KASVUHORMONITUTKIMUS

Kasvuhormonivaste kasvuhormonia vapauttavalle peptidi-2:lle kasvuhormonipuutteisilla Little-hiirillä

Cibele N. PeroniI; Cesar Y. HayashidaII; Nancy NascimentoI; Viviane C. LonguiniII; Rodrigo A. ToledoII; Paolo BartoliniI; Cyril Y. BowersIII; Sergio P.A. ToledoII

IBiotekniikan osasto, kansallinen ydinenergiakomissio (IPEN-CNEN), Cidade Universitária, São Paulo/SP, Brasilia
IIFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, lääketieteen laitos, endokrinologia, Endocrine Genetics Unit/LIM 25, São Paulo/SP, Brasilia
IIITulane University Health Sciences Center, Department of Medicine, Division of Endocrinology, Endocrine Section, New Orleans, LA/USA

ABSTRACT

OBJECTIVE: Tutkia kasvuhormonia vapauttavan kasvuhormonia vapauttavan, hormonista riippumattoman kasvuhormonin sekretagogin, GHRP-2:n, mahdollista suoraa, kasvuhormonia vapauttavan vaikutusta aivolisäkkeen somatotrofisissa soluissa inaktiivisten kasvuhormonia vapauttavan hormonin reseptorien läsnä ollessa.
MATERIAALIT JA MENETELMÄT: Seerumin kasvuhormonin vasteita akuutisti pistetylle kasvuhormonia vapauttavalle P-2:lle lit/lit-hiirillä, jotka edustavat muuntuneista kasvuhormonia vapauttavat hormonireseptoreista johtuvan GH:n puutteen mallia, verrattiin heterotsygoottisilla (lit/+) ja villityyppisillä (+/+) C57BL/6J-hiirillä havaittuihin vasteisiin.
TULOKSET: Kun lit/lit-hiirille oli annettu 10 mcg kasvuhormonia vapauttavaa P-2:ta, havaittiin, että kasvuhormonia vapautui 9,3±1,5 ng/ml verrattuna 1,04±1,15 ng/ml:n vapautumiseen kontrolleissa (p<0,001). Vertailun vuoksi voidaan todeta, että lit/+-hiirillä ja villityypin hiirillä saatiin aikaan keskinkertainen kasvuhormonin vapautuminen 34,5±9,7 ng/ml ja suurempi kasvuhormonin vapautuminen 163±46 ng/ml. Näin ollen GHRP-2 stimuloi kasvuhormonia lit/lit-hiirissä, ja kasvuhormonin vapautuminen in vivo saattaa olla vain osittain riippuvainen kasvuhormonia vapauttavasta hormonista. Lisäksi arvioitiin plasman leptiini- ja greliinipitoisuuksia lit/lit-hiirillä perusolosuhteissa ja stimuloiduissa olosuhteissa.
YHTEENVETO: Olemme tässä osoittaneet, että lit/lit-hiiret, joilla on kasvuhormonia vapauttavan hormonin geenin ituratamutaatio, säilyttävät rajoitetun mutta tilastollisesti merkitsevän kasvuhormonin nousun eksogeenisen stimuloinnin jälkeen GHRP-2:lla. Nämä tiedot heijastavat todennäköisesti suoraa, kasvuhormonista riippumatonta vaikutusta kasvuhormoni S:n (greliinin) stimulaatioon pikkuhiirten jäljellä olevissa aivolisäkkeen somatotrofeissa, jota välittää kasvuhormoni S-R 1a.

Avainsanat: Ghrelin; GH; GHRH-R; GHRP-2; Leptiini; Pikkuhiiri.

TIIVISTELMÄ

Kasvuhormonin (GH) synteesiä ja eritystä säätelevät ensisijaisesti hypotalamuksen hormonit GH-vapauttava hormoni (GH-releasing hormone, GHRH) ja somatostatiini GH:n ja IGF-I:n negatiivisen takaisinkytkennän sekä luonnollisen, endogeenisen GH:ta vapauttavan hormonin greliinin (1-8) avulla. Normaali somatotrofinen kypsyminen, proliferaatio sekä somaattinen kasvu ja kehitys edellyttävät GHRH:ta (9). Somatotrofisten solujen myöhäisissä erilaistumisvaiheissa GHRH aktivoi solukalvoreseptorinsa GHRH-R:n kautta Gs-alfa-, cAMP- ja proteiinikinaasi A -reittiä (1,10,11). Sitä vastoin greliini, joka alun perin eristettiin rotan mahalaukusta ja hypotalamuksesta, vaikuttaa kasvuhormonin eritysreseptorin (GHS) (GHS-R 1a) kautta, joka on kytkeytynyt Gq/i-tuoteperheen jäseniin ja aktivoi fosfolipaasi C:tä (2,12,13).

Synteettiset GHS:t ovat greliinireseptoriagonisteja, jotka stimuloivat GH:n eritystä in vitro ja in vivo. Niihin kuuluvat GH:ta vapauttavat peptidit (GHRP:t), kuten GHRP-2, ja ei-peptidiyhdisteet. Synteettiset GHS:t ja greliini stimuloivat myös ACTH:n/kortisolin ja prolaktiinin vapautumista hypotalamuksen kautta, ja niiden on osoitettu lisäävän ravinnonsaantia, energiankulutusta, unta ja sydämen tonusta (15-17). Vaikka niiden kemialliset rakenteet vaihtelevat, kaikki GHS:t näyttävät vaikuttavan GHS-R:n kautta tehostamaan GH:n eritystä ja ruoan saantia. GHS-R:n mRNA:ta on tunnistettu aivolisäkkeestä, hypotalamuksen kaarevasta ytimestä ja muista kudoksista (6,15-17). GH:n maksimaaliseen stimulointiin GHRP:t edellyttävät hypotalamuksen GHRH:n samanaikaista eritystä (18-21). Lisäksi greliini ja synteettiset GHRH:t voimistavat GHRH:n indusoimaa cAMP-tuotantoa ja lisäävät useiden GHRH-R:ien tasoja, mikä voi johtaa myös GHS-R:ien ja GHRH:n muuttuneisiin vuorovaikutuksiin (22-25). Tässä yhteydessä voi esiintyä greliinin ja GHRP:n kaksois- ja täydentävää vaikutusta hypotalamukseen ja aivolisäkkeeseen. Lisäksi olisi mainittava parakriininen vaikutus hypotalamuksen kaarevaan ytimeen, joka osallistuu ravinnonsaannin ja energiankulutuksen säätelyyn (17).

GHS:ien hallitsevaa vaikutuspaikkaa GH:n eritykseen ei ole täysin selvitetty. GHS-R:t on tunnistettu sekä aivolisäkkeestä että hypotalamuksesta, ja GHS:t voivat vaikuttaa jommassakummassa tai molemmissa paikoissa. Jotkin todisteet viittaavat siihen, että GHS:ien ja greliinin GH:ta erittävä vaikutus voi tapahtua pääasiassa hypotalamuksessa, ja sen suora vaikutus aivolisäkkeeseen on vähäinen (25-27). Näin ollen GH:n vähäistä mutta tilastollisesti merkitsevää nousua (p<0,05) todettiin ensimmäisen kerran GHRP2:lla annetun akuutin ärsykkeen jälkeen GH-puutteellisilla potilailla, joilla oli GHRH-R-geenin sukusolumutaatiosta johtuva lyhytkasvuisuus (28). Pian sen jälkeen muut tutkimukset tukivat näitä ensimmäisiä havaintoja (29,30), mikä viittaa GHRP-2:n suoraan vaikutukseen aivolisäkkeessä. Hiiren ja ihmisen kasvuhormonia vapauttavan hormonin reseptorigeenin (ghrhr) kloonaus toteutettiin sen jälkeen, kun oli havaittu, että erilaisia mutaatioita, jotka ovat analogisia GH-puutteisten pikkuhiirien GH:ta inaktivoivan ghrhr Asp60Gly-mutaation kanssa, esiintyi myös GH-puutteisilla ihmisillä (31-37). Lit/lit-hiirten ghrhr-mutaatio johti siihen, että GHRH:n välittämä GH:n vapautuminen puuttui kokonaan, mitä osoitti myös havainto, että mutatoitunut GHRH-R-proteiini ei sitoutunut GHRH:hon (32,33). Odotetusti GH-vasteen täydellinen puuttuminen GHRH1-29NH2:lle on raportoitu pienillä hiirillä (38-40). GH-vasteen täydellinen puuttuminen GHRP-6:lle on raportoitu myös pienillä hiirillä (41). Koska GHS:t vaikuttavat spesifisesti GHS-R:n kautta, on kuitenkin kohtuullista olettaa, että GH-vastetta voi esiintyä vastauksena GHS-haasteeseen pienillä hiirillä. Tämän hypoteesin tueksi GHRP-2:n on osoitettu lisäävän GH:n vapautumista rotan aivolisäkkeistä in vitro myös sen jälkeen, kun GHRH-R oli estetty antisense-oligonukleotidimenetelmällä (42).

Pikkuhiiri on vakiintunut eläinmalli, jonka avulla voidaan arvioida GHS:n ja greliinin suoria GHRH:sta riippumattomia vaikutuksia aivolisäkkeen somatotrofisiin soluihin (33-35). Tässä arvioimme GH-vastetta GHRP-2:lle pikku hiirissä (lit/lit), niiden heterotsygoottisissa (lit/+) littermateissa ja villityypin (+/+) kontrolleissa. Lisäksi arvioitiin GHRH:n ja GHRH-R:n mahdollista roolia greliinin erittymisessä ja vaikutuksessa mittaamalla paasto- ja ruokintaplasman greliini- ja seerumin leptiinitasot näissä eläimissä.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

ELÄINLAJIT JA ASUMISOLOSUHTEET

Pikkuhiiret (C57BL/6J lit/lit) ja niiden heterotsygoottiset (lit/ +) sisarukset ostettiin The Jackson Laboratorysta (Bar Harbor, ME, USA), ja jalostusyhdyskunta perustettiin eläintaloomme (43). Mutanttihiiret tuotettiin astuttamalla C57BL/6J lit/lit -naaraat C57BL/6J lit/+ -uroksiin. Kokeissa käytettiin molempien sukupuolten 45-90 päivän ikäisiä hiiriä. Kontrollina käytettiin 45-90 päivän ikäisiä (ruumiinpaino ,30 g) villityypin (+/+) C57BL-hiiriä, jotka saatiin São Paulon yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan trooppisen lääketieteen osastolta (São Paulo, Brasilia). Lit/lit- ja lit/+-hiirten ruumiinpainot olivat samassa iässä noin 10-12 g ja 20-25 g, ja ne saatiin herkällä menetelmällä (43).

Hiiret pidettiin ilmastoidussa huoneessa, jonka lämpötila oli 24±1ºC. Vettä ja ruokaa annettiin ad libitum, ja valoa säädettiin 12 tunnin valo-/12 tunnin pimeäaikataululla.

Yhtä hiiriryhmää pidettiin paasto-olosuhteissa poistamalla ruoka iltapäivällä noin klo 17:00. Veri kerättiin paastoavista ja paastoamattomista hiiririryhmistä seuraavana päivänä klo 09:00. Paastoaville hiirille annettiin vettä ad libitum (43).

Tämä tutkimus oli paikallisen eettisen toimikunnan hyväksymä ja täytti eläinkokeiden kriteerit.

Sekvenssianalyysi

Genotyypitys suoritettiin lit/lit-, lit/+- ja wt/wt-hiirten vahvistamiseksi ja geneettiseksi luonnehtimiseksi. Hiiret genotyypitettiin PCR-monistamalla hännän DNA:sta, joka oli eristetty laboratoriomme vakioprotokollalla fenolista (44,45). Kahta aluketta, 5′-TGAGCTTGCATGTCTTCA GG-3′ ja 5′-GGGATTAGACCAGCCAGTGA-3′ (hehkutuslämpötila 60ºC), käytettiin monistamaan ghrhr Asp60Gly-mutaation geenialuetta, joka johtaa pikkuhiiren fenotyyppiin (24). Mutaatioanalyysi suoritettiin automaattisella sekvensoinnilla Big Dye Terminator v3.1:llä (310 Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Eteenpäin ja taaksepäin suuntautuvat säikeet analysoitiin DNA-näytteiden kaksoiskappaleista. DNA-poikkeavuuksien tunnistamiseen käytettiin kahta sekvensointieditoriohjelmaa (Gene StudioTM Professional Edition, Suwanee; ja Mutation Surveyour, Softgenetics, PA, USA).

Valmisteet ja injektiot

GHRP-2 (200 µg/ml; erä KP102-HQ007; Pramorelin: D-alanyyli-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-L-alanyyli-L-tryptofyyli-D-fenyylialanyyli-L-lysinamididihydrokloridi) saatiin Fujisawa USA, Inc. (Deerfield, IL). Hiirille annettiin vatsakalvon sisäiset (i.p.) injektiot ja ne punnittiin. Koejärjestelyn päättyessä verinäytteet otettiin orbitaalisesta sinuksesta GH:n, IGF-I:n, leptiinin tai greliinin mittauksia varten.

Immunomääritykset

Hiiren GH:n (mGH) seerumipitoisuudet määritettiin erittäin herkällä talon sisäisellä spesifisellä RIA:lla käyttäen reagensseja, jotka saatiin tohtori A. F. Parlow’lta kansallisesta hormoni- ja aivolisäkeohjelmasta (National Hormone and Pituitary Program, NHPP, Torrance, CA) (46). Kaikki näytteet määritettiin kahtena kappaleena. Jokaisessa määrityksessä käytettiin sisäisinä kontrolleina wt/wt C57BL- ja lit/lit-hiirten seerumeita. Kustakin kannasta käytettiin kahdeksaa hiirtä, ja yhdistetty (n = 8) GH:n seerumipitoisuus oli 1,3±0,7 ng/ml lit/lit-hiirillä ja 6,5±1,8 ng/ml wt/wt C57BL-hiirillä. Alkuperäiset GH-tasot lit/+-hiirillä eivät eronneet merkittävästi wt/wt C57BL-hiirien tasoista, mikä johtui todennäköisesti eläinten lukumäärästä. Viivästetyllä merkkiaineen lisäyksellä suoritetun GH-määrityksen herkkyys oli 0,25 ± 0,15 ng/ml Rodbardin määritelmän mukaisesti laskettuna (47). Tutkimusten välinen variaatiokerroin oli alle 10 %.

IGF-I-pitoisuudet määritettiin kaksoiskappaleina käyttäen rotan IGF-I RIA-pakkausta (DSL-2900, Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, Texas, USA), jonka pienin havaitsemisraja oli 21 ng/ml ja mitattavissa olevat pitoisuudet vaihtelivat 150:stä 4500:aan ng/ml:aan.

Leptiinipitoisuudet määritettiin käyttämällä rotan leptiini-RIA-kittiä (Linco Research Inc., St. Charles, MO, USA), jonka vähimmäishavaitsemisarvo on 0,2 ng/ml ja mitattavissa oleva pitoisuusalue 0,2-12,8 ng/ml.

Kokonaisgreliinipitoisuudet (oktanoyloidut + desoktanoyloidut)(48) määritettiin käyttämällä rotan greliinin RIA-kittiä (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA, USA), jonka herkkyys on ~5,4 pg/tuubi ja mitattavissa oleva alue 1-128 pg/tuubi. Aktiivisen greliinin (oktanoyloitu) pitoisuudet määritettiin käyttämällä Linco Research -kittiä (St. Charles, MO). Näitä mittauksia varten verinäytteet kerättiin putkiin, jotka sisälsivät 0,78 mg K2EDTA:ta (250-500 ml verta/putki), säilytettiin jäässä ja pyöräytettiin jäähdytetyssä sentrifugissa. Plasmanäytteisiin lisättiin PMSF (0,1 mg/ml plasmaa) ja 1 M HCl (50 ml/ml plasmaa). Näytteet säilytettiin pakastettuina -70 ºC:ssa, kunnes greliinipitoisuudet mitattiin. Aktiivisen greliinipakkauksen sisäiset ja väliset variaatiokertoimet olivat 6,5-9,5 % ja 9,6-16,2 %. Kokonaisgreliinipakkauksen mittausten sisäiset ja väliset variaatiokertoimet olivat <10 % ja <15 %.

Tutkimusasetelma

Kahdelle ryhmälle ikään sopivia, villityyppisiä (+/+) C57BL-hiiriä injektoitiin aluksi i.p. joko 1 µg (32 eläintä/ryhmä) tai 10 µg (18 eläintä/ryhmä) GHRP-2:ta, ja verinäytteet GH-mittauksia varten kerättiin eri aikoina 1 h:iin asti injektion jälkeen. Kutakin ajankohtaa varten käytettiin kolmea hiirtä, ja veri otettiin vain kerran ennen eläinten lopettamista. Pilottitutkimuksessa 10 µg GHRP-2:ta annettiin i.p. 2-3 lit/lit-, lit/+- ja (wt/wt) hiirille (n = 18 eläintä/ryhmä), ja GH-vaste mitattiin eri ajankohtina aina 1 tuntiin asti injektion jälkeen annoksen ja ajoituksen vaikutusten arvioimiseksi.

Eriippumaton kahden viikon tutkimus tehtiin lit/lit-hiirillä, joita hoidettiin päivittäin 10 µg GHRP-2:lla i.p. hiirtä kohti (n = 6 hiirtä kontrolliryhmässä ja n = 8 hiirtä koeryhmässä). Ruumiinpaino mitattiin, ja 3-4 päivän välein otettiin verta GH-, IGF-I- ja leptiinitasojen mittaamiseksi. Kuten aiemmin on kuvattu, ruumiinpaino mitattiin tarkalla ja erittäin herkällä menetelmällä (40). Lyhyesti sanottuna eläinten ruumiinpainot mitattiin päivittäin koko kokeen ajan ja niitä käytettiin sitten yksilöllisten kasvukäyrien laskemiseen; kasvukäyrien kaltevuuksia käytettiin sitten vasteparametreina. Valaistujen ja valaistujen hiirten osalta hyväksyttävä päivittäinen painonvaihtelu kymmenen viimeisen päivän aikana ennen kutakin koetta (koetta edeltävä ajanjakso) oli 0,0025 ± 0,0045 g/vrk (36,40). Näin ollen noin 10 % homotsygoottisesta kääpiöhiiripopulaatiosta hylättiin. Lit/lit-hiirten valintakriteerimme perustuivat C57BL/6J-kannan homotsygoottisten (lit/lit) ja heterotsygoottisten (lit/+) hiirten kasvukäyriin, jotka oli jo todettu aiemmassa tutkimuksessa (36) ja jotka vahvistettiin edelleen tässä suoritetulla genotyypityksellä.

Hormoniarvojen pinta-alojen arvioimiseksi ja vertailemiseksi määritettiin mielivaltainen pitoisuusyksikkö (ng/ml/aika (min)).

Tilastot

Leptiinipitoisuuksien ja hormonaalisten vasteiden analysoimiseksi käyrän alle jäävän pinta-alan (AUC) tietojen perusteella suoritettiin kaksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jossa riippumattomina muuttujina olivat aika ja hoito. Kaikkien hoidon aloittamisen jälkeen saatujen arvojen osalta käytettiin Studentin t-testiä ja Bonferronin säätöä. Kaikissa muissa mittauksissa käytettiin Studentin parittaista t-testiä erojen merkitsevyyden arvioimiseksi. p,0,05 katsottiin merkitseväksi.

TULOKSET

ghrhr-mutaatioanalyysi

DNA uutettiin lit/lit-hiiren verinäytteestä muualla kuvatuilla rutiinimenetelmillä (44,45). PCR suoritettiin käyttäen aiemmin ilmoitettuja alukkeita, minkä jälkeen ghrhr-geenin sekvenssianalyysi tehtiin.

Lit/lit-hiirellä todettiin homotsygoottinen ghrhr Asp60Gly-mutaatio, kun taas heterotsygoottinen ghrhr Asp60Gly-mutaatio todettiin lit/+-alkioisilla hiirillä. Sitä vastoin villityyppisissä (+/+) C57BL/6J-hiirissä ei ollut tätä sukusolumutaatiota (kuva 1). Nämä tiedot vahvistivat tässä tutkimuksessa käytettyjen kolmen hiirilinjan genotyypit: +/+, Asp60Asp; lit/+, Asp60Gly ja lit/lit, Gly60Gly (kuva 1).

Basaaliset GH- ja IGF-I-pitoisuudet normaaleissa ja homotsygoottisissa hiirissä

Keskimääräiset basaaliset mGH-pitoisuudet 18:ssa homotsygoottisessa lit/lit-hiiressä (1,16±0,97 ng/ml; vaihteluväli 0,28-4.0 ng/ml) olivat merkittävästi alhaisemmat kuin ne, jotka havaittiin 46 villityyppisessä (+/+) kontrollissa (5,36±2,60 ng/ml; vaihteluväli 1,05-14,0 ng/ml; p<0,001) tai niiden 12 heterotsygoottisessa (lit/+) litteroidussa koe-eläimessä (6,60±2,35 ng/ml; vaihteluväli 4,25-11,5 ng/ml; p<0,001). Lisäksi lit/+- ja +/+-hiirillä havaitut GH:n peruspitoisuudet eivät eronneet merkittävästi toisistaan.

Kahdeksan lit/lit-hiiren seerumin IGF-I:n perusarvo (231±103 ng/ml; vaihteluväli 120-420) oli selvästi alhaisempi kuin kahdeksan +/+-kontrollin (473±104 ng/ml; vaihteluväli 330560 ng/ml; p<0,001).

GH:n vaste akuuttiin GHRP-2:n antoon

Aluksi osoitettiin, että GH:n lisääntyminen C57BL-villityypin kontrollihiirissä vasteena 1 µg:n GHRP-2:lle oli huomattavasti vähäisempi (~kaksinkertainen lisäys perustasoon nähden) kuin lisääntyminen vasteena 10 mg:n i.p. GHRp-2:lle (24-kertainen lisäys lähtötasoarvoihin nähden; p<0.05). Näin ollen 10 µg GHRP-2 -annos valittiin GH-vasteiden arviointiin kolmessa hiiriryhmässä (+/+, lit/+ ja lit/lit).

Keskimääräinen GH-huippuvaste kontrolliryhmässä (+/+) oli 163 ng/ml, ja se esiintyi 10 minuuttia GHRP-2:n antamisen jälkeen 24-kertaisena nousuna lähtötasoon verrattuna (kuva 2). Lit/+- ja lit/lit-hiirillä oli merkittävä GH-vaste GHRP-2:lle 5-10 minuutissa. Kaksikymmentä minuuttia GHRP-2-injektion jälkeen GH-tasot palasivat perusarvoihin.

Nämä tiedot osoittavat, että homotsygoottisilla lit/lit-hiirillä havaittu GH-vaste 10 µg:n GHRP-2:lle (9,3±1,5 ng/ml; vaihteluväli 8-11 ng/ml) oli merkitsevästi suurempi kuin suolaliuoksella ruiskutetuilla lit/lit-hiirillä (1,04±1,15 ng/ml; p<0,001). Lisäksi GH:n vaste GHRP-2:lle oli lit/lit-hiirillä huomattavasti pienempi kuin heterotsygoottisilla (lit/+) lit-hiirillä (9,3±1,5 ng/ml vs. 34,5±9,7 ng/ml; p<0,01) tai villityypin ( +/+) hiirillä (163±46 ng/ml; p<0,005). Näin ollen GH-vaste GHRP-2:lle lit/+-hiirillä oli keskitasoa lit/lit- ja +/+-hiirillä havaittujen vasteiden kanssa (kuva 2).

Absoluuttiset GH-lisäykset lähtötasoon verrattuna lit/lit-, lit/+- ja +/+-hiirillä olivat vastaavasti 8,3, 28,8 ja 156 ng/ml, mikä vahvistaa merkittävät erot GH-erityksessä kolmen tutkitun hiirikannan välillä. GH-tason nousu lähtötasosta 10 µg GHRP-2:n akuutin annon jälkeen ei eronnut merkittävästi lit/lit- ja lit/+-hiirten välillä (8,9- vs. 6,1-kertainen; p>0,05). GH:n lisääntyminen vasteena GHRP-2:lle väheni kuitenkin merkittävästi lit/lit- (p<0.005) ja lit/+-hiirillä (p<0.01) verrattuna kontrolleihin. Seerumin GH:n yksittäiset pinta-alat käyrän alla (AUC) vasteena GHRP-2:n akuuttiin antoon vahvistivat edelleen merkittävät erot GHRP-2- ja suolaliuoksella käsiteltyjen lit/lit-hiirten välillä (kuva 3).

Vasteet GHRP-2:n kahden viikon annosteluun

Odotetusti lit/lit-hiirillä havaittiin merkittävää ruumiinpainon nousua, kun 10 µg GHRP-2:ta annettiin i.p. (49) kerran päivässä kahden viikon ajan kahden viikon ajan verrattuna kontrollin injektionesteen injektioon (p<0,02; kuva 4). GH- ja IGF-I-tasot eivät kuitenkaan nousseet merkittävästi GHRP-2:n kahden viikon antamisen aikana (tietoja ei ole esitetty). Lisäksi merkitsevästi kohonneita (p<0.005) leptiiniarvoja lit/lit-hiirissä havaittiin GHRP-2-hoidon 15. päivänä.

Serumin greliini- ja leptiinipitoisuudet

Taulukossa 1 on esitetty plasman asyyligreliini- ja kokonais(asyyli+deasyyli)greliinipitoisuudet, joilla voi olla itsenäisiä ja toisiinsa liittyviä biologisia toimintoja, sekä seerumin leptiinipitoisuudet +/+-, lit/+- ja lit/lit-hiirillä paastoiduissa ja syötetyissä tiloissa. Paastotilassa plasman keskimääräiset asyyligreliini- ja kokonaisgreliinipitoisuudet lit/lit-hiirillä olivat merkittävästi alhaisemmat (78,9 % ja 37,6 %) kuin +/+-hiirillä. Heterotsygoottisilla lit/+-hiirillä oli myös merkittävästi alhaisemmat paaston aikaiset asyyligreeliini- ja kokonaisgreliinipitoisuudet (vastaavasti 80,5 % ja 44,9 %) verrattuna kontrolleihin. Lit/lit-hiirillä plasman asyyligreliinipitoisuus oli ruokailutilassa 93,8 % korkeampi kuin paastotilassa. Sitä vastoin villityypin hiirissä plasman asyyligreliini oli 82,5 % pienempi (p<0,001) ja kokonaisgreliini oli 61 % pienempi (p<0,001) syötetyssä tilassa kuin paastotilassa. Ero ruokintatilan plasman asyyligreliinipitoisuuksissa näiden kahden ryhmän välillä (157±70 pg/ml +/+-hiirillä vs. 67±18 pg/ml lit/lit-hiirillä) oli merkittävä (p<0.05). Lisäksi lit/lit-hiirten kokonaisgreliinitasot olivat 23,4 % korkeammat paastotilassa kuin syötetyssä tilassa.

Paastoiduilla lit/lit-hiirillä seerumin leptiinitasot olivat 348 % korkeammat kuin paastoiduilla +/+-hiirillä (p<0,005). Paastotetut lit/+-hiiret erosivat myös lit/lit- (50 % alhaisemmat, p<0.02) ja +/+-hiiristä (123 % korkeammat, p<0.005). Lisäksi lit/lit-hiirillä seerumin leptiinipitoisuudet laskivat syötetyssä tilassa 35 % verrattuna paastotilaan (p>0.05). Lisäksi ruokittujen lit/+- ja +/+-ruokittujen hiirten leptiinipitoisuudet olivat 37 % ja 16 % korkeammat kuin paastoiduilla eläimillä (p>0.05).

KESKUSTELU

Hiirillä on todettu useita spontaaneja homotsygoottisia sukusolujen mutaatioita, jotka johtavat aivolisäkehormonien puutteeseen ja kääpiöitymiseen (34). Amesin kääpiöhiirten fenotyypit johtuvat siis Prop1-geenin mutaatioista, ja niissä esiintyy useiden aivolisäkehormonien, myös GH:n, synnynnäistä puutosta (50). Lisäksi Snellin kääpiöhiirillä, joilla on mutaatioita pit-geenissä, on GH:n puutteesta johtuvaa kääpiökasvuisuutta, kilpirauhasen vajaatoimintaa ja hedelmättömyyttä (51). Lisäksi pikku hiirten fenotyyppi johtuu ghrh-r-geenin homotsygoottisista mutaatioista (33). PROP1-, PIT- ja GHRH-R-geenien homotsygoottisia mutaatioita on raportoitu ihmisillä, joilla on vaikea lyhytkasvuisuus (37,52,53).

GHRH-R-mutaatioiden on erityisesti ehdotettu aiheuttavan GH-vasteen puuttumisen GHRP-2:lle ihmisillä (54). Useissa muissa tutkimuksissa on kuitenkin dokumentoitu GH:n vähäistä mutta tilastollisesti merkitsevää lisääntymistä sen jälkeen, kun näille potilaille on annettu GHRP-2:ta (28-30). Vastaavasti on esitetty, että pikkuhiiri on resistentti GHRP-2:n vaikutukselle, eikä GH:n määrä lisäänny tämän peptidin antamisen jälkeen (41). Näin ollen tämän tutkimuksen päätavoitteena oli tutkia, onko pikku hiirillä absoluuttinen resistenssi GHRP:ien vaikutukselle, kuten aiemmin on kuvattu, vai onko niillä tilastollisesti merkitsevä GH-vaste yhdelle GHRP:lle, eli GHRP-2:lle, kuten ihmisillä on havaittu. Seerumin vähäisten GH-vaihteluiden havaitsemiseksi käytimme parannettua mGH-menetelmää, jolla voidaan paremmin erottaa mahdolliset GH:n nousut GHRP-2:n antamisen jälkeen.

Tietojemme mukaan missään muussa julkaisussa ei ole tähän mennessä erityisesti tutkittu tätä asiaa uudelleen pienillä hiirillä. Huomattakoon, että ghrh-knockout-hiirillä on dokumentoitu täydellinen GH-resistenssi GHRP-2:lle. Ghrh-knockout-hiirillä ja pikkuhiirillä on kuitenkin mutaatioita eri geeneissä, vaikka niiden fenotyypit ovatkin samanlaisia. Lisäksi erilaiset GH-menetelmät ja koeolosuhteet ovat saattaneet vaikuttaa näihin näennäisesti ristiriitaisiin tuloksiin.

GH-vasteet GHRP-2:lle

Somatotrofisten solujen kehitys ja toiminta ovat GHRH-riippuvaisia (1), kuten havaintomme rajoitetusta GH-vasteesta akuuttiin GHRP-2:n annosteluun lit/lit-hiirillä, joilla on homotsygoottinen ghrhr-mutaatio. Olettaen, että ghrhr on täysin inaktiivinen lit/lit-hiirissä (39), nykyiset havaintomme osoittavat, että ainakin osa GHRH:sta riippumattomasta GHS-GH:n vapautumisesta tapahtuu GHS-R:n aktivoitumisen kautta.

Kypsien GHRH-riippuvaisten somatotrofien lisäksi GH:ta tuottavia kantasoluja on löydetty lit/lit-hiirten aivolisäkkeistä ja 60 päivän ikäisistä aikuisista hiiristä (26).

Ei kuitenkaan tiedetä, toimivatko GHRP-2 ja/tai greliini trooppisena tekijänä GH:ta tuottaville kantasoluille GHRH:n aivolisäkkeen vaikutuksesta riippumatta.

Aiemmin raportoitu GH-vasteen puuttuminen lit/lit-hiirillä toisentyyppiselle GHS:lle, GHRP-6:lle (41), saattaa liittyä vähemmän herkän GH-määrityksen käyttöön (10 ng/ml vs. 0,25 ng/ml meidän määrityksessämme). Lisäksi GHRP-2:lla on suurempi biologinen teho (noin kuusinkertainen) kuin GHRP-6:lla käynnistää GH:n vapautuminen (14-16). GH-vasteiden puuttumista GHRP-6:lle ehdotettiin alun perin myös ihmisillä, joilla on Glu72Stop GHRH-R-mutaatio (42). Useissa muissa tutkimuksissa on kuitenkin dokumentoitu tilastollisesti merkitsevä, vaikkakin heikentynyt GH-vaste GHRP-2:lle geneettistä lyhytkasvuisuutta sairastavilla potilailla, joilla on vaikeasti typistetty GHRHRHR-geeni (28-30).

Lisäksi ghrh-knockout-hiirillä ei havaittu akuuttia eikä kroonista GH:n nousua, ja pääteltiin, että GHRP-2:lla on kasvua stimuloiva vaikutus, joka lisää JI-38:n aiheuttamaa vastetta (55,56). On kuitenkin tärkeää huomata, että a) knockout-hiiret ja eläimet, joilla on samanlaisia tai jopa vastaavia spontaaneja sukusolumutaatioita, voivat käyttäytyä eri tavoin; b) pikku- ja knockout-hiirten tutkimuksessa käytetyt mGH-menetelmät voivat olla erilaisia; ja c) näissä tutkimuksissa käytettiin erilaisia koejärjestelyjä (28-30,55,56).

Lit/+-hiirten välimaastossa olevat GH-vasteet GHRP-2:lle voivat johtua somatotrofisten solujen laadullisista ja/tai määrällisistä eroista, joskin näiden havaintojen vahvistamiseksi olisi tehtävä lisätutkimuksia tästä aiheesta. Nämä tiedot saattavat viitata geneettiseen annosvaikutukseen somatotrofisten solujen toiminnassa, joka heikkenee iän myötä. Vastaavasti geneettistä annosvaikutusta on aiemmin ehdotettu tapauksissa, joilla on mutaatio GHRHR-geenissä (52).

Tärkeää on, että GH RIA -menetelmämme pystyi havaitsemaan hyvin alhaiset GH-pitoisuudet (~0,25 ng/ml) pienissä hiirissä hyväksyttävällä tarkkuudella; vastaavia tietoja on harvoin saatavilla kirjallisuudessa. Muut ovat käyttäneet GH-kittejä, joiden herkkyys on pienempi. Ei kuitenkaan löytynyt muita raportteja, joissa olisi käsitelty lit/lit-hiirten seerumin GH-tasoja, jotka olisi saatu spesifisellä homologisella RIA:lla. Cheng ym. raportoivat seerumin GH-pitoisuuksiksi 0,61±0,09 ng/ml uros- ja naarashiirillä ja 8,50±0,75 ng/ml ja 2,85±0,33 ng/ml uros- ja naarashiirillä. Marmary ym. raportoivat seerumin GH-pitoisuuksiksi 1,08±0,06 ng/ml ja 20,35±22,9 ng/ml Snellin kääpiöhiirillä ja niiden vertailuhiirillä (58). Seerumin GH:n absoluuttisen tason korkeat arviot, jotka on määritetty heterologisella rotan GH RIA:lla, on myös raportoitu (59,60).

Kasvu GHRP-2:n antamisen jälkeen

Tässä tutkimuksessa havaittiin pienten hiirten ruumiinpainon selvää kasvua GHRP-2:n antamisen jälkeen.

Nämä havainnot ovat sopusoinnussa muiden tutkimusten kanssa, joissa dokumentoitiin merkittävä ruumiinpainon nousu ghrh-knockout-hiirillä, joita hoidettiin GHRP-2:lla, ja hiirillä greliinin antamisen jälkeen, mikä osoittaa, että molemmat peptidit indusoivat näissä eläimissä rasvoittumista (61). Huomionarvoista on, että Alba et al. eivät havainneet ghrh-knockout-hiirten pituuskasvun lisääntymistä kuuden viikon hoidon aikana GH RP-2:lla, joka annettiin 10 µg:n annoksella, joka ruiskutettiin ihon alle (s.c.) kahdesti päivässä, mikä vahvisti GHRH:n keskeisen roolin GH:n erittymisessä ja sitä seuraavassa elimistön kasvussa (48). Lisäksi krooninen kuuden viikon hoito 10 µg s.c. GHRP-2:lla ei lisännyt akuuttia GH-vastetta (30 min). Tämä ap-vanhempien ja meidän havaintojemme välinen ristiriita on voinut johtua eroista verenkeräysajankohdassa tai GH-määrityksen herkkyydessä, erilaisista lääkkeen antomenetelmistä (s.c. vs. i.p.) tai näiden tekijöiden yhdistelmästä.

Leptin- ja greliinitasot lit/lit-hiirissä

Arvioimme myös, vaikuttaisiko GHRP-2 leptiini- ja greliinitasoihin.

Acyl-greliinin ja kokonaisgreliinin paastotasot olivat korkeammat villityypin +/+-hiirillä kuin ruokituilla hiirillä (61-63). Plasman greliinin fysiologinen säätely (eli sen nousu ja lasku vastaavasti paasto- ja ruokailutilassa) oli erilainen lit/lit-hiirillä. Tämä havainto voi johtua GHRH:n ja sen inaktiivisen GHRH-R:n vaikutuksen puutteesta, vaikka tätä hypoteesia olisi testattava edelleen.

Korkeat seerumin leptiinipitoisuudet ja lisänousu pitkäaikaisen GHRP-2:n annon jälkeen lit/lit-hiirillä on havaittu myös ipamoreliinilla hoidetuilla hiirillä (34). Näiden havaintojen katsotaan heijastavan GH-puutteisten hiirten lisääntynyttä rasvakudosmassaa ja GHRP-2:n ja greliinin adipogeenistä vaikutusta (61-63).

Tutkittaessa näiden peptidien lipogeenisiä vaikutuksia hiirillä tässä tutkimuksessa käytetyt GHRP-2:n annokset olivat samankaltaisia kuin Tschopin ym. käyttämät annokset ja Janssonin ym. ja Lallin ym. käyttämät GHRP-6-annokset (38,49,61). Ruumiinpainon perusteella tällaiset annokset olivat kuitenkin suhteessa paljon suurempia kuin ihmisillä, joilla on GHRH-R-mutaatio, testatut annokset, mikä saattaa heijastaa lajien välisiä eroja herkkyydessä GHS:lle (61).

Rajalliset tietomme oktanoyyligreeliinin (greliinin) ja seerumin leptiinipitoisuuksista syötetyissä vs. paastoiduissa (17 h) villityypin (+/+) ja lit/lit-hiirissä (-/-) voivat viitata näiden kahden aineenvaihduntahormonin välisiin toimintahäiriöihin. Odotetusti plasman greliinitasot olivat normaalit ruokituilla villityypin hiirillä ja koholla paastotetuilla villityypin hiirillä, joskin havaittiin myös päinvastainen vaikutus, sillä greliinin ja leptiinin pitoisuudet olivat koholla ruokituissa hiirissä eivätkä enää lisääntyneet paastotilanteessa. Lisäksi lit (+/-) -hiirillä saadut tulokset olivat osittain samansuuntaisia kuin lit (-/-) -hiirillä saadut tulokset sikäli, että plasman greliinipitoisuudet eivät nousseet paaston aikana, ja paaston aikana seerumin leptiinipitoisuudet pysyivät koholla syötetyillä ja paastotetuilla lit (+/-ja -/-) -hiirillä. Tutkittujen eläinten rajallinen määrä esti kuitenkin tarkempien johtopäätösten tekemisen. Lopuksi totean, että kokonaisgreliinin mittaaminen oktanyyligreliinitason indikaattorina voi olla ongelmallista. Vaikka kokonais- ja oktanoyloidun greliinin tasot voivat olla osittain samansuuntaisia, tämä vastaavuus heikkenee patofysiologisissa olosuhteissa, kuten tässä hiiritutkimuksessa. Yhä useammat todisteet tukevat desoktanoyyligreliinimolekyylin biologista aktiivisuutta, mikä puolestaan tukee plasman desoktanoyloitujen greliinipitoisuuksien mittaamista spesifisellä määrityksellä, kuten Akamizun ym. julkaisemalla määrityksellä (64).

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että havaintomme ovat ensimmäiset, jotka dokumentoivat GH:n tilastollisesti merkitsevän lisääntymisen GHRP-2:n antamisen jälkeen pienillä hiirillä. Tiedot antavat lisätukea GHRP-2:n suoralle vaikutukselle pikkuhiirten aivolisäkkeissä. Lisäksi heterotsygoottisilla lit/+-hiirillä voi olla hienovaraisia häiriöitä niiden GHRH/GHRH-R/GH-akselilla, mikä viittaa geneettiseen annosvaikutukseen, vaikka tämän päätelmän vahvistamiseksi tarvitaankin lisätietoja.

TAUSTAA

Kiitämme Cristina T. Kanamuraa, B.S., ja Venâncio A. F. Alvesia, M.D., patologian osastolta, Institute Adolfo Lutz, São Paulo, teknisestä tuesta. Haluamme kiittää tohtori Heitor F. Andrade Jr:a, joka toimitti C57BL wt/wt -eläimet. Tätä tutkimusta tuki osittain FAPESP (01/11091-0). S.P.A.T. ja P.B. ovat kansallisen tutkimusneuvoston (CNPq) tutkijoita. RAT on saanut FAPESP:n post doc -apurahan (2009/15386-6). SPAT on saanut CNPq:n stipendin ja apurahan (401990/2010-9).

TUTKIMUSKYSYMYKSET

Peroni CN, Nascimento N ja Bartolini P suorittivat kokeet ja osallistuivat käsikirjoituksen laatimiseen. Hayashida CY osallistui käsikirjoituksen kirjoittamiseen. Toledo RA ja Longuini VC suorittivat geneettiset analyysit. Bowers CY osallistui tuotetestaukseen (ghrp-2), greliinin ja leptiinin mittauksiin ja käsikirjoituksen laatimiseen. Toledo SP kirjoitti ja koordinoi tutkimushankkeen ja oli vanhempi tutkija, joka vastasi käsikirjoituksen laatimisesta.

1. Mayo KE, Miller TL, De Almeida V, Zheng J, Godfrey PA. Kasvuhormonia vapauttavan hormonin reseptori: signaalinsiirto, geeniekspressio ja fysiologinen toiminta kasvun säätelyssä. Ann N Y Acad Sci. 1996;805:184-203, http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.1996.tb17483.x.

2. Kojima M, Hosada H, Date Y, Nakazato M, Matsui H, Kangawa K. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 1999;402:656-60, http://dx.doi.org/10.1038/45230.

3. Nass R, Gaylinn BD, Thorner MO. Greliinin rooli GH:n erityksessä ja GH-häiriöissä. Mol Cell Endocrinol. 2011;340:10-4, http://dx.doi.org/10.1016/j.mce.2011.03.021.

4. Gahete MD, Durán-Prado M, Luque RM, Martínez-Fuentes AJ, Quintero A, Gutiérrez-Pascual E, et al. Understanding the multifactorial control of growth hormone release by somatotropes: lessons from comparative endocrinology. Ann N Y Acad Sci. 2009;1163:137-53, http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.2008.03660.x.

5. Kamenicky P, Lombès M, Chanson P. Uusia näkemyksiä kasvuhormonin fysiologiasta ja patofysiologiasta. Ann Endocrinol (Paris). 2010;71(Suppl 1):S25-32, http://dx.doi.org/10.1016/S0003-4266(10)70004-4.

6. Cannata D, Vijayakumar A, Fierz Y, LeRoith D. GH/IGF-1-akseli kasvussa ja kehityksessä: eläinmalleista saatuja uusia oivalluksia. Adv Pediatr. 2010;57:331-51, http://dx.doi.org/10.1016/j.yapd.2010.

7. Veldhuis JD, Bowers CY. GH:ta vapauttavan hormonin ja GH:ta vapauttavan peptidin synergian määräävät tekijät miehillä. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009;296:E1085-92, http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.91001.2008.

9. Frohman LA, Kineman RD, Kamegai J, Park S, Teixeira LT, Coschigano KT, et al. Secretagogues and the somatotrope: signaling and proliferation. Rec. Prog Horm Res. 2000;55:269-91.

10. De Almeida VI, Mayo KE. Kasvuhormonia vapauttavan hormonin reseptori. Vitam Horm. 2001;63:233-76, http://dx.doi.org/10.1016/S0083-6729(01)63008-5.

11. Olsen LE, Rosenfeld MG. Näkökulma: Geneettiset ja genomiset lähestymistavat aivolisäkkeen kehitysmekanismien selvittämisessä. Endokrinologia. 2002;143:2007-11, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.6.2007.

12. Howard AD, Feighner SD, Cully DF, Arena JP, Liberator PA, Rosenblum CI, et al. Aivolisäkkeen ja hypotalamuksen reseptori, joka toimii kasvuhormonin vapautumisessa. Science. 1996;273:974-77, http://dx.doi.org/10.1126/science.273.5277.974.

13. Horvath TL, Diano S, Sotonyi P, Heiman M, Tschop M. Minireview: ghrelin and the regulation of energy balance-a hypothalamic perspective. Endokrinologia. 2001;142:4163-9, http://dx.doi.org/10.1210/en.142.10.4163.

14. Bowers CY. Kasvuhormonia vapauttava peptidi (GHRP). Cell Mol Life Sci. 1998;54:1316-29, http://dx.doi.org/10.1007/s000180050257.

15. Bowers CY. Kasvuhormonia vapauttavat peptidit (GHRP). In: Kostyo J, Goodman H eds. Fysiologian käsikirja. New York: Oxford University Press. 1999;267-97.

16. Bowers CY. Epäluonnollinen kasvuhormonia vapauttava peptidi synnyttää luonnollista greliinia. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:1464-69, http://dx.doi.org/ 10.1210/jc.86.4.1464.

17. Laferrere B, Hart AB, Bowers CY. Lihavat koehenkilöt reagoivat greliiniagonistin kasvuhormonia vapauttavan peptidi-2:n stimuloivaan vaikutukseen ruoanottoon. Lihavuus. 2006;14:1056-63, http://dx.doi.org/10.1038/oby.2006.121.

18. Dickson SL, Doutrelant-Viltart O, Leng G. GH-puutteelliset dw/dw-rotat ja lit/lit-hiiret osoittavat lisääntynyttä Fos-ekspressiota hypotalamuksen kaarevassa ytimessä GH:ta vapauttavan peptidi-6:n systeemisen injektion jälkeen. J Endocrinol. 1995;146:519-26, http://dx.doi.org/10.1677/joe.0.1460519.

19. Yokote R, Sato M, Matsubara S, Ohye H, Niimi M, Murao K, ym. kasvuhormonia vapauttavan peptidireseptorin molekyylikloonaus ja geeniekspressio rottien kudoksissa. Peptides. 1998;19:15-20, http://dx.doi.org/10.1016/S0196-9781(97)00263-5.

20. Ribeiro AC, LeSauter J, Dupré C, Pfaff DW. Herätyksen suhde sirkadiaaniseen ennakoivaan käyttäytymiseen: ventromediaalinen hypotalamus: yksi solmu nälkä-herätyksen verkostossa. Eur J Neurosci. 2009;30(9):1730-8, http://dx.doi.org/10.1111/j.1460-9568.2009.06969.x.

21. Tamura H, Kamegai J, Shimizu T, Ishii S, Sugihara H, Oikawa S. Greliini stimuloi GH: ta, mutta ei ruoan saantia arcuate nucleus ablated rotilla. Endokrinologia. 2002;143:3268-75, http://dx.doi.org/10.1210/en.2002-220268.

22. Bowers CY, Reynolds GA, Durham D, Barrera CM, Pezzoli SS, Thorner MO. Kasvuhormonia (GH) vapauttava peptidi stimuloi GH:n vapautumista normaaleilla miehillä ja synergisesti GH:ta vapauttavan hormonin kanssa. J Clin Endocrinol Metab. 1990;70:975-82, http://dx.doi.org/10.1210/jcem-70-4-975.

23. Pandya N, DeMott-Friberg R, Bowers CY, Barkan AL, Jaffe CA. Kasvuhormonia (GH) vapauttava peptidi-6 vaatii endogeenista hypotalamuksen GH-erityshormonia maksimaaliseen GH-stimulaatioon. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83:1186-89, http://dx.doi.org/10.1210/jc.83.4.1186.

24. Horikawa R, Tachibana T, Katsumata M, Ishikawa H, Tanaka T. Aivolisäkkeen kasvuhormoni-erityshormonin ja kasvuhormonia vapauttavan hormonireseptorin RNA:n ilmentymisen säätely nuorilla kääpiörotilla. Endocr J. 2000;47:S53-S56, http://dx.doi.org/10.1507/endocrj.47.SupplMarch_S53.

25. Cunha SR, Mayo KE. Greliini ja kasvuhormonin (GH) sekretagoogit voimistavat GH-erityshormonin (GHRH) aiheuttamaa syklisen adenoosi 39,59monofosfaatin tuotantoa soluissa, jotka ilmentävät transfektoituja GHRH- ja GH-erityshormonireseptoreita. Endokrinologia. 2002;143:4570-82, http://dx.doi.org/10.1210/en.2002-220670.

26. Dickson SL, leng G, Dyball RE, Smith RG. Peptidisten ja ei-peptidisten kasvuhormonin eritystä edistävien aineiden keskeiset vaikutukset rotalla. Neuroend ocrinology. 1995;61:36-43, http://dx.doi.org/10.1159/000126825.

27. Popovic V, Damjanovic S, Micic D, Djurovic M, Diegez C, Casanueva FF. Estetty kasvuhormonia vapauttavan peptidin (GHRP-6) aiheuttama GH:n eritys ja GHRP-6:n ja GH:ta vapauttavan hormonin synergisen vaikutuksen puuttuminen potilailla, joilla on hypotalamo-aivolisäkkeen disconnection: todisteet siitä, että GHRP-6:n päävaikutus ilmenee hypotalamuksen tasolla. J Clin Endocrinol Metab. 1995;80:942-47, http://dx.doi.org/10.1210/jc.80.3.942.

28. Gondo RG, Aguiar-Oliveira MH, Hayashida CY, Toledo SP, Abelin N, Levine MA ym. kasvuhormonia vapauttava peptidi-2 stimuloi GH:n eritystä GH-puutteisilla potilailla, joilla on mutatoitunut GH:ta vapauttava hormonireseptori. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:3279-83, http://dx.doi.org/10.1210/jc.86.7.3279.

29. Maheshwari HG, Pezzoli SS, Rahim A, Shalet SM, Thorner MO, Baumann G. Pulssimainen kasvuhormonin eritys säilyy geneettisessä kasvuhormonia vapauttavan hormonin resistenssissä. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002;282:E943-E951.

30. Roelfsema F, Biermasz NR, Veldman RG, Veldhuis JD, Frölich M, Stokvis-Brantsma WH, et al. Kasvuhormonin (GH) eritys potilailla, joilla on GH:ta vapauttavan hormonin (GHRH) reseptorin inaktivoiva vika, on pulssimaista: todisteet muiden kuin GHRH:n syötteiden roolista GH-pulssien synnyssä. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:2459-64, http://dx.doi.org/10.1210/jc.86.6.2459.

31. Mayo KE. Kasvuhormonia vapauttavan hormonin aivolisäkespesifisen reseptorin molekyylikloonaus ja ilmentyminen. Mol Endocrinol. 1992;6:1734-44, http://dx.doi.org/10.1210/me.6.10.1734.

32. Godfrey P, Rahal JO, Beamer WG, Copeland NG, Jenkins NA, Mayo KE. Pikkuhiirien GHRH-reseptori sisältää solunulkoisessa domeenissa missense-mutaation, joka häiritsee reseptorin toimintaa. Nat Genet. 1993;4:227-32, http://dx.doi.org/10.1038/ng0793-227.

33. Lin SC, Lin CR, Gukovsky I, Lusis AJ, Sawchenko PE, Rosenfeld MG. Pikkuhiiren fenotyypin molekulaarinen perusta ja vaikutukset solutyyppispesifiseen kasvuun. Nature. 1993;364:208-13, http://dx.doi.org/10.1038/364208a0.

34. Beck JA, Lloyd S, Hafezparast M, Lennon-Pierce M, Eppig JT, Festing MFW, et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 2000;24:235, http://dx.doi.org/10.1038/71641.

35. Wajnrajch MP, Gertner JM, Harbison MD, Chua SC Jr, Leibel RL. Nonsense-mutaatio ihmisen kasvuhormonia vapauttavassa hormonireseptorissa aiheuttaa pienen (lit) hiiren kaltaisen kasvuhäiriön. Nat Genet. 1996;12:88-90, http://dx.doi.org/10.1038/ng0196-88.

36. Netchine I, Talon P, Dastot F, Vitaux F, Goossens M, Amselem S. Laajamittainen fenotyyppinen analyysi perheestä, jolla on kasvuhormonin (GH) puutos, joka johtuu mutaatiosta GH:ta vapauttavan hormonireseptorin geenissä. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83:432-36, http://dx.doi.org/10.1210/jc.83.2.432.

37. Salvatori R, Hayashida CY, Aguiar-Oliveira MH, Phillips JA 3rd, Souza AH, Gondo RG, et al. Familial dwarfism due to a novel mutation of the growth hormone-releasing hormone receptor gene. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84:917-23, http://dx.doi.org/10.1210/jc.84.3.917.

38. Jansson JO, Downs TR, Beamer WG, Frohman LA. Reseptoriin liittyvä resistenssi kasvuhormonia vapauttavalle tekijälle kääpiö- ”pienillä” hiirillä. Science. 1986;232:511-2.

39. Gaylinn BD, De Almeida VI, Lyons CE Jr, Wu KC, Mayo KE, Thorner MO. Pikkuhiiren mutantti kasvuhormonia vapauttavan hormonin (GHRH) reseptori ei sido GHRH:ta. Endocrinology. 1999;140:5066-74, http://dx.doi.org/10.1210/en.140.11.5066.

40. Clark RG, Robinson ICAF. Ihmisen kasvuhormonia vapauttavan tekijän fragmentin vaikutukset normaaleilla ja pienillä hiirillä. J Endocrinol. 1985;106:1-5, http://dx.doi.org/10.1677/joe.0.1060001.

41. Jansson JO, Downs TR, Beamer WG & Frohman LA. Kääpiöpikkuhiiri (lit/lit) on resistentti kasvuhormonia (GH) vapauttavalle peptidille (GHRP-6) sekä GH:ta vapauttavalle hormonille (GRH). Program of the 68th Annual Meeting of the Endocrine Society, Anaheim, CA, 1986; s.130 (tiivistelmä).

42. Roh SG, Chen C, Choi KC, Shrestha Y, Sasaki S. Onko GHRH-reseptori välttämätön GHRP-2-indusoidulle GH:n eritykselle primaarisesti viljellyissä rotan aivolisäkesoluissa? Endocrinology. 2002;143:1964-47, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.5.1964.

43. Bellini MH, Bartolini P. In vivo -biomääritys ihmisen kasvuhormonin tehon määrittämiseksi kääpiö- ”pikkuhiirillä”. Endocrinology. 1993;132:2051-55, http://dx.doi.org/10.1210/en.132.5.2051.

44. Lourenço DM Jr, Toledo RA, Coutinho FL, Margarido LC, Siqueira SA, dos Santos MA, et al. Kliinisten ja geneettisten seulontojen vaikutus multippelin endokriinisen neoplasiatyypin 1 hoitoon. Clinics. 2007;62:465-76, http://dx.doi.org/10.1590/S1807-59322007000400014.

45. Toledo RA, Mendonça BB, Fragoso MCBV, Soares IC, Almeida MQ, Moraes MB, et al. Isolated familial somatotropinoma: 11q13-loh ja geeni/proteiini-ekspressioanalyysi viittaa aip:n mahdolliseen osallisuuteen myös muussa kuin aivolisäkkeen kasvainten synnyssä. Clinics. 2010;65:40715, http://dx.doi.org/10.1590/S1807-59322010000400010.

46. Rodbard D. Radioligandimääritysten pienimmän havaittavan pitoisuuden (herkkyyden) tilastollinen arviointi. Anal Biochem. 1978;90:1-12, http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(78)90002-7.

47. Bellini MH, Mathor MB, De Luca M, Cancedda R, Bartolini P. Ultrasensitiivinen in vivo -biomääritys havaitsee bioaktiivisen ihmisen kasvuhormonin transduktoiduissa primaarisissa ihmisen keratinosyyteissä. J Endocrinol Invest. 1998;21:1-6, http://dx.doi.org/10.3109/07435809809031865.

48. Ghigo E, Arvat E, Muccioli G, Camanni F. Kasvuhormonia vapauttavat peptidit. Eur J Endocrinol. 1997;136:445-60, http://dx.doi.org/10.1530/eje.0.1360445.

49. Lall S, Tung LYC, Ohlsson C, Jansson JO, Dickson SL. Kasvuhormoni(GH)-riippumaton rasvoittumisen stimulointi GH-erityislääkkeillä. Biochem Biophys Res Commun. 2001;280:132-38, http://dx.doi.org/10.1006/bbrc.2000.4065.

50. Sornson MW, Sornson MW, Wu W, Dasen JS, Flynn SE, Norman DJ, O’Connell SM, et al. Aivolisäkkeen linjan määräytyminen Amesin kääpiökasvuisuudessa viallisen Pit-1-homeodomeenitekijän Profeetan mukaan. Nature. 1996; 384:327-33, http://dx.doi.org/10.1038/384327a0.

51. Li S, Crenshaw EB 3rd, Rawson EJ, Simmons DM, Swanson LW, Rosenfeld MG, Dwarf locus -mutantit, joista puuttuu kolme aivolisäkkeen solutyyppiä, johtuvat POU-domain-geenin pit-1 mutaatioista. Nature. 1990;347:528-33, http://dx.doi.org/10.1038/347528a0.

52. Hayashida CY, Gondo RG, Ferrari C, Toledo SP, Salvatori R, Levine MA, et al. Familiaalinen kasvuhormonipuutos, johon liittyy mutatoitunut GHRH-reseptorigeeni: kliiniset ja hormonaaliset löydökset homotsygoottisilla ja heterotsygoottisilla henkilöillä Itabaianinhasta. Eur J Endocrinol. 2000;142:557-63, http://dx.doi.org/10.1530/eje.0.1420557.

53. Pernasetti F, Toledo SP, Vasilyev VV, Hayashida CY, Cogan JD, Ferrari C, ym. heikentynyt adrenokortikotropiini-lisämunuaisakseli yhdistetyssä aivolisäkkeen hormonipuutoksessa, jonka aiheuttaa kahden emäsparin deletio (301-302delAG) Pit-1-geenin profeetassa. J Clin Endocrinol Metab. 2000;85:390-7, http://dx.doi.org/10.1210/jc.85.1.390.

54. Maheshwari HG, Rahim A, Shalet SM, Baumann G. Kasvuhormoni (GH) -vasteen selektiivinen puuttuminen GH:ta vapauttavalle peptidille heksareliinille potilailla, joilla on GH:ta vapauttavan hormonin reseptorin puutos. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84:956-59, http://dx.doi.org/10.1210/jc.84.3.956.

55. Fintini D, Alba M, Schally AV, Bowers CY, Parlow AF, Salvatori R. Kasvuhormonia vapauttavan hormonianalogin ja kasvuhormonin erityslääkkeen yhdistetyn pitkäaikaishoidon vaikutukset kasvuhormonia vapauttavan hormonin knock out -hiirellä. Neuroen docrinology. 2005;82:198-207, http://dx.doi.org/10.1159/000092520.

56. Alba M, Fintini D, Bowers CY, Parlow AF, Salvatori R. Kasvuhormonia vapauttavan peptidi-2:n pitkäaikaishoidon vaikutukset GHRH:n knockout-hiirellä. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005;289:E762-E767, http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.00203.2005.

57. Cheng TC, Beamer WG, Phillips JA, Bartke A, Mallonee RL, Dowling C. Kasvuhormonin puutteen etiologia Little-, Ames- ja Snell-kääpiöhiirillä. Endokrinologia. 1983;113:1669-78, http://dx.doi.org/10.1210/endo-113-5-1669.

58. Marmary Y, Parlow AF, Goldsmith CM, He X, Wellner RB, Satomura K, ym. hiiren kasvuhormonia koodaavan replikaatiopuutteisen rekombinanttisen adenoviruksen rakentaminen ja in vivo teho. Endocrinology. 1999;140:260-65, http://dx.doi.org/10.1210/en.140.1.260.

59. Hammer RE, Palmiter RD, Brinster RL. Hiiren perinnöllisen kasvuhäiriön osittainen korjaus uuden geenin sukusolulinjan sisällyttämisellä. Nature. 1984;311:65-7, http://dx.doi.org/10.1038/311065a0.

60. Hahn TM, Copeland KC, Woo SLC. Kääpiökasvuisuuden fenotyyppinen korjaus kasvuhormonin konstitutiivisella ilmentymisellä. Endocrinology. 1996;137:4988-93, http://dx.doi.org/10.1210/en.137.11.4988.

61. Tschop M, Smiley DL, Heiman ML. Greliini aiheuttaa rasvoittumista jyrsijöillä. Nature. 2000;407:908-13, http://dx.doi.org/10.1038/35038090.

62. Toshinai K, Mondal MS, Nakazato M, Date Y, Murakami N, Kojima M, ym. greliinin ilmentymisen pregulaatio vatsassa paaston, insuliinin aiheuttaman hypoglykemian ja leptiiniannostelun yhteydessä. Biochem Biophys Res Commun. 2001;281:1220-25, http://dx.doi.org/10.1006/ bbrc.2001.4518.

63. Tschop M, Statnich MA, Suter TM, Heiman ML. GH-vapauttava peptidi-2 lisää rasvamassaa hiirillä, joilta puuttuu NPY: osoitus hypotalamuksen agoutiin liittyvän proteiinin ratkaisevasta välittävästä roolista. Endocrinology. 2002;143:558-68, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.2.558.

64. Akamizu T, Shinomiya T, Irako T, Fukunaga M, Nakai Y, Nakai Y, et al. Acylated and desacyl ghrelinin plasmapitoisuuksien erillinen mittaus terveillä koehenkilöillä käyttäen uutta suoraa ELISA-määritystä. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90:6-9, http://dx.doi.org/10.1210/jc.2004-1640.