Abstract

Tausta ja tavoite. Luotettava ei-invasiivinen ennustusväline paksu- ja peräsuolisyövän (CRC) seulontaan, diagnosointiin ja/tai vaiheistukseen ennen leikkausta on ratkaisevan tärkeä hoidon valinnan ja ennusteen kannalta. Menetelmät. Tammikuun 1. päivän 2015 ja joulukuun 31. päivän 2018 välisenä aikana CRC:n alkuhoitoon otetut potilaat haettiin ja käytiin läpi. CD16+CD56+ luonnollisten tappajasolujen (NK) tietueet analysoitiin CRC:n vaiheiden mukaan. Tulokset. Terveiden, vaiheen I, vaiheen II, vaiheen III ja vaiheen IV CRC-potilaiden pätevien osallistujien määrä oli 60, 66, 60, 70 ja 68. Verenkierrossa olevien CD16+CD56+ NK-solujen määrässä oli merkittävä ero terveiden ryhmän ja CRC-ryhmän välillä () sekä terveiden ryhmän ja vaiheen III tai IV CRC-ryhmän välillä ( ja 0,001). Verenkierrossa olevien CD16+CD56+ NK-solujen prosenttiosuus lymfosyyteistä korreloi negatiivisesti CRC:n esiintymisen kanssa. Kun verrattiin vaiheessa I ja II olevien CRC-tapausten joukkoa vaiheessa III ja IV olevien CRC-tapausten joukkoon käyttämällä kiertäviä CD16+CD56+ NK-soluja, Receiver Operating Characteristic -käyrän alapuolinen pinta-ala oli 0,878. Käyttämällä optimaalista raja-arvoa 15,6 % OR oli 0,06 (0,03, 0,11), herkkyys oli 86,5 %, spesifisyys 72,5 %, positiivinen ennustearvo 74,2 % ja negatiivinen ennustearvo 85,5 %. Päätelmät. Verenkierrossa olevia CD16+CD56+ NK-soluja voidaan käyttää CRC:n seulonta- ja diagnostiikka-/vaiheistustyökaluna.

1. Johdanto

Kolorektaalisen syövän (CRC) ilmaantuvuus on noin miljoona vuosittain, ja se aiheuttaa lähes 700 000 ihmisen kuoleman vuosittain, joten se on maailman neljänneksi tappavin syöpä . Nykyisen CRC:n seulontastrategian ongelmana on alhainen herkkyys ja/tai spesifisyys ulostepohjaisissa testeissä, työläs suolen valmistelu ennen röntgentutkimuksia ja suuri perforaatioriski endoskooppisissa tutkimuksissa. Paras CRC:n seulonta- ja seurantatesti, jolla on korkea vaatimustenmukaisuus, olisi itse asiassa voitava helposti suorittaa ja toistaa, varsinkin kun otetaan huomioon, että jopa 25 prosenttia tapauksista on leikkaamattomia diagnoosin tekohetkellä ja 50 prosenttia varhaisvaiheen tapauksista uusiutuu leikkauksen jälkeen.

CRC:n vaiheistus ja ennuste perustuvat pääasiassa kirurgisten toimenpiteiden jälkeiseen patologiaan . Konsensusimmunoscore parafiinileikkeistä CRC:n luokittelua ja ennustetta varten oli käytännön esimerkki . Vaikka useissa tutkimuksissa on käytetty täydentäviä ja ei-invasiivisia biomarkkereita CRC:n diagnosoinnissa , luotettava ennusteväline, jolla on korkea herkkyys sekä spesifisyys CRC:n diagnosoimiseksi ja/tai vaiheistamiseksi ennen leikkausta, puuttuu edelleen.

Immuunijärjestelmän tiedetään osallistuvan CRC:n kehittymiseen ja etenemiseen . Eri immuunisolujen infiltraation CRC:ssä on osoitettu olevan yhteydessä metastaasiin ja ennusteeseen . Lisäksi kiertävät immuunisolut voivat heijastaa paikallista immuunivastetta kasvaimen mikroympäristössä , mikä antaa mahdollisesti tärkeää tietoa taudin etenemisestä CRC:ssä . Luonnollisia tappajasoluja (NK-soluja) pidetään mielenkiintoisina translaatiotutkimusten ja kliinisten tutkimusten kohteina, sillä ne ovat tärkeä immuunisolujen alaryhmä, jonka toiminnan käynnistää solun pintareseptoreiden saamien aktivoivien ja estävien signaalien välinen kehittyvä ja herkkä tasapaino.

Tässä tutkimuksessa analysoimme CD16- ja CD56-kaksoispositiivisia NK-soluja terveillä ja eri vaiheissa olevilla CRC-potilailla ennen alkuhoitoa yrittäen selvittää CD16+CD56+ NK-solujen arvoa CRC:n ennusteessa ja hoitoa edeltävässä vaiheistuksessa.

2. Menetelmät

Tämä oli retrospektiivinen kohorttitutkimus, joka suoritettiin 2. liitännäissairaalassa (2. affiliated hospital) Harbinin lääketieteellisessä yliopistossa, joka on Koillis-Kiinassa sijaitseva yliopistosairaala. Laitoksen eettisen toimikunnan hyväksyntä saatiin ennen tietojen keräämistä, ja potilailta saatiin tietoinen suostumus sisäänoton yhteydessä.

Klinikkatiedot potilaista, jotka otettiin CRC:n alkuhoitoon 1. tammikuuta 2015 ja 31. joulukuuta 2018 välisenä aikana onkologian osastolle, haettiin ja tarkasteltiin. Mukaan otetuilla potilailla tuli olla saatavilla hoitoa edeltävät NK-solutiedot (viimeisin ennen ensimmäistä leikkausta) sekä histologisesti vahvistettu primaarinen CRC. Staging perustui TNM-terminologiaan (Tumor Node Metastasis) . Potilaat, joiden diagnoosi oli epäselvä, joilla oli muita syöpiä, jotka otettiin hoitoon aikaisempien CRC-hoitojen jälkeen, joilla oli muita kroonisia sairauksia (kuten sydän- ja verisuonisairauksia ja hormonaalisia sairauksia) tai joilla oli virus- tai bakteeri-infektioita, jätettiin pois. Ikään ja BMI:hen sopivat terveet osallistujat (joilla ei ollut kliinisiä valituksia ja jotka olivat juuri suorittaneet vuotuisen lääkärintarkastuksen ilmoittautumishetkellä) otettiin kontrolliryhmään.

Kaikilta osallistujilta kerättiin paastoavat perifeeriset laskimoverinäytteet ennen hoitoa (CRC-ryhmässä) tai vuotuisen lääkärintarkastuksen päivänä (terveissä kontrolleissa) hepariinilla päällystettyihin putkiin, ja ne säilytettiin 2-8 °C:ssa. 100 μl juuri kerättyä verta siirrettiin virtauskohtaiseen putkeen. Virtaussytometriatutkimusta varten lisättiin 20 μl BD Multitest 6-väristä TBNK-reagenssia (Ref # 644611, BD, USA, mukaan lukien CD3 FITC, CD16 PE+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC ja CD8 APC-Cy7) valmistajan käsikirjan mukaisesti, jonka paneelissa CD16+CD56+ kvantifioi spesifisesti NK-soluja lymfosyyttipopulaatiossa. Seosta inkuboitiin huoneenlämmössä 15 minuuttia pimeässä ja käsiteltiin 2,5 ml:lla punasolujen lyysipuskuria (Sigma-Aldrich) 10 minuuttia huoneenlämmössä pimeässä. Seos pestiin kahdesti PBS-puskurilla, resuspendoitiin ja fiksoitiin 0,5 ml:ssa PBS:ää, joka sisälsi 0,9-prosenttista formaldehydiä (Sigma-Aldrich), ja analysoitiin FACSCanto II -virtaussytometrijärjestelmällä (BD Biosciences) FACSDiva™-ohjelmiston version 8.0 (BD Biosciences) avulla. Kustakin näytteestä analysoitiin vähintään 20 000 solua P1-portissa.

2.1. Tilastollinen analyysi

Diskreetit tiedot ilmaistiin tapausten lukumääränä (prosentteina) ja analysoitiin käyttäen testiä tai Fisherin tarkkaa testiä sekä odds ratio (OR) ja 95 %:n luottamusväli (95 %:n CI) sen mukaan, kumpi oli sovellettavissa. Jatkuvat tiedot ilmaistiin ja analysoitiin käyttämällä -testiä. Ennusteen arvon osoittamiseen käytettiin ROC-käyrän (Receiver Operating Characteristic) alaista aluetta. Tilastolliseen analyysiin käytettiin SPSS 24.0 -ohjelmaa (IBM Corp., Armonk, NY). Kaksihäntäistä pidetään merkitsevästi erilaisena.

3. Tulokset

Esiasetetun tutkimusjakson aikana sairaalassamme otettiin vastaan 2714 CRC-potilasta. Esiasetettujen sisäänottokriteerien mukaan tutkimukseemme otettiin 66 vaiheen I, 60 vaiheen II, 70 vaiheen III ja 68 vaiheen IV potilasta. Kontrolliryhmään otettiin 60 iältään ja painoindeksiltään vastaavaa tervettä osallistujaa. Terveiden kontrolliryhmien ja CRC-tapausten välillä tai eri ryhmien välillä ei ollut merkittäviä eroja iän, sukupuolen, ruumiinpainon, pituuden tai BMI:n suhteen (, taulukko 1).

3.1. Tutkimukseen osallistuneet. Verenkierrossa olevien CD16+CD56+ NK-solujen ennustearvo CRC:ssä

Verenkierrossa olevien CD16+CD56+ NK-solujen määrässä oli merkittävä ero terveiden ryhmän ja CRC-tapausten välillä (, Taulukko 1). Verenkierrossa olevien CD16+CD56+ NK-solujen prosenttiosuus lymfosyyteistä korreloi negatiivisesti CRC:n esiintymisen kanssa.

Vastaanottimen käyttöominaiskäyrää (ROC) käytettiin osoittamaan CD16+CD56+ NK-solujen merkitys CRC:n ennustamisessa. Kun verrattiin terveitä kontrolleja ja CRC-tapauksia kokonaisuutena (kuva 1), käyrän alle jäävä pinta-ala (AUC) oli 0,725 (taulukko 2). Kun käytettiin optimaalista raja-arvoa 19,7 %, OR oli 0,08 (0,04, 0,15), herkkyys oli 80,0 %, spesifisyys 76,9 %, positiivinen ennustearvo (PPV) 44,0 % ja negatiivinen ennustearvo (NPV) 94 %.4 %.

Kuva 1

NK-solujen ROC-käyrä (ROC) CRC-tapausten ennustamisessa (terveet vs. sairaat). tapaukset).

AUC: käyrän alapuolella oleva alue. Kynnysarvon ylittävä tapausmäärä/koko tapausmäärä vastaavissa ryhmissä.

. Ryhmät AUC AUC Kynnysarvo (% lymfosyyteissä) Tapausten lukumäärät OR (95 % CI) arvo Sensitiivisyys (%) Spesifisyys (%) PPV (%) NPV (%) Terveys vs. syöpä 0.725 19.7 48/60: 61/264 0.08 (0.04, 0.15) <0.001 80.0 76.9 44.0 94.4 Terveys+vaiheet 1&2 vs. vaiheet 3&4 0.892 15.6 157/186: 38/138 0.07 (0.04, 0.12) <0.001 84.4 72.5 80.5 77.5 Vaiheet 1&2 vs. vaiheet 3&4 0.878 15.6 109/126: 38/138 0.06 (0.03, 0.11) <0.001 86.5 72.5 74.2 85.5

Taulukko 2

CD16+CD56+ NK-solujen raja-arvo CRC:n eri vaiheiden ennustamisessa.

3.2. Taulukko 2. CD16+CD56+ NK-solujen raja-arvo CRC:n eri vaiheiden ennustamisessa. Verenkierrossa olevat CD16+CD56+ NK-solut CRC-tapausten eri vaiheissa

Verenkierrossa olevissa CD16+CD56+ NK-soluissa ei ollut eroja terveen ryhmän ja CRC-tapausten I tai II vaiheen ryhmän välillä ( ja , mutta merkittäviä eroja oli terveen ryhmän ja CRC-tapausten III tai IV vaiheen ryhmän välillä (, , ja , taulukko 1). Koska CD16+CD56+ NK-soluissa ei ollut eroja terveen ryhmän ja vaiheen I tai II CRC-ryhmän välillä, kun verrattiin terveiden kontrollien ja vaiheen I+II CRC-tapausten yhdistelmää vaiheen III+IV CRC-tapausten yhdistelmään (kuva 2), AUC oli 0,892 (taulukko 2). Käyttämällä optimaalista raja-arvoa 15,6 % OR oli 0,07 (0,04, 0,12), herkkyys 84,4 %, spesifisyys 72,5 %, PPV 80,5 % ja NPV 77,5 %.

Kuva 2

NK-solujen ROC-käyrä (ROC) CRC-tapausten eri vaiheissa (terveet+vaiheet 1&2 vs. vaiheet 3&4).

Vertailtaessa vaiheessa I ja II olevien CRC-tapausten joukkoa vaiheessa III ja IV olevien CRC-tapausten joukkoon (kuva 3) AUC oli 0,878 (taulukko 2). Käyttämällä optimaalista raja-arvoa 15,6 % OR oli 0,06 (0,03, 0,11), herkkyys 86,5 %, spesifisyys 72,5 %, PPV 74,2 % ja NPV 85,5 %.

Kuva 3

NK-solujen ROC-käyrä (ROC) CRC-tapausten eri vaiheissa (vaiheet 1&2 vs. vaiheet 3&4).

4. Keskustelu

Laaja-alaisesti ottaen NK-solut voidaan jakaa CD56-ekspressionsa perusteella CD56bright- ja CD56dim-soluihin. Ensin mainitut solut liittyvät immunoregulaatioon ja proinflammatoristen sytokiinien tuotantoon, kun taas jälkimmäiset solut ovat sytotoksisia . NK-solujen CD16 (FcγRIII) välittää vasta-aineesta riippuvaista soluvälitteistä sytotoksisuutta , ja CD16:n läsnäolo sulkee siten pois tiettyjen T- tai B-solujen kanssa korreloivien NK-solujen osallisuuden .

Viime aikoina on kahdessa tutkimuksessa käytetty CD3-CD56+:aa NK-solujen merkkiaineena. Yhdessä tutkimuksessa raportoitiin NK-solujen alaryhmien esiintymisestä CRC-potilailla, ja sen johtopäätös oli ”CD16+ NKT:n kaltaisten solujen prosenttiosuus liittyi itsenäisesti lyhyempään taudittomaan eloonjäämiseen CRC-potilailla” . Tutkimuksen tekijät ottivat kuitenkin mukaan vain rajallisen määrän potilaita, ja eri vaiheiden mukainen stratifiointi sekä CD56bright- ja CD56dim-NK-solupopulaatioiden jako heikensi entisestään heidän tietojensa tehoa. Lisäksi osa näistä potilaista on saanut sädehoitoa jo ennen NK-solujen keräämistä, mikä saattaa lisätä heterogeenisuutta (alun perin hoidettujen ja hoidon jälkeisten potilaiden sekoitus) yhdistettyyn potilaspopulaatioon. Toisessa tutkimuksessa raportoitiin negatiivinen korrelaatio perifeeristen NK-solujen ja CRC:n TNM-vaiheen välillä, ja NK-solujen määrässä oli merkittävä ero terveiden ja vaiheiden I ja II sekä terveiden ja vaiheen IV välillä, mutta ei terveiden ja vaiheen III välillä. Tämä epäjohdonmukainen suuntaus saattaa johtua siitä, että kussakin ryhmässä oli pieni määrä potilaita. Tutkimuksessamme keräsimme enemmän potilaita, ja vain potilaat, joilla ei ollut aiempaa hoitoa, otettiin mukaan analyysiin, mikä saattaa osoittaa kehon luonnollisen tilan CRC-taakan alla. Näin ollen aineistomme on sellaisenaan homogeenisena sovellettavissa seulontatestinä ennen ensimmäistä hoitoa.

Tutkimuksemme toinen voima piilee virus- tai bakteeri-infektiotapausten poissulkemisessa. NK-solujen pinnalla on aktivoivia reseptoreita ja inhiboivia reseptoreita . NK-soluja aktivoivat reseptorit, joista esimerkkinä olivat Ly49H, KIR2DL3 tai KIR3DS1, ovat välttämättömiä sytomegalovirus- , hepatiitti C -virus- tai Epstein-Barr-virusinfektioiden puhdistamiseksi. Toisaalta NK-solujen toimintaa estävät reseptorit, kuten esimerkiksi CD94-NKG2A tai KIR, ovat myös mukana virusinfektioissa. Tasapainoa aktivoivien ja inhiboivien reseptorien välillä ylläpidetään reseptori-ligandin sitoutumisen avulla. Suorat Tollin kaltaiset reseptorit (TLR) voivat aktivoitua gramnegatiivisten bakteerien sisältämän lipopolysakkaridin vaikutuksesta. Myös NK-solujen TLR:ien stimulaation on raportoitu osallistuvan NK-solujen aktivoitumiseen . Siksi virus- tai bakteeri-infektiotapausten poissulkeminen vähentää näiden tapausten heterogeenisuutta CRC-tapausten analyysissä.

On raportoitu, että CRC:n ennuste perustuu immunohistokemialliseen värjäykseen geenimutaation tai -polymorfismin , tai aktivaation havaitsemiseksi , mikä on mahdollista vasta kirurgisten toimenpiteiden jälkeen. Yksi CRC:n kiertävien biomarkkereiden luokka kuuluu geenien säätelyn piiriin (mikroRNA tai metylaatio) . Toinen luokka on seerumin metabolomiikan analyysi . Tässä mielessä verenkierrossa olevilla CD16+CD56+ NK-soluilla on ennakoiva rooli sekä seulonnassa että vaiheistuksessa ennen kirurgisia toimenpiteitä.

5. Johtopäätökset

Yhteenvetona havaitsimme, että verenkierrossa olevien CD16+CD56+ NK-solujen prosenttiosuus korreloi negatiivisesti CRC:n esiintymisen ja CRC:n porrastuksen kanssa. Käyttämällä 19,7 %:n ja 15,6 %:n raja-arvoa verenkierrossa olevien CD16+CD56+ NK-solujen prosenttiosuus pystyi erottamaan toisistaan terveet CRC-tapaukset ja CRC-tapaukset tai vaiheen I+II ja III+IV tapaukset.

Tietojen saatavuus