Types of hemocytes in crickets

Kuvassa 1A on esitetty differentiaalinen interferenssikontrasti (DIC) -mikroskopiakuva sirkan hemosyyteistä, jossa näkyy erikokoisia ja -muotoisia soluja. Näiden hemosyyttien tarkkaa tunnistamista varten noin 1000 solua luokiteltiin niiden koon ja morfologian perusteella (tietoja ei ole esitetty) kuuteen eri tyyppiin (kuva 1B~G). Kuten kuvassa 1B on esitetty, hemolymfassa havaittiin tyypillinen granulosyytti. Granulosyytit olivat yleensä muodoltaan pyöreitä tai soikeita, ja sytoplasmassa havaittiin monia polymorfisia rakkuloita. Granulosyyttien plasmakalvolla havaittiin pieniä pseudopodioita tai filopodioita (kuva 1B, merkitty valkoisilla nuolilla). Kuvassa 1C esitettyä solua pidettiin plasmatosyyttinä niiden tyypillisen karamaisen muodon ja plasmakalvon molemmissa päissä havaittujen pitkien, karvamaisten rakenteiden vuoksi (merkitty valkoisilla nuolilla). Kuvassa 1D on prohemosyytti, jotka ovat hyönteisten hemolymfassa havaittuja pienimpiä pyöreitä soluja. Tumat olivat solun kokoon nähden suuria ja sijaitsivat solun keskellä (kuva 1D). Näin ollen prohemosyyttien sytoplasma ja tuma olivat usein erottamattomia. Kuvassa 1E on esitetty koagulosyytti, joka sisältää erilaisia sytoplasman granuloita. Koagulosyyttien plasmakalvot olivat sileitä, ilman mitään rakenteita, ja niiden tumat olivat suuria ja helposti havaittavissa. Oenosyytit olivat suurin havaittu hemosyyttityyppi, ja niitä oli hemolymfassa niukasti (kuva 1F). Oenosytoidit olivat yleensä pyöreän paistetun munan muotoisia, ja niissä oli lukuisia sytoplasmallisia rakkuloita. Kuvassa 1G on sferulosyytti, joka oli pyöreä ja keskikokoinen ja jonka sytoplasmassa oli monia pieniä tummia tai kiiltäviä rakkuloita. Kuten kuvasta 1D~G käy ilmi, prohemosyyttien, koagulosyyttien, eenosyyttien tai sferulosyyttien plasmakalvoilla ei näkynyt mitään rakenteita, sillä ne olivat optisesti hyvin sileitä.

Sirkkojen veressä havaitut kuusi hemosyyttityyppiä. Hemosyyttien yleinen muoto ja suhteellinen koko hemolymfassa (A). G. bimaculatusissa havaitut kuusi hemosyyttityyppiä luokiteltiin koon ja morfologian perusteella granulosyyteiksi (B ; GR), plasmatosyyteiksi (C ; PL), prohemosyyteiksi (D ; PR), koagulosyyteiksi (E ; CO), eenosytoideiksi (F ; OE) ja pallosyyteiksi (G ; AD). Granulosyyttien ja plasmatosyyttien plasmakalvolla olevat viuhkamaiset tai ameebamaiset rakenteet on merkitty valkoisilla nuolilla (B ja C). Mittakaavapalkki = 25 µm (A) tai 10 µm (B~G).

Nodulaatio ja kapselointi hemosyyttien toimesta

Hyönteisten soluvälitteiset immuunivasteet, kuten nodulaatio, kapselointi ja fagosytoosi, suoritetaan immuunipuolen hemosyyttien, kuten granulosyyttien ja plasmatosyyttien, avulla. Patogeenialtistuksen jälkeen nämä hemosyytit muuttavat muotoaan ja kehittävät plasmakalvoihinsa suuria ameebamaisia tai viuhkamaisia rakenteita. Näiden nopeiden morfologisten muutosten havainnoimiseksi reaaliajassa kehitimme tekniikan, jonka avulla hyönteisten hemosyyttejä voidaan viljellä 7 päivän ajan siten, että fysiologinen aktiivisuus säilyy (kuvattu Materiaalit ja menetelmät -osassa). Vaikka emme pystyneet luomaan vakaita hemosyyttilinjoja, joita voidaan passageerata useita vuosia, pystyimme tarkkailemaan hemosyyttien morfologiaa vasteena patogeeneille in vitro. Täydentävässä elokuvassa C näkyvät vain hemosyytit 12 tunnin inkubaation jälkeen. Suurin osa viljellyistä soluista liikkui aktiivisesti. Joillakin soluilla oli solukalvon ympärillä verkkoja viljelyn aikana, ja niiden havaittiin olevan kiinnittyneinä viljelylautasiin. Hemosyytit harvoin aggregoituivat tai muodostivat suuria klustereita.

Kuvassa 2A on E. coli -bakteerilla viljeltyjä hemosyyttejä (ks. myös Supplementary Movie 1). Joidenkin hemosyyttien havaittiin olevan enemmän aggregoituneita ja liikkuvia. Inkubaatioajan pidentyessä tietyt hemosyytit tuottivat verkkoja (ameebamaisia karvoja tai solunulkoisia ansoja), ja eri hemosyytit kerääntyivät yhteen näiden verkkojen avulla muodostaen suuria klustereita (Kuva 2A-1~A-6; ameebamaiset karvat tai solunulkoiset ansat merkitty mustilla nuolilla). Kuten kuvassa 2A-1 on esitetty, verkot vetivät lopulta kolme hemosyyttiryhmää (merkitty mustilla ympyröillä) yhdeksi klusteriksi (kuvat 2A-5 ja A-6).

Liivisolukuvia sirkan hemosyyteistä, jotka oli infektoitu E. coli -bakteerilla tai Sephadex-helmillä. (A) Valomikroskooppikuvat E. coli -bakteerilla viljellyistä hemosyyteistä. Inkubaatioajan pidentyessä tietyt hemosyytit tuottivat verkkoja (ameebamaisia karvoja tai solunulkoisia ansoja; merkitty mustilla nuolilla). Kaikki kuusi hemosyyttityyppiä aggregoituivat suuriksi klustereiksi näiden verkkojen avulla (A-1~A-6; merkitty mustilla laatikoilla). Elokuva saatavana elokuvana 1 (aika minuutteina inokulaation jälkeen). (B) Valomikroskooppikuvat, joissa näkyy Sephadex-helmien kanssa viljeltyjä hemosyyttejä. Hemosyyttien ympärillä olevat Sephadex-helmet merkittiin satunnaisesti SP1, SP2, SP3, SP4 ja SP5. Ajan myötä Sephadex-helmet (SP1, SP2, SP3 ja SP4) joutuivat hemosyyttien ympäröimiksi ja erilaisten verkkojen kapseloimiksi (B-1~B-9; merkitty mustilla nuolilla). Elokuva saatavana elokuvana 2 (aika minuutteina inokulaation jälkeen). Mittakaavapalkki = 25 µm (A ja B). Elokuvassa C nähdään hemosyytit viljeltyinä yksinään, ilman Sephadex-helmiä. Useimmat hemosyytit liikkuivat aktiivisesti. Muutamat solut olivat kiinnittyneet viljelylautasiin plasmakalvoverkoilla. Suuria hemosyyttien klustereita ei kuitenkaan havaittu.

Ei kuitenkaan voitu määrittää, oliko edellä kuvattu hemosyyttien kerääntyminen E. colin käynnistämä. Tämän kysymyksen ratkaisemiseksi hemosyytit aktivoitiin Sephadex-helmillä (halkaisija 120 μm), jotka voidaan helposti havaita DIC-mikroskoopilla (kuva 2B, Supplementary Movie 2). Kuten kuvassa 2A on esitetty, Sephadex-helmet tarttuivat tiettyjen hemosyyttien muodostamiin verkkoihin (kuva 2B; verkot merkitty mustilla nuolilla keltaisissa laatikoissa). Hemosyyttien ympärillä olevat Sephadex-helmet merkittiin satunnaisesti SP1, SP2, SP3, SP4 ja SP5. Kuten voidaan nähdä vertaamalla kuvia 2B-2 ja B-3, SP1, SP2 ja SP3 vedettiin yhteen ja keltaisen laatikon osoittamalle alueelle. Lisäksi SP1 jäi lopulta kokonaan erilaisten hemosyyttien ympäröimäksi (kuva 2B-9). Myös SP4:llä merkitty helmi liittyi SP1:n, SP2:n ja SP3:n kanssa klusteriin (kuvat 2B-4~B-9; merkitty keltaisella laatikolla). Ajan myötä kaikki Sephadex-helmet (SP1, SP2, SP3 ja SP4) joutuivat monien hemosyyttien ympäröimiksi. Sitä vastoin yksittäisten hemosyyttien havaittiin olevan kosketuksissa SP5:n kanssa, mutta se ei vetäytynyt keltaisella laatikolla osoitetulle alueelle, vaikka se oli samanlaisessa asennossa kuin SP1. Näin ollen hemosyyttien suorittama nodulaatio näytti tapahtuvan satunnaisesti.

Granulosyyttien aktivoituminen karboksylaattimodifioiduilla polystyreenilateksin helmillä

Jatkossa tutkittiin, mitkä hemosyytit tuottivat verkot ja osallistuivat immuunivasteen eri vaiheisiin, mukaan lukien kapseloituminen ja nodulaatio. Tätä varten käytettiin patogeenien sijasta karboksylaattimodifioituja polystyreenilateksihelmiä, jotka voidaan helposti havaita DIC-mikroskoopilla, ja kerättiin reaaliaikaisia kuvia hemosyyteistä. Kuvassa 3A on hemosyyttejä, joita stimuloitiin karboksylaattimodifioiduilla polystyreenilateksihelmillä 12 tunnin ajan (Supplementary Movie 3). Hemosyyttien tuottamat verkot (merkitty mustilla nuolilla) liikkuivat aktiivisesti lateksihelmien (merkitty punaisilla nuolilla) ympärillä (kuva 3A-1). Ajan mittaan verkot nielaisivat helmet ja lopulta ne näkyivät hemosyyttien sytoplasmassa (Kuva 3A-2~A-4). Jokainen verkkoon törmännyt karboksylaattimodifioitu polystyreenilateksin helmi ei kuitenkaan fagosytoitunut. Näin ollen aktivoituneiden hemosyyttien liike ei näyttänyt täsmälleen vastaavan helmien liikettä.

Liivisolukuvat granulosyyteistä, joita oli stimuloitu karboksylaattimodifioiduilla polystyreenilateksin helmillä. (A) Valomikroskooppikuvat hemosyyteistä, joita on viljelty karboksylaattimodifioiduilla polystyreenilateksihelmillä 12 h. A-1~A-4, viljellyt hemosyytit 12~18 minuutin kuluttua. Hemosyyttien tuottamien verkkojen (mustat nuolet) nähtiin muodostuvan lateksihelmien ympärille (merkitty punaisilla nuolilla). Verkot imivät lateksihelmet sisäänsä ja lopulta ne jäivät kiinni hemosyyttien sytoplasmaan (A-4). Elokuva saatavana elokuvana 3 (aika minuutteina stimulaation jälkeen). Mittakaavapalkki = 40 µm. (B) Suurennetut kuvat. (B-1) 4 tunnin kuluttua monet karboksylaattimodifioidut polystyreenilateksihelmet olivat tarttuneet hemosyytteihin (lateksihelmet, punaiset nuolet; ja spesifiset hemosyytit, valkoiset ympyrät). (B-2~B-6) Viljellyt granulosyytit 0, 2, 4, 12 ja 48 tuntia stimulaation jälkeen. (B-2) Levossa olevat granulosyytit, jotka ovat muodoltaan pyöreitä tai soikeita. (B-3) 2 tuntia stimulaation jälkeen granulosyyteissä alkoi näkyä morfologisia muutoksia, ja viuhkamaiset tai ameebamaiset plasmakalvorakenteet (valkoiset nuolet) ovat nähtävissä. (B-4 ja -5) Granulosyyttien sytoplasmaan oli kertynyt suuri määrä lateksihelmiä 4 ja 12 tuntia infektion jälkeen. (B-6) 48 h infektion jälkeen monet lateksihelmet olivat kertyneet granulosyyttien sytoplasmaan, mutta verkkoja ei enää havaittu, ja monet granulosyytit näyttivät olevan inerttejä. Mittakaavapalkki = 15 µm (B-1) tai 10 µm (B-2~B-6).

Yksityiskohtaiset havainnot tehtiin suurennetulla konfokaalimikroskoopilla (kuva 3B). Karboksylaattimodifioidut polystyreenilateksihelmet voitiin havaita 4 h infektion jälkeen tiettyjen hemosyyttien sisällä (Kuva 3B-1; helmet merkitty punaisilla nuolilla ja tietyt hemosyytit merkitty valkoisilla ympyröillä). Seuraavaksi havainnoimme tarkemmin, mitkä tietyt solut nielaisivat lateksihelmiä (kuvat 3B-2~B-6). Kuvassa 3B-2 näkyvät lepotilassa olevat granulosyytit, jotka olivat yleensä pyöreitä tai soikeita ja joiden sytoplasmassa oli paljon polymorfisia tummia granuloita. Kahdessa tunnissa karboksylaattimodifioiduilla polystyreenilateksihelmillä tapahtuneen stimulaation jälkeen granulosyyteissä alkoi näkyä morfologisia muutoksia, kuten viuhkamaisia tai ameebamaisia plasmakalvon ulokkeita (kuva 3B-3; merkitty valkoisilla nuolilla). Karboksylaattimodifioidut polystyreenilateksihelmet havaittiin granulosyyttien sytoplasmassa 4 tuntia stimulaation jälkeen, ja suuri määrä lateksihelmiä oli kertynyt monien granulosyyttien sytoplasmaan 12 tuntia stimulaation jälkeen (kuvat 3B-4 ja B-5; helmet merkitty punaisilla nuolilla ja verkot valkoisilla nuolilla). Lisäksi havaittiin, että verkot kasvoivat ja levenivät ajan myötä (kuvat 3B-4 ja B-5). Kun 48 tuntia stimulaation jälkeen oli kulunut 48 tuntia, monet lateksihelmet olivat kerääntyneet granulosyyttien sytoplasmaan, mutta verkkoja ei enää näkynyt, ja monet granulosyytit näyttivät olevan inerttejä (kuva 3B-6; punaisilla nuolilla merkittyjä helmiä).

Kuten kuvasta 2 käy ilmi, granulosyytit näyttivät kiinnittyvän paitsi toisiin granulosyytteihin myös erityyppisiin hemosyytteihin näiden verkkojen avulla. Emme havainneet fagosytoosia missään muussa solutyypissä lukuun ottamatta pientä määrää plasmatosyyttejä (tietoja ei ole esitetty). Emme myöskään havainneet immunologista aktiivisuutta tai morfologisia muutoksia missään muussa solutyypissä kuin granulosyyteissä ja pienessä määrässä plasmatosyyttejä.

Granulosyyttien lysosomit aktivoituivat injektoimalla E. coli-partikkeleita

Tutkittaessa, olivatko granulosyyttien sisällä havaitut vacuolit patogeeniin liittyviä fagosomeja, sirkkoihin ruiskutettiin E. coli -partikkeleita, joita käytetään pääasiassa fagosytoosin merkkiaineina ja jotka fluoresoivat vihreinä, kun ne saavuttavat happamoituneita organelleja, kuten solunsisäisiä lysosomeja. Samanaikaisesti hemosyyttien kokonaismäärät värjättiin LysoTracker Redillä, joka merkitsee lysosomeja. Kuten kuvassa 4A-1 on esitetty, granulosyyttien sytoplasmassa havaittiin vihreää fluoresoivaa signaalia (fagosytoituja E. coli -hiukkasia) välittömästi hiukkasten injektion jälkeen. Samalla havaittiin myös punainen fluoresoiva signaali, joka osoittaa aktivoitunutta lysosomien muodostumista (kuva 4A-2). Neljä tuntia injektion jälkeen monissa granulosyyteissä oli nähtävissä erittäin polymorfisia vakuoleja (kuvat 4A-4 ja A-5). Vihreän fluoresoivan signaalin (fagosytoituneet E. coli -hiukkaset) ja punaisen fluoresoivan signaalin (aktivoituneet lysosomit) yhdistelmäkuvat on esitetty (Kuva 4A-6). 12 tuntia injektion jälkeen vihreä fluoresoiva signaali alkoi himmentyä, kun taas punainen fluoresoiva signaali säilyi (kuvat 4A-7~A-9). 24 tuntia injektion jälkeen molemmat fluoresenssisignaalit olivat himmenneet (kuvat 4A-10~A-12). Granulosyyttien punainen fluoresoiva signaali havaittiin kuitenkin uudelleen 48 tuntia injektion jälkeen (Kuva 4A-13~A-15). Kuvassa 4Aa~Ao esitetään taulujen A-1~A-15 insertit (merkitty valkoisilla laatikoilla) suuremmalla suurennoksella. Sirkat, jotka injektoitiin pelkällä PBS-puskurilla, olivat negatiivisia punaisen ja vihreän fluoresenssin suhteen kaikissa injektion jälkeisissä aikapisteissä (kuva 4B).

Green fluoresoivilla E. coli -partikkeleilla injektoitujen sirkkojen granulosyyttien lysosomien LysoTracker Red -merkintä. (A) Granulosyyttien lysosomien kehitys 0 h, 4 h, 12 h, 24 h ja 48 h E. coli -hiukkasten injektion jälkeen. (A-1, A-4, A-7, A-10 ja A-13) E. coli -partikkelit, joita käytetään fagosytoosin merkkiaineina, fluoresoivat vihreinä, kun ne saavuttavat happamoituneita organelleja, kuten solunsisäisiä lysosomeja. (A-2, A-5, A-8, A-11 ja A-14) Konfokaaliset fluoresenssimikroskooppikuvat granulosyyteistä, jotka on värjätty LysoTracker Redillä (lysosomaalinen merkkiaine). (A-1 ja A-2) Vihreitä ja punaisia fluoresoivia signaaleja voitiin havaita granulosyyttien sytoplasmassa alkaen 1 h injektion jälkeen. (A-4 ja A-5) Monissa granulosyyteissä näkyi vihreää ja punaista fluoresenssia granulosyyttien erittäin polymorfisissa vakuoleissa 4 h injektion jälkeen. (A-7 ja -8) 12 tuntia injektion jälkeen vihreä fluoresoiva signaali oli himmentynyt, mutta punainen fluoresoiva signaali oli edelleen jäljellä. (A-10 ja A-11) 24 tuntia injektion jälkeen vihreä ja punainen fluoresoiva signaali olivat molemmat lähes hävinneet. (A-13 ja A-14) 48 tuntia injektion jälkeen vihreä fluoresoiva signaali oli hävinnyt kokonaan, mutta punainen fluoresoiva signaali havaittiin jälleen. Vihreän ja punaisen fluoresenssisignaalin yhdistetyt kuvat on esitetty (A-3, A-6, A-9, A-12 ja A-15). (a~o) Paneelien A-1 ~A-15 insertit (merkitty valkoisilla laatikoilla) suuremmalla suurennoksella. (B) Punaista fluoresoivaa signaalia granulosyyteissä, jotka ovat peräisin sirkoista, jotka on injektoitu PBS:llä (negatiivinen kontrolli). (C) Virtaussytometrinen analyysi 1 h ~ 48 h injektion jälkeen. (C-1 ja C-2) Vihreä fluoresoiva signaali oli 2,08 % 1 h injektion jälkeen ja kasvoi 24,6 %:iin 4 h injektion jälkeen. (C-3~C-5) Vihreä fluoresoiva signaali väheni asteittain: 10,87 % 12 h:ssa, 3,98 % 24 h:ssa ja 1,74 % 48 h:ssa. (C-1-1~C-4-1) Punainen fluoresoiva signaali kasvoi 69,54 %:iin 12 h:ssa injektion jälkeen ja laski 5,78 %:iin 24 h:ssa injektion jälkeen. (C-5-1) Punainen fluoresoiva signaali kasvoi jälleen 30,25 prosenttiin 48 tuntia injektion jälkeen. (C-1-2~C-5-2) Punainen fluoresoiva signaali granulosyyteissä, jotka on saatu sirkoista, jotka on injektoitu pelkällä PBS-puskurilla. (D) Virtaussytometria-analyysit toistettiin kolme kertaa.

Vihreän ja punaisen fluoresenssisignaalin kvantifioimiseksi PBS:llä tai E. coli:lla injektoiduissa sirkoissa hemosyytit analysoitiin virtaussytometrialla 0~48 h injektion jälkeen (kuva 4C). 0 tuntia injektion jälkeen 2,08 % hemosyyteistä oli positiivisia vihreän fluoresenssin suhteen, ja tämä kasvoi 24,36 %:iin 4 tuntia injektion jälkeen (kuvat 4C-1 ja C-2). Vihreä fluoresoiva signaali väheni vähitellen 10,87 prosenttiin hemosyyteistä 12 tunnin kohdalla, 3,98 prosenttiin 24 tunnin kohdalla ja 1,74 prosenttiin 48 tunnin kohdalla (kuvat 4C-3~C-5). Nämä tulokset osoittavat, että granulosyytit nielivät ja pilkkosivat aktiivisesti E. coli -hiukkasia ja että ne olivat täysin puhdistuneet 48 tuntia injektion jälkeen. 12 tuntia injektion jälkeen 69,54 % oli positiivisia punaisen fluoresenssin suhteen, ja signaali väheni 5,78 %:iin hemosyyteistä 24 tuntia injektion jälkeen (kuva 4C-1-1~C-4-1). Mikroskooppisten havaintojemme mukaisesti punainen fluoresenssisignaali kasvoi 30,25 prosenttiin hemosyyteistä 48 tuntia injektion jälkeen. Sitä vastoin sirkat, jotka injektoitiin PBS:llä, olivat negatiivisia vihreän ja punaisen fluoresenssin suhteen kaikissa aikapisteissä (Kuva 4C-1-2~C-5-2). Virtaussytometria-analyysi toistettiin kolme kertaa (Kuva 4D).

Granulosyyttien lysosomien uudelleenaktivoituminen 48 tuntia injektion jälkeen

Granulosyyttien lysosomien uudelleenaktivoitumista 48 tuntia injektion jälkeen tutkittiin edelleen mikroskooppisella havainnoinnilla (Kuva 5A ja B). Kuten kuvassa 4A on esitetty, vihreä fluoresoiva signaali (fagosytoituneet E. coli -hiukkaset) ja punainen fluoresoiva signaali (aktivoituneet lysosomit) näkyivät 4 h injektion jälkeen (kuvat 5A-1~A-3). Fluoresenssisignaalit olivat himmenneet 24 tuntia injektion jälkeen (kuvat 5A-4~A-6). Havaittiin, että 24 tuntia infektion jälkeen granulosyyttien sytoplasmassa näkyi soluja (kuva 5A-4~A-6; merkitty valkoisilla nuolilla). Tämä ilmiö oli selvempi 48 tuntia infektion jälkeen (kuva 5A-7~A-9; merkitty valkoisilla nuolilla). Lisäksi lysosomit näiden nielaistujen solujen ympärillä 48 tuntia infektion jälkeen olivat aktivoituneet (Kuva 5A-8). Kuten kuvissa 4A-14, 4C-5-1 on esitetty, nämä mikroskooppiset havainnot näyttävät selittävän punaisen fluoresoivan signaalin lisääntymisen 48 tuntia infektion jälkeen. Tämän vahvistamiseksi granulosyyttien tumat värjättiin 4′,6-diamidino-2-fenylindolilla (DAPI) 48 tuntia infektion jälkeen. Kuten kuvasta 5B-1 käy ilmi, granulosyyttejä, joilla oli kaksi ydintä, havaittiin usein. Toisinaan havaittiin myös granulosyyttejä, joissa oli enemmän kuin kaksi ydintä, tai epämuodostuneita tumia (Kuva 5B-2 ja B-3; merkitty valkoisilla nuolilla).

Granulosyyttien lysosomien uudelleenaktivoituminen 48 h injektion jälkeen. (A) Fluoresenssimikroskooppikuvat granulosyyteistä 4 h, 24 h ja 48 h injektion jälkeen. (A-1 ja A-2) Granulosyyteissä näkyi vihreitä ja punaisia fluoresoivia signaaleja erittäin polymorfisissa vakuoleissa 4 h injektion jälkeen. (A-4 ja A-5) 12 tuntia injektion jälkeen vihreä fluoresoiva signaali oli himmentynyt, mutta punainen fluoresoiva signaali säilyi. Lisäksi granulosyyttien sytoplasmassa havaittiin joitakin soluja (valkoiset nuolet). (A-7 ja A-8) Tätä ilmiötä havaittiin useammin 48 tuntia injektion jälkeen. Lisäksi näitä sulautuneita soluja ympäröivät lysosomit olivat aktivoituneet (A-8). Vihreän ja punaisen fluoresenssisignaalin yhdistetyt kuvat on esitetty (A-3, A-6 ja A-9). (B) DAPI:llä värjätyt granulosyytit 48 tuntia injektion jälkeen. (B-1) Granulosyyttien sytoplasmassa havaittiin kaksi ydintä. (B-2 ja B-3) Granulosyyttien sytoplasmassa havaittiin toisinaan kaksi tai useampia tumia tai epämuodostuneita tumia (merkitty valkoisilla nuolilla). Mittakaavapalkki = 10 µm (A) tai 20 µm (B).

Nekroosiin liittyvä granulosyyttisolukuolema 48 h infektion jälkeen

Kuten kuvista 3B-6 ja 5A-8 käy ilmi, fagosomien kertyminen granulosyytteihin muutti niiden muotoa ja aiheutti solukuoleman. Hemosyytit värjättiin 48 h infektion jälkeen fluoreseiini-isotiosyanaatilla (FITC) konjugoidulla annexin V:llä ja propidiumjodidilla (PI) apoptoottisen tai nekroottisen solukuoleman vahvistamiseksi (kuva 6A). Vihreä fluoresoiva signaali (annexiini V) lisääntyi vain hieman 12 tunnin ja 48 tunnin välillä (kuvat A-10, A-7 ja A-10), mutta punainen fluoresoiva signaali (PI) osoitti voimakasta värjäytymistä 12 tuntia infektion jälkeen (kuvat 6A-5). Punainen fluoresoiva signaali säilyi 24 ja 48 tuntia infektion jälkeen (kuvat 6A-8 ja A-11). Punaisen fluoresenssisignaalin (PI) ja DIC-kuvien yhdistetyt kuvat esitetään (kuvat 6A-3, A-6, A-9 ja A-12). Kuvassa 6Aa~Ad esitetään paneeleissa A-3, A-6, A-9 ja A-12 olevat laatikoilla merkityt insertit suuremmalla suurennoksella. Nämä tulokset osoittavat, että fagosomien kertyminen granulosyytteihin ei aiheuttanut tyypillistä apoptoottista solukuolemaa vaan nekroosiin liittyvää solukuolemaa. PI-värjäytymisen kvantifioimiseksi hemosyytit värjättiin ja tutkittiin virtaussytometrialla 0 h, 12 h, 24 h ja 48 h infektion jälkeen. 12 h infektion jälkeen 71,29 % granulosyyteistä oli PI-värjäytyneitä verrattuna 13,52 %:iin 0 h:n kohdalla (kuvat 6B-1 ja B-2). Infektion jälkeen 24 tunnin kuluttua PI-värjäytyminen oli vähentynyt hieman, 45,97 prosenttiin, mutta lisääntyi jälleen 76,24 prosenttiin 48 tunnin kuluttua (kuvat 6B-3 ja B-4). Virtaussytometrinen analyysi toistettiin kolme kertaa (kuva 6C).