MUCUS HYPERSECRETION AND CHRONIC RESPIRATORY DISEASE

Hypersekretio liman erittyminen hengitysteihin on merkittävä tekijä sairastuvuudessa ja kuolleisuudessa monilla potilailla, joilla on vakavia kroonisia keuhkosairauksia, kuten krooninen obstruktiivinen keuhkoahtaumatauti (COPD), astma ja kystinen fibroosi.35 Liiallinen lima hengitysteissä voi rajoittaa ilmavirtausta, ja sen esiintyminen on erityinen riskitekijä niille keuhkoahtaumatautipotilaille, jotka ovat alttiita rintatulehduksille. Keuhkoahtaumatauti (COPD) on vakava krooninen hengitysteiden tulehdussairaus, joka käsittää kolme sairautta: kroonisen keuhkoputkentulehduksen (pitkäaikainen hengitysteiden liman liikaeritys), pienten hengitysteiden sairauden ja keuhkolaajentuman (emfyseema).36 Keuhkoahtaumataudin esiintyvyys ja taloudellinen taakka kasvavat maailmanlaajuisesti.37,38 Keuhkoahtaumataudissa potilailla, joilla on krooninen liman liikaeritys, on huomattavasti suurempi sairaalahoidon ja kuoleman riski kuin potilailla, joilla ei ole merkittävää keuhkoputkentulehdusta.39,40,40. Keuhkoahtaumataudin nykyiset hoidot ovat palliatiivisia eivätkä pysäytä taudin etenemistä,41 eikä liman ylieritykseen ole olemassa erityistä hoitoa.42 Koska keuhkoahtaumataudin patofysiologian mihinkään osa-alueeseen ei ole olemassa tehokasta hoitoa, liman ylieritykseen tarkoitettujen hoitojen kehittäminen on perusteltua. Kyky poistaa limaa keuhkoista hengitysteiden värekarvojen liikkeen avulla riippuu sen viskositeetista ja elastisuudesta. Nämä ominaisuudet määräytyvät liman sisältämien mukiiniglykoproteiinien paino-osuuden mukaan.43 MUC5AC ja MUC5B ovat tärkeimpiä mukiineja sekä ihmisen normaaleissa että patologisissa hengitysteiden eritteissä44 . Keuhkoahtaumatautia sairastavilla potilailla MUC5AC- ja MUC5B-musiinien pitoisuudet ovat lisääntyneet hengitysteiden limassa, vaikka MUC5B:tä erittyykin suhteellisesti enemmän.45 Musiinit erittyvät hengitysteihin epiteelin puslasoluista ja submukoosan seromukoosirauhasista.43 Yksi mahdollisuus liman erityksen estämiseen on hyödyntää klostridien neurotoksiinien endopeptidaasien vesikkelifuusion estävää vaikutusta, joka kohdistetaan hengitysteiden mukiinia erittäviin soluihin käyttämällä sopivaa kohdistusligandia.

Sen tutkimiseksi, pilkkoisiko sopivasti kohdennettu klostridien endopeptidaasi SNARE-proteiineja ihmisen hengitysteiden epiteelisoluissa ja estäisikö se siten liman eritystä, BoNT/C:n LHN-domeenia ja EGF:ää koodaavasta rekombinantti-geenistä tuotettiin fuusioproteiini, jota nimitettiin EGF-LHN/C:ksi ja jonka tarkoituksena oli kohdistaa EGFReseptorit limakalvoa erittäviin soluihin.34 EGF valittiin prototyyppiligandiksi tällaisen fuusioproteiinin luomista varten, koska EGF-reseptoreita on ihmisen hengitysteiden epiteelisoluissa46,47 ja ne lisääntyvät astmaa ja keuhkoahtaumatautia sairastavien potilaiden48 sekä tupakoitsijoiden hengitysteiden epiteelissä.49. Rekombinanttifuusioproteiini EGF-LHN/C pilkkoi in vitro in vitro ihmisen limakalvometastaattisessa solulinjassa, H292-soluissa, asiaankuuluvan SNARE-proteiinin syntaksiinin konsentraatiosta riippuvaisesti.34 H292-solujen esikäsittely EGF-LHN/C:llä estää stimuloidun musiinin vapautumisen vasteena EGF:n ja tuumorinekroositekijä-α:n (TNFα) yhdistettyyn stimulaatioon konsentraatiosta riippuvaisella tavalla, ja IC50-arvo on suunnilleen 0,4 nM (kuva 28-1). Tämä on hyvin verrattavissa EGF-LHN/C:n aiemmin raportoituun estävään vaikutukseen stimuloituun mukiinin vapautumiseen toisesta hengitysteiden epiteelisolulinjasta, ihmisen tyypin II alveolisolulinjasta A549, vasteena samaan ärsykkeeseen.34 Kummassakaan solutyypissä EGF-LHN/C:llä ei ollut havaittavaa vaikutusta mukiinin erityksen perustasoon. EGF-LHN/C:n aiheuttama mukiinin erityksen esto johtuu sen endopeptidaasiaktiivisuuden kohdennetusta annostelusta EGF-reseptorin kautta, eikä se johdu solujen sytotoksisuudesta tai reseptorin antagonismista tai alaregulaatiosta.34. EGF-LHN/C pystyy myös estämään stimuloidun mukiinin vapautumisen A549-soluista vasteena sytokiinien stimuloivalle cocktailille, joka on 1 ng/ml interferoni (IFN)-γ:n, TNFα:n ja interleukiini (IL)-1β:n yhdistelmä, jota kutsutaan sytomixiksi (kuva 28-2). EGF-LHN/C:n vaikutus hengitysteiden epiteelisolujen stimuloituun mukiinin vapautumiseen on siis riippumaton käytetyn ärsykkeen tarkasta luonteesta. Histologinen tutkimus osoittaa, että mukiini säilyy käsiteltyjen solujen sisällä (kuva 28-3). Kontrollisoluissa on värjäytynyttä solunsisäistä mukiinia, kun taas stimuloiduissa soluissa värjäytyminen on selvästi vähentynyt, mikä viittaa mukiinin eritykseen. EGF-LHN/C:llä esikäsiteltyjen stimuloitujen solujen solunsisäinen värjäytyminen on säilynyt, mikä osoittaa, että EGF-LHN/C estää eritystä. Sen arvioimiseksi, miten solut reagoivat tällaiseen solunsisäiseen musiinin säilyttämiseen, mitattiin EGF-LHN/C-esikäsittelyn vaikutus MUC5AC-mRNA-tasoihin musiinisynteesin indikaattorina. EGF-LHN/C-esikäsittelyyn liittyy EGF-TNFα:n aiheuttaman MUC5AC-mRNA:n ilmentymisen pitoisuusriippuvainen esto, jonka IC50-arvo on ∼0,1 nM (kuva 28-4). Kuten solujen stimuloidun musiinin vapautumisen estäminen, myös tämä EGF-LHN/C:n vaikutus johtuu sen endopeptidaasiaktiivisuuden kohdennetusta välittämisestä EGF-reseptorin kautta, koska sen enempää LHN/C, josta puuttuu EGF-ligandi sen kohdentamiseksi EGF-reseptoriin, kuin fuusioproteiinin mutaatio, jossa endopeptidaasidomeeni on inaktivoitu kolmella katalyyttisen alueen jäännösmuutoksella (EGF-TE-LHN/C), eivät estä MUC5AC-mRNA:n ilmentymistä. Tämä EGF-LHN/C:n vaikutus MUC5AC-mRNA:n ilmentymiseen viittaa mahdolliseen negatiiviseen takaisinkytkentämekanismiin mukiinin vapautumisen ja mukiinisynteesin välillä hengitysteiden epiteelisoluissa sekä siihen, että geenin ilmentyminen vähenee vasteena rekombinantti-klostridiaalisen endopeptidaasin aiheuttamalle erityksen estolle.

Rekombinantti-klostridien endopeptidaasi-fuusioproteiineilla, jotka voivat estää liman eritystä, kuten EGF-LHN/C:n esimerkkinä, on potentiaalia kehittyä terapeuttisiksi proteiineiksi keuhkoahtaumataudin (COPD), kroonisen keuhkoputkentulehduksen (bronkiitti), kystisen fibroosin ja muiden kroonisten hengitystiesairauksien, joihin liittyy liiallista limantuotantoa, hoitoon. Proteiinin aktiivisuuden pitkäikäisyys tarkoittaisi, että tuotetta tarvitsisi inhaloida vain harvoin, joten se soveltuisi hyvin tämäntyyppisten kroonisten hengityselinsairauksien hoitoon.