3.4 Inosiinimodifikaatio ja mRNA:n kierto

MRNA:iden adenosiini-inosiini-(A-I)-modifikaatiota katalysoivat RNA-entsyymeissä toimivat adenosiinideaminaasit (ADAR). Nämä entsyymit suosivat kaksisäikeisiä RNA-alueita, ja A-I:n muuntaminen (jota tässä jaksossa kuvataan myös editointina) muuttaa muunnettujen emästen emäspariutumisominaisuuksia, sillä ne muodostavat nyt emäsparin samalla tavalla kuin guaniini. Kuten aiemmin tehtiin, erotamme inosiinin suorat vaikutukset mRNA:n stabiilisuuteen epäsuorista vaikutuksista johtuvista vaikutuksista. Inosiinin lisääminen RNA:n kaksijuosteisiin alueisiin voi käynnistää hajoamisen rekrytoimalla ribonukleaaseja, jotka ovat spesifisiä inosiinia sisältäville RNA:ille. Ensimmäinen tämän vaikutuksen välittäjäksi ehdotettu entsyymi on Tudor-stafylokokki-nukleaasi (SN), jonka osoitettiin edistävän hypereditoitujen kaksisäikeisten RNA:iden pilkkoutumista uutteissa. Useimmat tässä tutkimuksessa kuvatuista tuloksista osoittavat Tudor-SN:n biokemiallisen aktiivisuuden hypereditoituja substraatteja kohtaan in vitro. Näiden tutkimusten perusteella on kuitenkin epäselvää, mikä osa inosiinia sisältävistä mRNA:ista joutuu Tudor-SN:n pilkkomaksi in vivo ja oliko Tudor-SN suora endonukleaasi vai ei. Tudor-SN:n havaittiin lokalisoituvan sytoplasmisiin stressirakeisiin , joten on mahdollista, että jotkin sen kohdetranskripteistä saattavat olla ensisijaisesti säänneltyjä stressitilanteissa. Toinen nukleaasi, jonka tiedetään olevan spesifinen inosiinia sisältäville RNA:ille, on ihmisen endonukleaasi V (hEndoV), joka voi pilkkoa erilaisia inosiinia sisältäviä RNA-substraatteja in vitro . Eräässä tutkimuksessa ehdotettiin, että hEndoV on varsinainen inosiini-endonukleaasi, ja Tudor-SN antaa hEndoV:lle stimuloivan vaikutuksen . Mielenkiintoista on, että hEndoV lokalisoituu myös sytoplasmisiin stressirakeisiin , mikä viittaa Tudor-SN:n kaltaiseen toimintaan inosiinia sisältävien mRNA:iden tasojen mahdollisessa säätelyssä stressin aikana. Kaiken kaikkiaan on selvää, että eukaryoottisoluissa on inosiinispesifisiä nukleaasiaktiviteetteja (kuva 5), mutta niiden vaikutus mRNA:n pilkkomiseen ja liikevaihtoon tunnetaan edelleen huonosti. Siksi Tudor-SN:n ja/tai hEndoV:n suorittaman hypereditoidun dsRNA:n pilkkomisen fysiologista vaikutusta on tutkittava perusteellisemmin.

ADAR-entsyymeillä voi olla myös merkittävä rooli mRNA:n stabiilisuudessa säätelemällä mRNA:n hajoamiseen vaikuttavien RNA:ta sitovien proteiinien sitoutumista. ADAR-entsyymien vaikutusta kohde-mRNA:idensa tasoon mitattiin globaalisti, ja yleisesti ottaen niiden vaikutus mRNA:n tasoon ei korreloi hyvin niiden kykyyn edistää inosiinin muodostumista näissä mRNA:issa . Pikemminkin näyttää siltä, että ADAR:ien pääasiallinen vaikutus mRNA:n vakauteen tapahtuu RNA:ta sitovan proteiinin HuR:n (ELAVL1) rekrytoinnin kautta, joka on merkittävä mRNA:n hajoamisen säätelijä. ADAR1 on vuorovaikutuksessa HuR:n kanssa RNA-riippuvaisella tavalla, ja useimmat ADAR1:n puuttuessa alasreguloituneet mRNA:t sisältävät HuR:ää sitovia kohtia . Näin ollen ADAR1 näyttää vaikuttavan mRNA-kohteidensa vakauteen rekrytoimalla HuR:n lähellä sijaitseviin kohdekohtiin. ADAR:t voivat myös säädellä useiden mRNA:iden ja ncRNA:iden tasoja estämällä hajoamistekijä PARN:n, joka on poly(A)-spesifinen nukleaasi, sitoutumisen . Tämä toiminto näyttää myös olevan riippumaton editoinnista, sillä katalyyttisesti inaktiivinen ADAR-mutantti pystyy täyttämään entsyymin tehtävät hajoamisen ohjaamisessa. Siten ADAR:ien vaikutus niiden mRNA-kohteiden vakauteen näyttää olevan enimmäkseen riippumaton niiden kyvystä edistää inosiinin muodostumista.

Tärkeä seuraus inosiinimodifikaation vaikutuksesta mRNA:n liikevaihtoon johtuu inosiinin vaikutuksesta mikroRNA-välitteiseen geenien säätelyyn. Inosiinin läsnäolo voi vaikuttaa tämän reitin kahteen tärkeään vaiheeseen: (i) mikroRNA:iden biogeneesiin ja (ii) mikroRNA:iden mRNA:iden kohdentumisen spesifisyyteen. Inosiinin vaikutuksesta mikroRNA:iden biogeneesiin osoitettiin, että ADAR1 tai ADAR2 voivat muokata mikroRNA:iden primaarisia esiasteita. Inosiinin läsnäololla näissä esiasteissa on kaksi haitallista vaikutusta kypsien mikroRNA:iden tuotantoon . Ensinnäkin inosiini vähentää primaaristen esiasteiden Drosha-prosessoinnin tehokkuutta; toiseksi inosiinia sisältävistä esiasteista tulee nyt inosiinispesifisten ribonukleaasien, kuten Tudor-SN:n ja/tai hEndoV:n, kohde. Nämä mikroRNA:iden primaarisiin esiasteisiin kohdistuvan inosiinimodifikaation yhteisvaikutukset johtavat näistä esiasteista tuotettujen mikroRNA:iden määrän vähenemiseen ja samanaikaiseen kohde-mRNA:iden määrän kasvuun. Tätä prosessia voidaan säädellä, sillä miR-151-mikroRNA:n esiasteiden osoitettiin muokkautuvan varhaisen kehityksen aikana, mikä johtaa esiasteen hajoamiseen Tudor-SN:n avulla. Yleisemmin inosiinia sisältävien mikroRNA:iden esiasteet hajoavat postzygoottisten vaiheiden aikana hiirissä . Nämä tulokset osoittavat, että mikroRNA-esiasteiden A-I-editointi voi säädellä niiden biogeneesiä kehityksen aikana, mikä puolestaan vaikuttaa suoraan niiden mRNA-kohteiden ilmentymiseen. ADAR:ien vaikutus mikroRNA:n biogeneesiin on kuitenkin monimutkainen, koska ADAR1:n osoitettiin myös heterodimeeroituvan RNaasi III -entsyymin Dicerin kanssa mikroRNA:n prosessoinnin tehokkuuden lisäämiseksi , jolloin sillä on positiivinen rooli mikroRNA:n biogeneesissä. ADAR:ien suorien ja epäsuorien vaikutusten monimutkaisuus pienten RNA:iden biogeneesiin osoitettiin myös koko genomin laajuisesti Caenorhabditis elegansissa. Lopuksi ADAR1 voi myös sitoa siRNA:ita nisäkässoluissa RNA:n muokkauksesta riippumatta, mikä rajoittaa siRNA-hoidon tehokkuutta . Näin ollen ADARit näyttävät olevan kaksiteräinen miekka mikroRNA:n ja pienten RNA:iden välittämälle geenien vaimentamiselle, sillä inosiinimodifikaation tukahduttavan vaikutuksen mikroRNA:n esiasteiden prosessointiin ja stabiilisuuteen voi tasapainottaa ADARien kyky edistää mikroRNA:n prosessointia yhdistymällä Diceriin ja niiden vaikutus siRNA:n saatavuuteen. Näillä entsyymeillä on kuitenkin keskeisiä tehtäviä solujen erilaistumisen ohjaamisessa mikroRNA-esiasteiden muokkaamisen kautta. Esimerkiksi leukemiassa ADAR1:n suorittaman Let-7-mikroRNA-esiasteen hypereditoinnin osoitettiin edistävän leukemian kantasolujen uusiutumista , mikä korostaa mikroRNA-esiasteiden editoinnin hienosäädön merkitystä solujen erilaistumisen aikana.

Inosiini vaikuttaa myös mikroRNA-välitteiseen mRNA:n säätelyyn vaikuttamalla RNA-dupleksin muodostumiseen, mikä on kriittinen tekijä määriteltäessä mikroRNA:n ja mRNA:n välisten vuorovaikutussuhteitten spesifisyyttä (kuva 5). Tämä osoitettiin ensimmäisen kerran osoittamalla, että inosiinin lisääminen miR-376-mikroRNA:han johti erilaisen mRNA-ryhmän tukahduttamiseen suhteessa niihin, joita muokkaamaton miR-376 tukahdutti. Jos muokattu kohta sijaitsee mikroRNA:n siemenjaksossa, modifikaatio johtaa mikroRNA:iden spesifisyyden muuttumiseen, koska inosiini muodostaa emäspareja mieluiten C:n kanssa. Vastaavasti mRNA:iden 3′-UTR-sekvenssien A-I-editointi muuttaa mikroRNA:iden potentiaalista kohdentumista kyseisiin UTR-sekvensseihin, ja se voi synnyttää uusia mikroRNA:iden sitoutumiskohtia . Säädellyn editoinnin osoitettiin olevan mahdollisesti tärkeää onkogeenien ja kasvainsuppressorigeenien säätelyssä mikroRNA:iden välityksellä solumuutoksen aikana .

Viimeiseksi inosiini voi vaikuttaa mRNA:n vakauteen epäsuorien vaikutusten kautta. Inosiinia sisältävien mRNA:iden on havaittu rajoittuvan ytimeen LPS-stimuloituneissa immuunisoluissa , mikä estää niiden altistumisen sytoplasmiselle mRNA:n hajotuskoneistolle. Näiden mRNA:iden jääminen ytimeen altistaisi ne kuitenkin ensisijaiselle hajoamiselle ytimen hajoamisreittien, kuten ydinvoiman eksosomin, kautta. Tämä voi johtaa vakauden lisääntymiseen tai heikkenemiseen riippuen siitä, kuinka tehokkaasti kukin näistä hajoamisväylistä vaikuttaa tiettyihin mRNA:hin. Inosiini vaikuttaa myös vaihtoehtoiseen splikointiin, mikä puolestaan voi johtaa mRNA:n isomuotoihin, joilla on erilainen stabiilius. Tämä pätee erityisesti, jos vaihtoehtoisesti splikoituneissa lajeissa on sitoutumiskohtia erilaisille RNA:ta sitoville proteiineille, jotka muokkaavat niiden stabiilisuutta. Näin ollen inosiini ja ADAR:t voivat vaikuttaa mRNA:n vakauteen ja ilmentymiseen monin tavoin sekä suorien että epäsuorien vaikutusten yhdistelmällä.