Junction Melting

Ensimmäisenä askeleena arvioidaksemme 3SPN.2-mallin soveltuvuutta Holliday-liitoksen termodynaamisten bulkkiominaisuuksien ennustamiseen arvioimme liitoksen sulamisominaisuuksia 3SPN.2-mallin simuloinneista ja vertaamme sitä absorptiokokeisiimme. Simuloimme risteyksen sulamista replica-exchange molecular dynamics (REMD, ks. menetelmät) -menetelmällä parantaaksemme osittain sulaneiden tilojen näytteenottoa. Tarkka näytteenotto koskemattomien, sulaneiden ja osittain sulaneiden liitoskonfiguraatioiden suhteellisesta osuudesta ei ole tällä hetkellä mahdollista käyttämällä koko atomia sisältävää esitystä.

Kuvassa 2 on esitetty yksisäikeisten säikeiden osuus α T:n funktiona suolakonsentraatioiden vaihteluvälillä sekä 3SPN.2-mallissa että absorptiomittauksissa. Katso menetelmistä α:n määritelmä simulaatioissa. Simulaatioiden ja kokeiden välinen samankaltaisuus on silmiinpistävää. Sekä simulaatiot että kokeet osoittavat, että sulamislämpötila nousee suolapitoisuuden kasvaessa ja että siirtymästä tulee yhä jyrkempi eli ”yhteistoiminnallinen”. Dataa voidaan kuvata hyvin massan vaikutuksen lailla eli van’t Hoffin relaatiolla46,

J34-liitoksen sulamisominaisuudet.

Yksisäikeisen säikeen osuuden α vertailu simulaatioista (a) ja kokeista (b). Sovitimme dataan van’t Hoffin yhtälön avulla (yhtälö 1), merkitty yhtenäisillä viivoilla. Konvention mukaisesti määrittelemme TM:n lämpötilaksi, jossa α = 0,5.

jossa K on liitoksen sulamisen tasapainovakio, ΔH ja ΔS ovat sulaneen ja ehjän liitoksen välinen entalpia- ja entropiaero, joiden oletetaan olevan vakioita tällä lämpötila-alueella, ja C on säikeiden kokonaiskonsentraatio (kunkin säikeen konsentraatio on C/4). Huomaa, että ΔS säätelee sulamissiirtymän jyrkkyyttä. Käsittelemme jäljempänä ΔH:n ja ΔS:n käyttäytymistä, jotka on määritetty sovitusdatasta alueella 0,1<α<0,9.

Sulamislämpötila TM on hyödyllinen termodynaaminen metriikka liitoksen stabiilisuudelle, ja se määritellään yleisesti lämpötilaksi, jossa α = 1/2. Kuvassa 3 esitetään kokeelliset ja simuloidut TM-arvot suolapitoisuuden funktiona. Kuten sulamiskäyrien perusteella oli odotettavissa, simulaatiot heijastavat hyvin TM:n kokeellista riippuvuutta. Myös kvantitatiivinen samankaltaisuus on huomattava. Simulointitulokset siirtyvät johdonmukaisesti korkeampaan T:hen 5-8 K:lla, mikä on alle 3 prosentin ero. Sekä kokeissa että simuloinneissa sulamislämpötila on lähes riippumaton suolapitoisuudesta ≥ 200 mM:n kohdalla. Tämä riippumattomuus liittyy sähköstaattisten vuorovaikutusten seulontaan korkeissa suolapitoisuuksissa; vastaavasti kuvassa 3 esitetään myös Debye-seulontapituus, jota käytetään 3SPN.2-mallissa sähköstaattisten vuorovaikutusten Debye-Hückel-approksimaatiossa. Seulontapituus on <6 Å suurilla suolapitoisuuksilla, jolloin sähköstaattinen repulsio on merkityksetöntä. Kokeessa ja simuloinnissa saatujen TM-arvojen vastaavuus validoi sähköstaattisuuden likimääräisen käsittelyn 3SPN.2-mallissa. Kun otetaan huomioon, että 3SPN.2-malli parametrisoitiin vain jäljittelemään dupleksin B-DNA:n sulamista, risteyksen sulamistiedot viittaavat siihen, että 3SPN.2-malli on siirrettävissä monimutkaisempien DNA-rakenteiden termodynamiikkaan. Samalla tämä havainto ei ole täysin odottamaton, koska kummankin haaran sulamisen pitäisi olla hyvin samanlaista kuin tavallisella duplex-DNA:lla.

Suolakonsentraatiosta riippuvainen risteyksen sulamislämpötila TM.

Kaikkien konsentraatioiden kohdalla TM eroaa <3 %:lla välillä 3SPN.2 simulaatioiden (vihreät ympyrät) ja absorptiokokeiden (punaiset timantit) välillä. Viivat on tarkoitettu vain suuntaa antaviksi. Kuvassa näkyy myös Debyen seulontapituus, jota 3SPN.2-malli käyttää Debye-Hückelin approksimaatiossa sähköstaattisille vuorovaikutuksille. Sulamislämpötilan tasanko osuu yhteen sähköstaattisten vuorovaikutusten voimakkaan seulonnan kanssa.

Aineiston sovittaminen van’t Hoffin suhteen avulla (yhtälö 1) antaa arvion sulamisen entalpiasta ja entropiasta. Tästä sovituksesta saadut ΔH:n ja ΔS:n arvot ovat oikeaa suuruusluokkaa, jota voidaan odottaa SantaLucian ja työtovereiden47,48 määrittämien termodynaamisten parametrien perusteella. Kuvan 4 sisäkuvasta nähdään, että simulaatiot yliarvioivat hieman ΔH- ja ΔS-arvoja kokeisiin verrattuna ja että ΔH vaihtelee lähes lineaarisesti ΔS:n kanssa. Tätä lineaarista suhdetta kutsutaan joskus ”kompensaatiosuhteeksi”. Itse asiassa van’t Hoffin yhtälö implikoi tietyn suhteen ΔH:n ja ΔS:n välille

Thermodynamics of junction melting.

Sulamisen entropia ΔS ja entalpia ΔH, jotka on saatu sovittamalla kokeet (punaiset timantit) ja simulaatiot (vihreät ympyrät) van’t Hoffin yhtälöön (yhtälö 1). Sisäkuvassa on likimääräinen lineaarinen entropian ja entalpian kompensaatiosuhde. Sekä kokeelliset että simuloidut tiedot vastaavat paremmin van’t Hoffin yhtälöä, joka on arvioitu TM:ssä (yhtälö 2, sininen viiva).

joka seuraa yhtälöstä 1 asettamalla α = 1/2 TM:ssä. Kuva 4 osoittaa johdonmukaisuuden tämän suhteen kanssa ja selventää, että lineaarinen kompensaatio ΔH:n ja ΔS:n välillä on vain likimääräinen; jos TM-arvot vaihtelisivat merkittävämmin konsentraation mukaan, poikkeamat lineaarisuudesta ΔH:n ja ΔS:n välillä olisivat ilmeisempiä, kun taas yhtälön 2 pitäisi pysyä voimassa. Käytännön kannalta tärkeämpää on se, että nämä tulokset osoittavat 3SPN.2-mallin tehokkuuden 3SPN.2-mallin toistavan liitosten energeettiset ja termodynaamiset ominaisuudet, jotka ovat läheisessä sopusoinnussa kokeellisten tietojen kanssa.

Konformaatioiden runsaudet ja rakenne

Tarkistaaksemme tarkemmin 3SPN.2-mallin kykyä ennustaa kokeellisia liitosominaisuuksia tarkastelemme liitoskonformaatioiden suhteellista populaatiota. Kokeellisesti tiedetään, että avoin tasomuoto on vallitseva matalissa suolapitoisuuksissa, ja korkeammissa suolapitoisuuksissa liitokset omaksuvat pinottuja konformaatioita (kuva 1). Suhteellisen korkeassa konsentraatiossa = 50 mM ja T = 298 K kokeiden mukaan pinottujen isomuotojen I/II suhteellinen runsaus on 23/77 %15. Tässä käytämme 3SPN.2-mallia tutkiaksemme laajaa suolakonsentraatioiden valikoimaa T = 300 K:ssa mallin validoimiseksi ja antaaksemme ennusteen liittymäpopulaatioiden yleisestä suolakonsentraatioriippuvuudesta. Huomattakoon, että tarkastelemme Na+:n eikä Mg2+:n vaikutusta, mikä johtaa samankaltaisiin tuloksiin16,45.

Kuten Thirumalai ja työtoverit korostivat26 , aikakeskiarvon ja ensemble-keskiarvon (ergodisuus) välinen vastaavuus nelisuuntaisten liitosten osalta voi rikkoutua melko suurilla havaintoaikajakaumilla johtuen liitoskonformaatioiden välisen muuntumisnopeuden nopeudesta. Näin ollen pinoutuneiden konformaatioiden suhteellisten populaatioiden arvioimiseksi tarvitaan merkittävä kokonaisuus simulaatioita. Kullekin suolakonsentraatiolle suoritetaan näin ollen 100 riippumatonta simulaatiota, joista jokainen alkaa avoimesta konfiguraatiosta, koska tämä konformaatio muuttuu nopeasti ja satunnaisesti joko iso-I:ksi tai iso-II:ksi. Kutakin simulaatiota ajetaan 2 μs:n ajan, jolloin kunkin suolakonsentraation liikeratatietoja saadaan yhteensä 200 μs, jotka jaetaan 100 riippumattoman näytteen kesken. Näin saadaan alustava arvio kunkin konformaation suhteellisesta populaatiosta. Tämän arvion perusteella ajetaan 100 lisäsimulaatiota käyttäen avoimen, iso-I- tai iso-II-alkukonfiguraatioiden suhdetta, joka vastaa alustavaa populaatioestimaattia, jotta nähdään, ovatko tuloksemme herkkiä sille, että aloitamme avoimesta tilasta. Havaitsemme, että populaatioestimaatit pysyvät vakaina tilastollisen epävarmuutemme rajoissa, joten emme havaitse mitään merkittäviä vaikutuksia, jotka johtuisivat siitä, että aloitamme avoimesta tilasta. Tuloksiimme vaikuttaa, jos käytämme joko kaikkia iso-I- tai kaikkia iso-II-alkukonfiguraatioita, mikä johtuu näiden tilojen suhteellisen hitaasta keskinäisestä muuntumisesta.

Junktion populaatioiden arvioimiseksi meidän on löydettävä metriikka, joka erottaa tarkasti kolme primaarista risteyskonformaatiota toisistaan. Kokeellisesti FRET-tutkimuksissa käytetään yleisesti valittujen varsien päiden välistä etäisyyttä (joka määrittelee dupleksin välisen kulman) konformaatiotilojen erottamiseen. Aluksi tarkastelimme interdupleksikulmaa, mutta havaitsimme (kuten myöhemmin käsitellään), että IDA vaihtelee huomattavasti kussakin isoformissa, mikä vaikeuttaa konformaatioiden yksiselitteistä erottelua. Sen sijaan havaitsimme, että emästen väliset erot lähellä risteyksen ydintä ovat luotettavampi indikaattori risteyksen konformaatiosta. Näihin etäisyyksiin pitäisi päästä käsiksi myös kokeellisesti käyttämällä paria fluoresoivia nukleotidi-emäsanalogeja, kuten 6-metyyli-isoksanthopteriinia (6-MI) tai 2-aminopuriinia, jotka on sijoitettu harkitusti lähelle risteyskeskusta. Kuvan 1 alemmissa paneeleissa on esitetty liitoskohdan ytimessä olevat kahdeksan emästä iso-I- ja iso-II-konformereissa sekä avoimessa muodossa. Iso-I-konformerissa T-emästen välinen etäisyys dTT (säikeissä X ja H) ja C-emästen välinen etäisyys dCC (myös säikeissä X ja H) ovat paljon pienempiä kuin A- ja G-emästen väliset etäisyydet dAG (säikeissä B ja R); iso-II-konformerissa käänteinen pinoutuminen johtaa suhteellisten etäisyyksien päinvastaiseen käyttäytymiseen. Avoimessa muodossa kaikki nämä etäisyydet ovat samankaltaisia, mutta suurempia kuin pinottujen iso-I- ja II-konformerien etäisyydet.

Siten meidän pitäisi pystyä erottamaan iso-I ja II yksinkertaisesti näiden emästen välisten erotusten perusteella. Tämän vahvistamiseksi piirretään kuvassa 5 emästen välisten etäisyyksien P(dTT ∪ dCC) ja P(dAG) normalisoitu taajuusjakauma, joka osoittaa kahden erillisen piikin läsnäolon kaikilla pitoisuuksilla ≥50 mM. P(dAG):n osalta (kuva 5a) piikki pienellä etäisyydellä osoittaa iso-II-konformeritiloja ja piikki suuremmalla etäisyydellä johtuu joko iso-I- tai avoimista konformaatioista. P(dTT ∪ dCC) (kuva 5b) osalta piikki pienillä etäisyyksillä osoittaa iso-I-tiloja ja piikki suuremmilla etäisyyksillä johtuu joko iso-II- tai avoimista konformaatioista. Otamme rajaksi 12 Å:n etäisyyden, joka on jakaumien minimipaikan likimääräinen sijainti, erottaaksemme liitokset joko pinotuksi iso-I- tai iso-II-konformeriksi. Ne konfiguraatiot, joita ei tunnisteta iso-I:ksi eikä II:ksi, luokitellaan avoimiksi konformeiksi. Yhdenmukaisesti sen odotuksen kanssa, että avoin konformaatio dominoi pienellä suolapitoisuudella, kummallakaan jakaumalla ei ole piikkiä pienellä erotuksella, joten lähes kaikki konfiguraatiot pienellä suolapitoisuudella tunnistetaan avoimeksi konformaatioksi.

Kriteeri risteyskonformaatioiden erottamiseksi.

Emästen välisen eron jakautuminen risteyskohdan keskellä (a) AG-emäksille, joissa pieni ero identifioi iso-II-konformerin, ja (b) TT- tai CC-parille, joissa pieni ero identifioi iso-I-konformerin. Pidemmän etäisyyden piikki alhaisella suolapitoisuudella johtuu avoimista konformaatioista; korkeammalla suolapitoisuudella se johtuu pääasiassa komplementaarisesta pinoutuneesta muodosta. Pystysuora katkoviiva osoittaa rajauskriteerin, jota käytämme myöhemmin yksittäisten konfiguraatioiden konformaatiotilojen tunnistamiseen.

Käyttämällä näitä kriteerejä konformaatioiden erottamiseen tunnistamme yksittäiset konfiguraatiot jommallekummalle kolmesta isomeeristä ja näytämme edustavat aikasarjat risteyskonformaatioista viidelle simulaatiolle, kun suolapitoisuus on = 300 mM, kuvassa 6a. Kuvassa 7a esitetään näiden konformerien edustavat konfiguraatiot. Aikasarjatiedot osoittavat kvalitatiivisesti, että avoin konformaatio on erittäin lyhytikäinen ja toimii siirtymätilana pitkäikäisten iso-I- ja iso-II-konformerien välillä. Tämä on aiemmin päätelty yhden molekyylin kokeista8,15,16,50 , ja tässä tutkimuksessa havaitsemme ja vahvistamme nimenomaisesti siirtymämekanismin tasapainokonformerin tilojen välillä. Osoitamme kvantitatiivisesti avoimen konformaation roolin välituotteena arvioimalla yhdeksän siirtymätodennäköisyyttä (mukaan lukien siirtymät samaan konformaatioon) kolmen konformaation välillä. Kuvasta 6b nähdään, että siirtymätodennäköisyydet Iso I→II ja II→I ovat näiden kuvaajien mittakaavassa häviävän pieniä (nolla, laskentamme epävarmuuden rajoissa). Näin ollen ainoa polku pinottujen konformerien välillä kulkee avoimen konformerin kautta, mikä vahvistaa sen siirtymätilaksi. Kuvasta 6c nähdään, miten siirtymätodennäköisyydet pinotun ja avoimen konformaation välillä vaihtelevat suolakonsentraation mukaan, ja siirtymät avoimeen tilaan ovat hallitsevia alhaisilla suolakonsentraatioilla. Kuvassa 6a esitetyt viisi aikasarjaa osoittavat myös, että datan aikakeskiarvo vaihtelee näytteittäin. On selvää, että 2 μs on riittämätön konformaatiorunsauksien ergodiseen näytteenottoon, ja se edellyttää lähestymistapaamme, jossa käytetään simulaatioiden kokonaisuutta. Tämä lähestymistapa on mahdollinen karkearakeisen mallin osalta, mutta se ylittää nykyiset laskentaresurssit koko atomin mallin osalta. Tämä ”rikkinäinen ergodisuus” on samankaltainen kuin kokeellinen havainto, jonka mukaan konformaationäytteenotto ei ole ergodista suurilla aikaskaaloilla26. On kuitenkin varottava huomauttamasta, että tässä tapauksessa rikkinäinen ergodisuus johtuu yksinomaan konformaationaalisen näytteenoton stokastisesta luonteesta, kun taas viitteessä 26 esitetyissä kokeissa myös ionien sitoutumisen vaihteluilla yksittäisiin liittymiin on merkitystä.

Konformaationäytteenoton ja konformaatiomuutostodennäköisyyksien molekyylikohtaiset vaihtelut.

(a) Esimerkkiaikasarja risteyskonformaatioiden konformaatioista viidelle 100:sta ensemblelajin jäsenestä, kun = 300 mM. Avoin isoformi on lyhytikäinen ja toimii siirtymätilana iso-I:n ja iso-II:n välillä. (b) Matriisi siirtymätodennäköisyyksistä tietystä alkutilasta lopputilaan lämpötilassa = 300 mM. Siirtymätodennäköisyyksiä samaan tilaan (diagonaalielementit) ei ole esitetty, koska taipumus pysyä nykyisessä tilassa hallitsee muiden siirtymätodennäköisyyksien asteikkoa49. Huomaa, että siirtymätodennäköisyydet iso I→II (ja päinvastoin) ovat lähes nolla. (c) Neljän keskeisen siirtymätodennäköisyyden suolan konsentraatioriippuvuus.

Yhteenliittymäkonformaatiot, runsaus ja rakenne.

(a) Simulaatioissamme havaitut edustavat konformaatiot; yksinkertaisuuden vuoksi on esitetty vain DNA:n selkäranka. (b) Primääristen isoformien suhteellinen runsaus suolapitoisuuden funktiona. Isomuotojen identiteetit on määritelty emäserotusten perusteella liittymän sisäpuolella, kuten tekstissä on kuvattu. (c) Dupleksien välinen kulma (IDA) kullekin konformaatiolle. Huomaa, että avoin planaarinen konformaatio on vallitseva vain alhaisessa suolapitoisuudessa. Korkeammalla suolapitoisuudella pieni osa näytteeksi otetuista avoimista konformaatioista omaksuu (keskimäärin) tetraedrisen konformaation.

Risteyskonformaatioiden aikasarjadatan perusteella arvioimme suoraan konfiguraatioiden murto-osaa avoimissa, iso-I- tai iso-II-konformaatioissa suolakonsentraation funktiona (kuva 7b). Kuten odotimme, alhaisilla suolapitoisuuksilla (= 10 mM) havaitsemme pääasiassa vain avoimen tasomaisen tilan, jossa on neliönmuotoinen geometria. Kaikissa korkeammissa suolapitoisuuksissa pinottuja konformeja suositaan, keskimäärin ≈58 % iso-II:ssä ja 36 % iso-I:ssä (≥200 mM:lle). Simulaatiomme ennustavat, että melko alhaisia suolapitoisuuksia lukuun ottamatta konformerien suhteellinen osuus ei riipu merkittävästi suolasta. Suurilla suolapitoisuuksilla pinottujen konformaatioiden hallitsevuuden voidaan odottaa johtuvan sähköstaattisten vuorovaikutusten voimakkaasta seulonnasta, joka on samanlainen kuin sulamislämpötilan riippuvuus suolapitoisuudesta. Tämä seulonta ei kuitenkaan selitä vinoutumista pinottuun iso-II-konformaatioon. Ero isomeeripopulaatiossa täytyy johtua emäsjärjestyksen vaikutuksista lähellä liitosydintä, kuten kokeellisesti havaittiin16,17. Se, että malli toistaa kokeellisesti tunnetun vinoutuman kohti iso-II:tä, osoittaa, kuinka hyvin karkearakeinen malli pystyy kuvaamaan sekvenssistä riippuvan rakenteen. Löysimme myös pienen osan, 6 %, liitoskonfiguraatioista avoimessa tilassa korkealla suolapitoisuudella. Kuten edellä todettiin, nämä konformaatiot ovat lyhytikäisiä ja helpottavat muunnoksia pinottujen konformaatioiden välillä. Verrattuna Ha:n ja työtovereiden15 kokeisiin suhteellisen korkeilla suolapitoisuuksilla 3SPN.2-malli aliarvioi iso-II:n suuntautumisen noin 15 prosentilla. Ero voi johtua osittain eroavaisuudesta kokeellisissa ja laskennallisissa kriteereissä, joita käytetään isoformien määrittelyyn; erityisesti me tutkimme emästen erotusta liitoksen sisäpuolella, kun taas FRET-kokeissa käytetään leimoja, jotka ovat herkkiä liitoksen R- ja X-varsien päiden erottumiselle toisistaan (käytännössä IDA). H:n kaltaisten konformaatioiden, joissa on avoin risteyskeskus (kokeellisesti havaittu endonukleaasien läsnäollessa12 ), osalta nämä vaihtoehtoiset lähestymistavat eroaisivat systemaattisesti luokittelussaan: (i) liitoksen päiden perusteella H-konformaatiot luokiteltaisiin iso-I:ksi tai II:ksi; (ii) päinvastoin, liitoksen ytimessä tapahtuvan erottelun perusteella H-konformaatiot luokiteltaisiin avoimiksi, joten kriteerimme tuottavat aina pienemmän pinotun fraktion.

Koska kriteerimme mahdollistavat yksittäisten liitoskonfiguraatioiden konformaatioiden luokittelun, pystymme myös arvioimaan suoraan kunkin konformaation keskimääräistä rakennetta. Luonnehdimme risteymärakennetta interdupleksikulmalla (IDA), jonka määrittelemme kulmalla, jonka XR- ja RH-varret muodostavat risteyksen kärkeen nähden51. Näin ollen iso-II:n IDA:n pitäisi olla huomattavasti pienempi kuin iso-I:n. Kuva 7c vahvistaa tämän odotuksen, sillä iso-II:n IDA lähestyy 90° korkealla suolapitoisuudella ja iso-I:n IDA on lähellä 140°. Iso-II:n 90°:n arvo on suuri verrattuna kokeellisiin arvioihin, jotka ovat 40-60°:n luokkaa tasapaino-FRET-mittausten perusteella41,44,45, mihin palaamme vielä. On myös tehtävä selväksi, että iso-II:n 90° ei tarkoita tasokokoonpanoa, mikä näkyy visuaalisesti kuvassa 7a esitetyissä edustavissa konfiguraatioissa; kolmiulotteisen rakenteen vuoksi jopa pinottu rakenne voi omaksua kulman, joka on lähellä 90°. Pienimmillä suolapitoisuuksilla emme voi arvioida pinottujen konformaatioiden kulmaa, koska niistä ei ole otettu näytteitä. Kun lämpötila on = 10 mM, avoimen liitoksen IDA on 95°, mikä vastaa lähes tasaista liitosta, mikä on myös visuaalisesti nähtävissä kuvassa 7a. Suuremmilla suolapitoisuuksilla pieni osa avoimista konfiguraatioista omaksuu hieman suuremman kulman ≈105°. Tämä suurempi kulma on yhdenmukainen lähes tetraedrisen konfiguraation kanssa (kuva 7a), jota olisi ehkä pidettävä erillisenä tasomaisesta avoimesta konfiguraatiosta alhaisilla suolapitoisuuksilla. Tuloksemme viittaavat siis siihen, että pinottujen konformaatioiden väliset siirtymätilat ovat pääasiassa avoimia tetraedrisiä konformaatioita eikä tasomaisia. Tällaisia tetraedrisiä välitiloja on havaittu aiemmin simulaatioissa23. Itse asiassa yhden molekyylin datan analyysin perusteella on päätelty, että on mahdollista, että on olemassa useita liitoskonformaatioita26.

Junction Structure Comparisons

Viimeisenä vertailukohtana tarkastelemme, miten 3SPN.2-mallilla arvioitu IDA on verrannollinen kokeellisiin mittauksiin ja siihen, joka on arvioitu AMBER-simulaatiossamme, jossa kaikki atomit ovat mukana. FRET-mittauksissa on arvioitu, että iso-II:n IDA on 43 ± 8° lämpötilassa T = 283 K ja suolapitoisuudessa = 200 mM45. Näin ollen simuloimme sekä AMBER- että 3SPN.2-mallia yhteensopivissa olosuhteissa alkaen iso-II:n alkukonfiguraatiosta, jonka IDA on 43° (ks. kuva 1b). Sekä 3SPN.2- että AMBER-malleissa liitos avautuu suuremmalle IDA:lle ja asettuu vakaaseen arvoon ≈50 ns:n kuluttua (sisäkuva 8). Kuvan 8 pääpaneelissa on esitetty IDA-arvot, jotka kukin malli otti näytteeksi vakaassa tilassa. 3SPN.2-mallissa IDA:n vaihtelu on laajempaa kuin AMBER-mallissa, vaikka IDA:n keskiarvo on molemmissa malleissa samanlainen. Kvantitatiivisesti AMBER-mallissa IDA:n keskiarvo on 85,3° ja keskihajonta 12,3°; 3SPN.2, keskimääräinen IDA on 95,7° ja keskihajonta 24,1°.

Yhteysrakenteiden vertailu kaikki atomit sisältävien ja karkearakeisten mallien välillä.

Kaikki atomit sisältävälle AMBER-mallille (mustalla värillä) ja mallille, jossa on käytetty kolmiulotteisia malleja, ja mallille, jossa on käytetty kolmiulotteisia malleja (mustalla värillä) ja mallille, jossa on käytetty kolmiulotteisia malleja.2. karkearakeisen mallin (punainen) välillä T= 283 K ja = 200 mM. Pääpaneelissa on näytteeksi otettujen IDA-arvojen jakauma; yhtenäiset viivat ovat laskettu frekvenssi ja katkoviivat ovat normaalijakauma, jolla on sama keskiarvo ja keskihajonta kuin datalla. Sisäkuvassa on kunkin mallin alkuperäinen aikasarja, josta jakaumat on määritetty. Huomaa, että 3SPN.2-mallin osalta meillä on 2 μs dataa, jota kaikkia ei ole esitetty insertissä.

Simulaatiot osoittavat molemmissa huomattavasti suurempaa IDA:ta kuin FRET-mittausten ja kiteytystutkimusten perusteella odotettiin45,52. Tämä saattaa viitata siihen, että kumpikaan malli ei anna tarkkaa arviota IDA:sta tai että FRET-datasta IDA:n arvioimiseksi tehtävät approksimaatiot aliarvioivat IDA:n. On selvää, että irtotavarana tehdyissä FRET-kokeissa ulkoisten väriaineiden, niihin liittyvien linkkereiden ja niiden suhteellisen orientaation läsnäolo voi aiheuttaa huomattavia virheitä etäisyyden määrittämiseen. Erot nykyisten IDA-määritysten ja kiteellä mitattujen IDA-määritysten välillä voivat ehkä johtua joistakin kideristikon asettamista rajoituksista. Kun verrataan kokoatomi- ja karkearakeisia malleja, standardipoikkeaman lähes kaksinkertaistuminen osoittaa selvästi, että liitosvarret ovat joustavampia karkearakeisessa mallissa. Tämä saattaa osittain johtua eksplisiittisen liuottimen puuttumisesta, sillä kaikki atomit sisältävässä esityksessä liukeneva vesi estää väistämättä liitosvarsien joustavuuden.