorituskyvyn validoimiseksi. Tämä operaattorikontrolli perustuu rekombinanttisen IFN-γ:n havaitsemiseen, kun sitä inkuboidaan suoraan immobilisoidun anti-human-IFN-γ mAb (1-D1K) -kaappausvasta-aineen kanssa. Tämän myös kahtena kappaleena suoritetun kontrollin pitäisi johtaa PVDF-kalvon homogeeniseen tummaan värjäytymiseen.
Tekninen määrityksen validointi: positiivisuuden raja-arvon määrittäminen
Tekninen raja-arvo määrityksen tuloksen tulkinnan helpottamiseksi ja spesifisyyden maksimoimiseksi (eli väärien positiivisten tuloksien välttämiseksi stimuloimattomissa oloissa ja stimuloiduissa oloissa CMV:n aiheuttaman verenvuotoviruksen suhteen seronegatiivisilla yksilöillä) määriteltiin tekninen raja-arvo. IFN-γ ELISpot-määritykset tehtiin optimoidun protokollan mukaisesti 45 terveen luovuttajan PBMC:lle, joista 32 oli CMV IgG-seropositiivisia (taulukko 1).
Stimuloimattomasta PBMC:stä saatujen SFC-arvojen mediaani ja vaihteluväli olivat vertailukelpoisia CMV-seronegatiivisten ja CMV-seropositiivisten henkilöiden välillä . CMV-seronegatiivisten henkilöiden IE-1- ja pp65-stimuloidun PBMC:n pistemäärät olivat alhaisia . CMV-seropositiivisilla henkilöillä IE-1- ja pp65-stimuloidun PBMC:n SFC-tasot olivat 1114 ja 954 pistemäärää/200 000 PBMC (mediaani 22 ja 265; kuva 8). Teknisen raja-arvon määrittämiseksi otettiin huomioon pistemäärät CMV-seronegatiivisten ja CMV-seropositiivisten henkilöiden stimuloimattomassa kontrollissa sekä T-aktivoidussa® pp65- ja IE-1-stimuloidussa tilassa. Positiivisuuskynnys määritettiin käyttämällä z-statistiikkaa (α-taso = 0,05) log10-muunnetuille geometrisille keskiarvoille. Arvot = 0 korvattiin arvoilla lähellä toteamisrajaa, jonka oletettiin olevan 0,5. ELISpot-mittausten keskihajonta (SD) stimuloimattoman kontrollin, IE-1-stimulaation ja pp65-stimulaation osalta oli vastaavasti 0,234, 0,192 ja 0,136. Kun SD on 0,2 ja oletetaan, että jokaisesta negatiivisesta kontrollista ja testinäytteestä mitataan neljä toistoa, laskettiin kriteeri, jonka mukaan stimuloitujen ja stimuloimattomien arvojen geometristen keskiarvojen suhde on vähintään 2,5. Tämän kriteerin perusteella laskettiin, että stimuloitujen ja stimuloitujen arvojen geometristen keskiarvojen suhde on vähintään 2,5. Toisaalta tarkkuusprofiilit luotiin sekä IE-1- että pp65-spesifisistä testituloksista, jolloin enintään 40 prosentin variaatiokerrointa (CV) käytettiin määrityksen validiteetin hyväksymisrajana vastaavan määritysrajan (LoQ) määrittämiseksi. 45 terveestä luovuttajasta saatujen IE-1- ja pp65-spesifisten ELISpot-tulosten tarkkuusprofiilien LoQ-arvoiksi saatiin 8,6 ja 7,1 (lisätiedosto 2). Huomattakoon, että 124 hemodialyysipotilaan kohortista tehdyssä vastaavassa analyysissä saatiin vertailukelpoiset SD-arvot stimuloimattomissa ja antigeenin stimuloimissa olosuhteissa (vaihteluväli 0,199-0,240), ja LoQ-arvoiksi saatiin 7,8 (IE-1) ja 8,3 (pp65). Näiden analyysien perusteella positiivisten testitulosten määrittelyyn valittiin raja-arvoksi 10 SFC/200 000 PBMC.
Testin validointi immunokompetenteilla luovuttajilla. 45 terveen luovuttajan (taulukko 1) kokoverestä eristetyt PBMC:t määritettiin optimoidulla IFN-γ ELISpotilla. Positiivisuuden raja-arvoksi määriteltiin 10 SFC/200 000 PBMC (harmaa vaakasuora katkoviiva) (ks. teksti ja lisätiedosto 2). Testitulos katsotaan positiiviseksi, kun geometrinen keskiarvo vähintään yhdessä IE-1- tai pp65-stimuloidussa lähestymistavassa on ≥ 10 SFC/200 000 PBMC ja kun stimuloitujen ja stimuloimattomien olosuhteiden geometristen keskiarvojen suhde on ≥ 2.5, optimoidun IFN-γ ELISpot-testin tulosten positiivinen yhdenmukaisuus (herkkyys) ja negatiivinen yhdenmukaisuus (spesifisyys) CMV-serologian kanssa tässä terveiden luovuttajien kollektiivissa oli 97 % ja 85 %
Yhteensä, käyttämällä T-aktivoituja® pp65- ja IE-1-antigeenejä ja optimoitua IFN-γ ELISpot-testiä testituloksia pidetään positiivisina, jos pp65- tai IE1-stimulaatioiden tuloksena saatujen täplien geometrinen keskiarvo on ≥ 10 SFC/200 000 PBMC:tä ja jos stimuloitujen ja ei-stimuloitujen olosuhteiden geometristen keskiarvojen suhde on ≥ 2.5. Näiden määritelmien mukaisesti 45 terveen luovuttajan (32 CMV IgG-seropositiivista, 13 CMV IgG-seronegatiivista) kollektiivinen tutkimus osoitti, että sensitiivisyys (määriteltynä positiivisena yksimielisyytenä ensisijaisena vertailumittausmenetelmänä käytetyn CMV IgG-serologian kanssa) oli 97 % ja spesifisyys (negatiivisena yksimielisyytenä CMV IgG-serologian kanssa) 85 % (kuvio 8).
Funktionaalisen määrityksen validointi: T-aktivoidut antigeenit stimuloivat laajan kirjon kliinisesti relevantteja CMV-reaktiivisia efektorisoluja
Urea-formuloidut rekombinanttiproteiinit (T-aktivoidut®-proteiinit) prosessoidaan sekä eksogeenisen (MHC-luokka II) että endogeenisen (MHC-luokka I) antigeenin prosessointi- ja esitystapojen avulla . PBMC:n stimulointi T-aktivoiduilla® proteiineilla jäljittelee siten tarkemmin luonnollista infektiota, mikä saattaa johtaa kliinisesti merkityksellisten CMV-reaktiivisten solujen (esim. Th-, CTL-, NK- ja NKT-solut) laajan kirjon aktivoitumiseen, mikä saattaa osaltaan vaikuttaa IFN-γ ELISpot -määrityksen suureen herkkyyteen. T-aktivoitujen® IE-1- ja pp65-antigeenien kohteena olevien solujen tarkemmaksi luonnehtimiseksi ja efektorisolujen vasteen mahdollisen yksilöllisen vaihtelun tutkimiseksi solunsisäiset IFN-γ-värjäykset ja virtaussytometria-analyysit tehtiin samanaikaisesti IFN-γ ELISpot -määritysten kanssa. Kuuden CMV-seropositiivisen terveen luovuttajan tuoreet PBMC:t stimuloitiin T-aktivoiduilla® IE-1- ja pp65-proteiineilla 19 tunnin ajan ja IFN-γ:tä tuottavat solut laskettiin optimoidun ELISpot-määrityksen mukaisesti. Samoja PBMC-valmisteita (4 toistoa kutakin) stimuloitiin 6 tunnin ajan samalla erällä T-aktivoituja® IE-1- ja pp65-proteiineja rinnakkaisstimuloivien anti-CD28- ja anti-CD49d-vasta-aineiden läsnä ollessa. Pintamerkkiaineet (CD3, CD4, CD8, CD56) ja solunsisäinen IFN-γ-värjäytyminen analysoitiin virtaussytometrialla, kuten kohdassa Menetelmät on kuvattu. CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3+CD56+ (NKT:n kaltaiset) ja CD3-CD56+ (NK) lymfosyyttien IFN-γ+-alipopulaatiot laskettiin lisätiedostossa 3 esitetyn porttistrategian mukaisesti. Kaikki kuusi luovuttajaa erosivat toisistaan kyvyssä saada aikaan IE-1- ja/tai pp65-riippuvainen vaste IFN-γ ELISpot -testissä. Myös vasteen voimakkuus oli heterogeeninen kuuden luovuttajan välillä, ja arvot vaihtelivat 7:stä 1 054:een SFC:hen (IE-1-stimulaatio) ja 28:sta 780:aan SFC:hen (pp65-stimulaatio) 200 000:ta PBMC:tä kohti (kuva 9a). Vastaavasti yksittäiset luovuttajat erosivat toisistaan virtaussytometrialla tutkittujen eri solusalipopulaatioiden frekvenssin ja suhteen osalta (kuva 9b). Mielenkiintoista on, että terveillä CMV-seropositiivisilla henkilöillä, joilla oli alhaisemmat pistemäärät (d120, d300, d343; kuva 9a), oli myös alhaisempi IFN-γ+-lymfosyyttien taajuus virtaussytometriassa (kuva 9b), mikä korostaa ELISpot-määrityksen kykyä erottaa alhaiset ja korkeat vasteet. Jokaisen tutkitun lymfosyyttien osapopulaation aktivoituminen havaittiin joillakin mutta ei kaikilla luovuttajilla. Esimerkiksi CD4+ T-solujen heikkoa tai voimakasta aktivoitumista havaittiin neljällä luovuttajalla kuudesta (d120, d172, d300, d343) vasteena joko IE-1:lle, pp65:lle tai molemmille. Vastaavasti viidellä kuudesta luovuttajasta (d172, d290, d300, d343, d361) havaittiin CD8+ T-solujen aktivoitumista jommassakummassa tai molemmissa stimulaatio-olosuhteissa. CD3-CD56+ (NK-solut) näkyivät yhdellä luovuttajalla (d120) vasteena molemmille antigeeneille. CD3+CD56+ (NKT:n kaltaiset) solut aktivoituivat heikosti neljällä yksilöllä kuudesta (d120, d172 d300, d361) vasteena sekä IE-1:lle että pp65:lle (kuva 9b). Huomionarvoista on, että voimakas pp65-spesifinen CD4+-aktivoituminen d172:ssa korreloi voimakkaan pp65-spesifisen vasteen kanssa ELISpotissa, ja voimakas pp65-spesifinen (d290) ja IE-1-spesifinen (d361) CD8+-aktivoituminen liittyi korkeaan pistemäärään vastaavassa ELISpotissa (kuvat 9a-b), mikä viittaa siihen, että nämä CMV:n kanssa reagoivat efektorisolut vaikuttavat merkittävästi havaittuihin ELISpotin signaaleihin. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat T-aktivoitujen® IE-1- ja pp65-proteiinien kyvyn stimuloida monenlaisia CMV-spesifisiä efektorisoluja. Nämä kokeet paljastivat myös vasteiden suuren heterogeenisuuden terveiden CMV-seropositiivisten henkilöiden keskuudessa. Erityisesti havainto siitä, että jotkut henkilöt reagoivat joko IE-1:een tai pp65:een, korostaa molempien antigeenien vasteen arvioinnin tärkeyttä. Sekä IE-1- että pp65-spesifisten vasteiden seuranta optimoidussa IFN-γ ELISpot-määrityksessä saattaa parantaa testin yleistä herkkyyttä.
T-aktivoidut® pp65- ja IE-1-CMV-antigeenit stimuloivat laajaa joukkoa CMV:n kanssa reagoivia efektorisoluja. IFN-γ:tä erittävien solujen vertaileva analyysi ELISpotilla (a) ja virtaussytometrialla (b) PBMC:n stimuloinnin jälkeen T-aktivoidulla® pp65- ja IE-1-antigeenillä. Kuuden CMV-seropositiivisen terveen luovuttajan (iän mediaani ja vaihteluväli 39 (22-55) vuotta; 2 miestä ja 4 naista) PBMC:tä (4 toistoa kutakin) stimuloitiin T-aktivoidulla® pp65- ja IE-1-antigeenillä optimoidun IFN-γ-ELISpot-menetelmän (a) ja menetelmissä kuvatun solunsisäisten ja pintamarkkereiden värjäysprotokollan ja virtaussytometrian mukaisesti (b). Pylväsdiagrammit kohdassa (a) kuvaavat IFN-γ-riippuvaista SFC:tä 200 000 PBMC:tä kohti, kuten edellä. Pylväsdiagrammit kohdassa (b) kuvaavat IFN-γ:tä ilmentävien CD3+CD4+ (Th), CD3+CD8+ (CTL), CD3-CD56+ (NK) ja CD3+CD56+ (NKT:n kaltaiset) solujen lukumäärää 200 000 lymfosyyttiä kohti. Huomaa, että Y-akselin asteikot kohdassa (b) on mukautettu vastaavien tietojen paremman resoluution saavuttamiseksi. Luovuttajien yksilöllinen ikä ja sukupuoli olivat seuraavat: d120, 37-vuotias mies; d172, 55-vuotias nainen; d290, 46-vuotias nainen; d300, 41-vuotias nainen; d343, 24-vuotias nainen; d361, 22-vuotias mies
.