Tulokset

Kliinisten näytteiden analyysi.

Syyskuussa 2006 influenssavirus A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) eristettiin useista 5-6 viikon ikäisistä sioista, joilla esiintyi monitahoinen keuhkoputkentulehdus useiden eri tahojen välittämällä kaupallisella sikalan kasvattamolla. Keuhkovaurioihin kuului keskivaikea, subakuutti tai krooninen, märkivä keuhkoputkentulehdus ja interstitiaalinen keuhkokuume, johon liittyi keuhkoputkentulehdus ja peribronkiitti. Keuhkokudos oli negatiivinen sikojen lisääntymis- ja hengitystieoireyhtymäviruksen (PRRSV), sikojen sirkoviruksen tyyppi 2:n (PCV2) ja Mycoplasma hyopneumoniaen suhteen, mutta positiivinen Streptococcus suis -bakteerin suhteen. Tyypillisten influenssan kaltaisten vaurioiden ja keuhkokuumeen kliinisten oireiden vuoksi keuhkokudoshomogenaatti inokuloitiin Madin-Darby canine kidney (MDCK) -soluihin. Sytopaattisia vaikutuksia havaittiin 3. päivänä inokulaation jälkeen (p.i.). Influenssaviruksen nukleoproteiinigeeni (NP) havaittiin tartunnan saaneista soluista RT-PCR:llä. Virus ei reagoinut sikojen vertailuvasta-aineiden (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) kanssa hemagglutinaation estomäärityksissä (HI), eikä multipleksi-RT-PCR:llä havaittu H1N1- tai H3N2-geenejä (14). Virus toimitettiin helmikuussa 2007 Kansalliseen eläintautikeskukseen (National Animal Disease Center, NADC) alatyypin määrittämistä ja sekvensointia varten.

Syyskuun isolaatin alatyypin määrittämisen ja sekvensoinnin (kuvattu jäljempänä) jälkeen tapaustietojen haku paljasti, että huhtikuussa 2006 oli toimitettu eräs toinen ”tyypittelemätön” influenssaisolaatti. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) oli eristetty 12 viikon ikäisestä siasta, jolla oli ollut hengitystiesairaus toisella kaupallisella sikojen kasvattaja-jalostustilalla. Keuhkovauriot olivat histopatologisesti tyypillisiä sikainfluenssalle (vakava, subakuutti keuhkorakkuloiden ja keuhkoputkien tulehdus, johon liittyi keuhkoputkien epiteelisolujen nekroosia ja metaplasiaa). Keuhkot olivat negatiiviset PRRSV:n, PCV2:n ja M. hyopneumonian suhteen, mutta positiiviset influenssa A -viruksen suhteen RT-PCR:llä (spesifinen NP-geenille) ja S. suis -viruksen suhteen. Virus toimitettiin NADC:lle maaliskuussa 2007 alatyypitystä ja sekvensointia varten.

Alatyypitys ja fylogeneettinen analyysi.

Kummankin influenssaviruksen tunnistamiseksi ja luonnehtimiseksi suoritettiin nukleiinihapposekvensointi sekä molekyyli- ja fylogeneettinen analyysi. Molemmat virukset sekvensoitiin suoraan matalapassiivisista isolaateista käyttäen MDCK-soluja, ja sekvenssit vahvistettiin plakkipuhdistuksen ja uudelleen sekvensoinnin jälkeen. Ne tunnistettiin H2N3-viruksiksi nukleotidisekvenssin ja Influenza Sequence Database -tietokannan (www.flu.lanl.gov) BLAST-haun perusteella. Sw/4296424:n HA-geenin segmentti vastasi läheisimmin Pohjois-Amerikassa sinisorsista eristettyjen H2-virusten segmenttejä. Sen NA-segmentti oli läheistä sukua sinisuohaukasta eristetyn H4N3-lintuinfluenssaviruksen (AIV) NA-geenisegmentille (98,3 % identiteetti). Sen sisäiset geenit olivat polymeraasihappogeeniä (PA-geeni) lukuun ottamatta peräisin nykyisistä kolminkertaisesti tärkeistä sikainfluenssaviruksista, joita esiintyy tällä hetkellä Yhdysvalloissa. Näiden virusten sisäiset geenit ovat peräisin ihmisen (PB1), lintujen (PB2, PA) ja sikojen influenssaviruksista (SI-taulukko 4). Sen PA-segmentti oli 99,2-prosenttisesti identtinen sinisorsista eristetyn H6N5 AIV:n kanssa (SI-taulukko 4). Sw/2124514- ja Sw/4296424-virusten kokonaisnukleotidisekvenssi oli 99,3-99,9 prosenttia identtinen (SI-taulukko 5). Molemmat isolaatit kloonattiin toistuvasti, testattiin uudelleen ja vahvistettiin sekvensoinnilla kuuluvan H2N3-alatyyppiin. H2N3-alatyyppi vahvistettiin serologisesti hemagglutinaation esto- ja neuraminidaasin estomäärityksillä. HA- ja NA-geeneihin perustuva fylogeneettinen analyysi osoitti, että nämä kaksi virusta kuuluvat amerikkalaiseen lintulinjaan, joka eroaa euraasialaisista lintukannoista ja ihmisistä vuoden 1957 influenssapandemian jälkeen eristetyistä H2N2-viruksista (kuva 1).

HA- ja NA-pintaproteiinien molekyylianalyysi.

Influenssa A -virukset sisältävät kaksi pintaproteiinia: HA on reseptoria sitova ja kalvoa sulauttava glykoproteiini ja NA on reseptoria tuhoava entsyymi. Viruksen HA on kriittinen tekijä influenssavirusten isäntälajispesifisyydessä (15). Luonnehtiaksemme HA:n sisällä olevia jäännöksiä, jotka voivat liittyä lintuviruksen sopeutumiseen nisäkäsisäntään, vertasimme sikojen HA:n aminohapposekvenssejä oletettujen vertailulintuvirusten aminohapposekvensseihin. Kahden sian H2N3-isolaatin HA-molekyylien molekyylien molekyylivertailu osoitti, että ne eroavat sinisorsasta eristetystä oletetusta H2N3-referenssiviruksesta kuudella yhteisellä aminohapposubstituutiolla (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I ja L506V) (SI Taulukko 6). Substituutio Q226L löytyi molemmista sikojen H2N3-isolaateista, kun taas asema 228 sisälsi G:n, joka on identtinen lintujen konsensussekvenssin kanssa (taulukko 1) (16). Sitä vastoin H2-alatyypin ihmisen HA-molekyylit sisältävät 226L:ää ja 228S:ää, kun taas ihmisen varhaiset H2-isolaatit sisältävät 226L:ää ja 228G:tä (taulukko 1), jotka ovat samanlaisia kuin sikojen isolaatit. Sijainnit 36N, 274I, 316I ja 419I ovat ainutlaatuisia kahdelle sian H2N3-isolaatille (SI-taulukko 6), kun taas vastaavat sijainnit kuvassa 1 a esitetyissä ihmisen ja lintujen isolaateissa ovat 36D, 274T, 316V ja 419L. Kuviossa 1 a esitettyjen influenssaisolaattien osalta asema 506V on konservoitunut ihmisen, kahden sian H2N3-isolaatin ja lintuinfluenssaisolaattien välillä, lukuun ottamatta A/mallard/Alberta/2004 (H2N3) -isolaattia, kuten SI-taulukosta 6 käy ilmi. Molempien sikainisolaattien NA-aminohapposekvenssissä havaittiin kaksi yhteistä aminohappomuutosta, kun niitä verrattiin sinisuohaukasta eristettyyn H4N3-viitevirukseen: H47Y ja H253Y (SI-taulukko 7). Sijainti 47Y molemmissa sikojen H2N3-isolaateissa on sama kuin vastaava aminohappo Euraasian lintuinisolaateissa, jotka on esitetty kuvassa 1 b. Pohjoisamerikkalaisissa lintuinisolaateissa sijainti on 47H. Asema 253Y on ainutlaatuinen sian H2N3-isolaateille, ja asema 253H on konservoitunut kuvassa 1 b esitetyissä Euraasian ja Pohjois-Amerikan lintuinisolaateissa. Mielenkiintoista on, että Sw/4296424 (H2N3), joka eristettiin viisi kuukautta myöhemmin kuin Sw/2124514 (H2N3), sisälsi kaksi lisäsubstituutiota (P162S ja L321V) HA-molekyylissä ja kolme lisäsubstituutiota (V30I, I49T ja A135T) NA-molekyylissä, kun sitä verrattiin Sw/2124514:n HA:n ja NA:n molekyyleihin (taulukot 6 ja 7). NA-molekyylin asema 30I (Sw/4296424) on samanlainen kuin euraasialaisissa isolaateissa, kun taas asema 30V (Sw/2124514) on konservoitunut pohjoisamerikkalaisissa lintuinisolaateissa.

Sikojen H2N3-influenssavirusten patogeenisuus ja tarttuvuus sioissa.

Tutkittaessa H2N3-viruksen sikojen sopeutumisen laajuutta tutkittiin sen patogeenisuutta tässä isännässä inokuloimalla 20 neljän viikon ikäistä sikaa 2 × 106:lla 50 %:n kudosviljelyssä infektiivisellä annoksella (TCID50) Sw/4296424-virusta. Vain yksi H2N3-virus valittiin, koska näiden kahden isolaatin välinen identiteetti on suuri. Kahdelletoista vertailusialle annettiin koe-insokulaatio ei-tarttuvalla soluviljelmän supernatantilla. Tarttuvuutta arvioitiin pitämällä 10 iältään vastaavaa kontaktisikaa koohousyhteydessä rokotettujen sikojen kanssa alkaen päivästä 3 p.i. Kaikki tutkimuksessa käytetyt siat olivat seronegatiivisia päivänä 0 vasta-aineiden suhteen sikainfluenssa H1N1-, H1N2-, H2N3- ja H3N2-viruksia vastaan HI-määrityksellä. Viisi rokotettua sikaa ja kolme vertailusikaa lopetettiin ruumiinavausta varten päivinä 3, 5 ja 7 p.i. Kymmenen kontaktisikaa ja viisi viruksella rokotettua sikaa testattiin serologisesti HI-määrityksellä H2N3-viruksen kanssa 24. päivänä kontaktin jälkeen ja 27. päivänä p.i. vastaavasti. Akuutteja hengitystieoireita ei havaittu. Ruumiinavauksessa havaittiin vakavia makroskooppisia keuhkovaurioita (luumunvärisiä, konsolidoituneita alueita) tartunnan saaneilla sioilla, mutta vertailusioissa niitä ei havaittu (taulukko 2). Histopatologinen pistemäärä (0-3), joka ilmaisee keuhkojen arkkitehtuurin vaurioitumisen laajuuden, oli >2 rokotetuilla sioilla (taulukko 2). Inokuloitujen sikojen keuhkoissa, jotka lopetettiin 3., 5. tai 7. päivänä i.p.i., esiintyi lievää tai keskivaikeaa interstitiaalista keuhkokuumetta ja akuuttia tai subakuuttia nekrotisoivaa bronkioliittia, johon liittyi keuhkoputkien ja verisuonten lievää lymfosyyttistä kanylointia (kuva 2). Virus titrattiin bronkoalveolaarisesta huuhtelunesteestä (BALF) ja eristettiin nenän pyyhkäisynäytteistä. Virustitterit keuhkoissa vaihtelivat 104,3-106,5 TCID50/ml:n välillä päivinä 3 ja 5 p.i. (SI-taulukko 8), ja ne olivat negatiivisia päivänä 7 p.i. H2N3-rokotettujen ryhmässä virus eristettiin nenänielun pyyhkäisynäytteistä 25 prosentilta (5 sikaa 20:stä) sioista kolmantena päivänä, 67 prosentilta (10 sikaa 15:stä) viidentenä päivänä ja 20 prosentilta (2 sikaa 10:stä) seitsemäntenä päivänä p.i., ja kosketuksen yhteydessä olleiden sikojen näytteistä 10 prosenttia (1 sikaa 10:stä) oli positiivisia 5. ja 7. päivänä kosketuksesta. Sitä vastoin 100 prosenttia (10 sikaa 10:stä) kontaktisioista oli seropositiivisia 24 päivän kuluttua kosketuksesta rokotettujen sikojen kanssa (SI-taulukko 9). Joillakin vertailusioilla oli satunnaisesti pieni lievä interstitiaalinen keuhkokuume (taulukko 2), mutta ne olivat negatiivisia sikainfluenssavirustartunnan suhteen. Kaikki siat olivat negatiivisia PRRSV:n ja M. hyopneumoniaen suhteen PCR:n avulla. Tuloksemme osoittavat, että H2N3-virus on patogeeninen sioille ja tarttuu sikojen välillä.

H2N3-sikainfluenssavirusten patogeenisuus hiirissä.

Testaamaan H2N3 Sw/4296424 -viruksen kykyä replikoitua hiirissä inokuloimme 6-7 viikon ikäisiä BALB/c-hiiriä nielunsuunsisäisesti 102-106 TCID50:llä. Hiiret, joihin oli inokuloitu 104 TCID50 tai enemmän, osoittivat taudin merkkejä (esim. vaikeutunut hengitys, karhea turkki, laihtuminen ja letargia) (SI-taulukko 10). Seitsemänkymmentäviisi prosenttia hiiristä, jotka saivat 106 TCID50:tä, kuoli, mutta pienemmillä annoksilla kuolemantapauksia ei esiintynyt. Virus-RNA havaittiin reaaliaikaisella RT-PCR:llä (17) hiirten keuhkoista sen jälkeen, kun niille oli istutettu 106 tai 105 TCID50 (SI-taulukko 10). Histopatologisesti H2N3-virus aiheutti moninkertaisia tai yhteenliittyviä interstitiaalisen keuhkokuumeen ja proliferatiivisen alveoliitin pesäkkeitä, joille oli ominaista selvä pneumosyyttihypertrofia ja makrofagien, lymfosyyttien ja neutrofiilien sekapopulaation tunkeutuminen keuhkorakkuloiden seinämiin (SI Kuva 3). Joissakin alveolaarilumeneissa oli fibriinihyytymiä ja kevyesti sekoittunutta leukosyyttistä eksudaattia. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että H2N3 on patogeeninen hiirissä ilman aiempaa adaptaatiota.

Sian H2N3-influenssaviruksen tarttuvuus freteissä.

Voidakseen aiheuttaa pandemian ilmaantuvan influenssa A -viruksen on tartuttava ihmisiin, ja sen on tartuttava tehokkaasti ihmisten keskuudessa. Tutkiaksemme reassortanttisen H2N3-viruksen mahdollisuuksia tarttua nisäkäsjärjestelmissä käytimme frettikontaktimallia (18). Kolme 18 viikon ikäistä frettiä, jotka pidettiin erillisissä häkeissä, rokotettiin 102,5 TCID50:llä H2N3-virusta Sw/2124514. Kumpaankin häkkiin laitettiin 24 tunnin kuluttua yksi kontaktieläin. Nenähuuhtelut otettiin päivinä 1, 4 ja 7 p.i., ja virus titrattiin alkiomunissa. Virus havaittiin kaikissa rokotetuissa ja kontaktissa olleissa freteissä, mutta yhdelläkään ei ollut selviä kliinisiä oireita (taulukko 3). Nämä tulokset osoittavat, että H2N3-influenssavirus tartutti fretit ja siirtyi tehokkaasti kontaktin välityksellä.