Toimittanut Sarah Moore, M.Sc.Arvostellut Michael Greenwood, M.Sc.

Immunovärjäys kattaa lukuisia tekniikoita, jotka soveltuvat useisiin erilaisiin sovelluksiin.

Image Credit: Jarun Ontakrai/.com

Ne ovat kuitenkin kaikki menetelmiä, jotka perustuvat vasta-aineiden käyttöön proteiinien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi biologisissa näytteissä. Niitä voidaan käyttää epänormaalien solujen, blastien infiltraattien ja megakaryosyyttien topografisen jakautumisen arviointiin ja tunnistamiseen.

Termi keksittiin jo vuonna 1941, jolloin sitä käytettiin ensimmäisen kerran kuvaamaan immunohistokemiallisia värjäyksiä. Nykyään immunohistokemiallinen värjäys on vain yksi monista vakiintuneista immunovärjäystekniikoista, joihin kuuluvat muun muassa entsyymisidonnainen immunosorbenttimääritys, virtaussytometria, immunosähkömikroskopia ja Western blotting.

Tekniikat ovat arkipäivää biologian ja molekyylibiologian laboratorioissa, ja niitä käytetään moniin erilaisiin sovellutuksiin monenlaisilla tutkimusaloilla onkologiasta hydrobiologiaan.

Tässä kuvataan viisi erilaista immunovärjäystekniikkaa.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Enzyme-linked immunosorbent assay, joka tunnetaan myös nimellä ELISA, on yleisesti käytössä biokemiassa. Engvallin ja Perlmannin vuonna 1971 kehittämässä menetelmässä kvantifioidaan näytteessä olevia peptidejä, proteiineja, vasta-aineita ja hormoneja immobilisoimalla antigeeni kiinteälle pinnalle ennen kuin se kompleksoituu entsyymiin liittyvän vasta-aineen kanssa.

Tällöin tunnistaminen on mahdollista, kun konjugoidun entsyymin aktiivisuutta arvioidaan inkuboimalla sitä substraatin kanssa, jolloin saadaan mitattavissa oleva tuote.

Virtaussytometria

Kun solujen tai hiukkasten fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet halutaan määrittää, virtaussytometria on usein sopivin menetelmä. Tekniikka otettiin käyttöön 1950-luvulla, ja vuosikymmenen aikana sen menetelmissä ja laitteissa on saavutettu monia edistysaskeleita. Nykyisin mittaukset tehdään liuoksessa olevista soluista, kun ne kulkevat laitteen laserin läpi 10 000 solun sekuntinopeudella. Virtaussytometria tarjoaa etuja sitä käyttäville teknikoille, kuten suuren näytteenkäsittelynopeuden, mikä tekee siitä houkuttelevan vaihtoehdon immunovärjäysmääritykseksi.

Immuno-elektronimikroskopia (EM-immunomerkintä)

Immuno-elektronimikroskopia, josta käytetään myös nimityksiä EM-immunomerkintä ja immuno-EM, on tekniikka, jossa vasta-ainemolekyylit merkitään elektronitiheillä aineilla, tavallisesti ja tehokkaimmin pienillä kultahiukkasilla, jotka näkyvät analyysin aikana helposti havaittavina tummina pisteinä. Määritys mahdollistaa useamman kuin yhden molekyylityypin samanaikaisen havaitsemisen, koska erikokoisia partikkeleita voidaan käyttää eri vasta-aineiden merkitsemiseen.

Tekniikka kehitettiin alun perin diagnostiseksi apuvälineeksi, joka auttoi virusten, kuten gastroenteriitin ja rotaviruksen, havaitsemisessa ja tunnistamisessa. Nykyään sitä käytetään edelleen erilaisten virusinfektioiden diagnosointiin. Sitä pidetään yhtenä herkimmistä ja nopeimmista menetelmistä tähän tarkoitukseen.

Immunohistokemia

Immunovärjäyksen yleisin sovellus on immunohistokemia, jota käytetään apuna erilaisten sairauksien, kuten erilaisten syöpien diagnosoinnissa. Se on osoittautunut käyttökelpoiseksi myös neuropatologiassa ja hematopatologiassa, mikä auttaa näiden ryhmien sairauksien luokittelussa ja niiden diagnoosikriteerien kehittämisessä. Toinen ala, jolla sillä on ollut merkittävä vaikutus, on geneettinen tutkimus, jossa sitä on käytetty tiettyjen geenituotteiden roolin määrittämiseen ja niiden toiminnan selvittämiseen tärkeissä biologisissa prosesseissa. Menetelmästä on tullut korvaamaton sekä lääketieteellisessä tutkimuksessa että kliinisessä diagnostiikassa.

Menetelmässä tunnistetaan valikoivasti antigeenejä kudosleikkeessä olevasta solunäytteestä sillä periaatteella, että tietyt vasta-aineet sitoutuvat kudoksessa esiintyviin tiettyihin antigeeneihin. Menetelmä vakiintui jo 1930-luvulla, ennen kuin siitä raportoitiin ensimmäisen kerran vuonna 1941.

Alkuperäisessä periaatteessa hahmoteltiin, että fluoresoivalla väriaineella leimatut vasta-aineet pystyivät havaitsemaan pneumokokkiantigeenit infektoituneissa kudoksissa. Sittemmin tekniikkaa on kehitetty, ja käyttöön on otettu uusia entsyymimerkkejä, kuten peroksidaasi, alkalinen fosfataasi ja kolloidinen kulta. Myös radioaktiivisten alkuaineiden käyttöä on kehitetty autoradiografiaa varten.

Western blotting

Viimeinen immunovärjäysmenetelmä on Western blot -menetelmä, laajalti käytetty tekniikka, joka on vakiinnuttanut paikkansa solu- ja molekyylibiologian alalla. Western blot -menetelmän avulla tutkijat voivat määrittää ja kvantifioida solussa esiintyviä proteiineja ja tunnistaa spesifisiä proteiineja solunäytteissä esiintyvien proteiinien seoksesta.

Western blot -menetelmässä on kolme osaa, joista ensimmäinen on erottelu koon mukaan, toinen on siirto kiinteälle alustalle ja lopuksi kohdeproteiini merkitään sopivalla primäärisellä ja sekundäärisellä vasta-aineella sen visualisoimiseksi.

Yhteenveto

Immunovärjäysmenetelmistä on tullut välttämättömiä lukuisilla tieteellisen tutkimuksen aloilla, ja ne ovat vakiintuneet myös erilaisiin kliinisiin sovelluksiin, useimmiten diagnosoinnin avustamiseen sekä sellaisten ominaisuuksien määrittämiseen, jotka helpottavat tarkempien diagnostisten kriteerien määrittämistä.

Sen jälkeen, kun immunohistokemiasta raportoitiin ensimmäisen kerran vuonna 1941, on syntynyt neljä muuta immunovärjäysmenetelmää: entsyymisidottu immunosorbenttimääritys, virtaussytometria, immunoelektronimikroskopia ja Western blotting. Näitä menetelmiä laajennetaan ja kehitetään koko ajan, mikä lisää niiden käyttöä eri sovelluksissa ja parantaa niiden tarkkuutta ja luotettavuutta.

Lisälukemista

• Kaikki immunologian sisältö
• Mitä on immunologia?
• Klassinen immunologia
• Kliininen immunologia
• Kehitysimmunologia