Abstract

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) on laajalti käytetty kansanlääkinnässä. Glycyrrhizin, G. glabran aktiivinen yhdiste, omaa anti-inflammatorisen aktiivisuuden. Tässä tutkimuksessa tutkitaan G. glabra -metanoliuutetta ja glysyrritsiiniä sarveiskalvon neovaskularisaation (CNV) hoitoon. G. glabra uutettiin 70-prosenttisessa vesipitoisessa metanolissa. Kemiallisen koostumuksen analysointiin käytettiin fytokemiallisia testejä, ohutkerroskromatografiaa (TLC) ja korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC). G. glabra -metanoliuutteen (2 % w/v) ja glysyrritsiinin (1 % w/v) ajankohtainen liuos valmistettiin normaaliin suolaliuokseen. Sarveiskalvon polttamisen (1 N NaOH) jälkeen eläimet jätettiin käsittelemättä viikon ajan, jotta neovaskularisaatio ilmenisi kaikissa ryhmissä. Hoidot aloitettiin päivänä 7 ja niitä jatkettiin seuraavat 21 peräkkäistä päivää. Eläimiä hoidettiin 3 tipalla erilaisia paikallisia liuoksia kolmesti päivässä. CNV:n arvioinnissa käytettiin digitaalista valokuva-analyysiä ja histologisia tutkimuksia. G. glabra -metanoliuutteen fytokemiallinen analyysi osoitti saponiinien, fenolien, hiilihydraattien, flavonoidien ja proteiinien esiintymistä. TLC ja HPLC vahvistivat glykyrritsiinin läsnäolon. Valokuva-analyysi uutteesta ja glykyrritsiinillä käsitellystä ryhmästä osoitti CNV:n huomattavaa vähenemistä. G. glabra ja glykyrritsiinillä käsiteltyjen ryhmien histologinen tutkimus osoitti, että verisuonet eivät olleet kunnolla järjestäytyneitä kollageenikuituja. Tämä tutkimus osoitti, että G. glabraa ja glysyrritsiiniä voidaan käyttää CNV:n hoitoon. Biotutkimukseen perustuva eristäminen voi johtaa silmälääketieteellisten liuosten valmistamiseen CNV:n hoitoon.

1. Johdanto

Glycyrrhiza glabra L. (Leguminosae) on kotoisin Välimeren alueelta, Keski-Venäjältä Etelä-Venäjälle ja Aasiasta, ja nykyään sitä viljellään laajalti kaikkialla Euroopassa ja Lähi-idässä. Lakritsalla on korkea ravintoarvo, ja sitä on käytetty elintarvikkeissa jo antiikin ajoista lähtien. Elintarvikkeissa sitä käytetään pääasiassa makeutusaineena. Sillä on myös janontunnetta estäviä ominaisuuksia . Food and Drug Administration (FDA) on hyväksynyt lakritsiöljyn, ja sitä käytetään erilaisissa elintarvikkeissa, kuten juomissa, hammastahnassa, purukumissa ja kosmetiikassa . G. glabraa on käytetty laajalti kansanlääkinnässä eri sairauksien hoitoon . G. glabran lehtiä käytetään haavojen hoitoon juuria diabeteksen, Gravesin taudin ja ilmavaivojen hoitoon ja kantoja tuberkuloosin hoitoon . Sitä käytetään myös aphrodisiacina . G. glabran antenniosien metanoliuute osoitti antimikrobista aktiivisuutta useita bakteerilajeja vastaan . G. glabra -kasvin vesipitoinen metanoliuute esti Ehrlichin askitekasvainsolujen in vitro- ja in vivo -proliferaatiota ja osoitti antiangiogeenistä aktiivisuutta in vivo, peritoneaali- ja korioallantoisen kalvon määrityksissä . Lakritsi osoitti myös verihiutaleiden aggregaatiota estäviä vaikutuksia, ja sitä on käytetty myös yskää lievittävänä lääkekasvina muinaisista ajoista lähtien . Kiinalaisten lakritsijuurien havaittiin estävän Plasmodium falciparum- ja Leishmania donovani -bakteerien kasvua in vitro -tutkimuksissa . Lisäksi lakritsilla on raportoitu olevan antibakteerisia ja antiviraalisia vaikutuksia .

G. glabra sisältää useita kemiallisia ainesosia, kuten saponiinia, flavonoideja, isoflavonoideja, stilbenoideja ja kumariineja. Saponiinien aktiiviset ainesosat ovat glysirritsiini, likviirihappo ja glysirretoli. Flavonoideissa aktiivisia ainesosia ovat likiritiini, likiritigeniini ja neolikiritiini. Isoflavonoideissa ne ovat glabridiini, glabroni, glytsariini ja galbrene. Kumariinien aktiivisia ainesosia ovat liqkumariini ja umbelliferoni . Lopuksi stilbenoideissa aktiivinen ainesosa on dihydrostilbeenit . Glykyrritsiini on glykyrritsiinihapon kalium- ja kalsiumsuola. Se on saponiiniglykosidi, joka hydrolysoituessaan tuottaa glykyrritiinihappoa . Glykyrritsiini, joka tunnetaan myös nimellä glykyrritsiinihappo, on G. glabra -juuren uutteen tärkein (10-25 %) aktiivinen ainesosa . Glycyrrhizin auttaa estämään keuhkosyöpää ja fibrosarkoomia . Japanissa sitä on käytetty C-hepatiitin hoitoon yli 60 vuoden ajan . Lisäksi glykyrritsiinillä oli proapoptoottisia ominaisuuksia kolestaattisen maksavaurion hepatosyyttimallissa. Glykyrrheriinihapon todettiin olevan voimakas sappihapon aiheuttaman apoptoosin ja nekroosin estäjä . Flavonoideihin kuuluvilla aineilla, kuten isoliquiritigeniinillä ja likokalkonilla, on havaittu olevan antioksidanttisia, kasvainten vastaisia, tulehdusta ehkäiseviä ja antiangiogeenisiä vaikutuksia.

Sarveiskalvo on läpinäkyvä, avaskulaarinen ja silmän uloin kudos. Sen läpinäkyvyys on välttämätöntä näkökyvyn selkeyden kannalta. Normaalioloissa sarveiskalvon avaskulaarisuutta ylläpitää angiogeenisten ja antiangiogeenisten tekijöiden välinen tasapaino. Tämän tasapainon siirtyminen angiogeenisten tekijöiden suuntaan aiheuttaa sarveiskalvon neovaskularisaation (CNV) . CNV on patologinen tila, jossa sarveiskalvon läpinäkyvyys häviää uusien verisuonten kasvaessa silmän limbuksen alueelta. CNV:n kehittyminen johtaa sarveiskalvon läpinäkyvyyden vähenemiseen ja aiheuttaa näin ollen näön heikkenemistä, yleensä keskeisen näön menetystä, tai voi jopa johtaa sokeutumiseen .

Vaikka CNV:n tarkkaa syytä ei ole vielä täysin selvitetty, useat patologiset tilat, kuten tulehdus, infektio, rappeutuminen ja traumaattiset häiriöt, voivat aiheuttaa CNV:tä. Myös piilolinssien käyttö aiheuttaa hypoksiaa, joka voi lopulta johtaa CNV:hen. Näistä tekijöistä sarveiskalvon infektiosairaudet ovat tärkein CNV:n syy. Tällä hetkellä CNV:n hoitovaihtoehtoja ovat lääkkeet, kuten ei-steroidiset tulehduskipulääkkeet (NSAID-lääkkeet), steroidit ja siklosporiini , laserhoidot, kuten terminen argonlaserfotokoagulaatio , lapsivesikalvosiirto ja limbaalisiirto . Kaikilla käytettävissä olevilla hoidoilla on kuitenkin haittapuolensa, kuten korkeat kustannukset, heikko teho ja vakavat sivuvaikutukset.

On kipeästi tarpeen löytää uusia ja vaihtoehtoisia hoitomuotoja CNV:lle. Aiemmin on havaittu, että otteilla ja yhdisteillä, joilla on anti-inflammatorisia ja antiangiogeenisiä vaikutuksia, on potentiaalia hoitaa CNV:tä. G. glabra -uutteen ja sen tärkeimmän kemiallisen ainesosan, glykyrritsiinin, anti-inflammatorisia ja antiangiogeenisiä vaikutuksia koskevien etnofarmakologisten ja muiden tieteellisten tietojen perusteella tässä tutkimuksessa arvioitiin niiden mahdollisuuksia CNV:n hoidossa. Todettiin, että G. glabra -uute pysäytti tehokkaasti CNV:n, mutta glykyrritsiinin todettiin olevan suhteellisen tehoton CNV:n kehittymisen pysäyttämisessä eläinmallissa.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit ja menetelmät. Kasvimateriaali

G. glabran juuret ostettiin kesäkuussa 2015 aidosta yrttikaupasta Abbottabadissa, Pakistanissa. Tohtori Abdul Nazir, apulaisprofessori, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Pakistan, vahvisti yksilön tunnistamisen (tositenumero gg-09-R/15), ja kasvinäyte talletettiin farmasian laitokselle, COMSATS Institute of Information Technology, Abbottabad, Pakistan.

2.2. Tutkimuksen tulokset Kemikaalit

Glysyrritsiini (puhtaus 75 %) ostettiin Sigma Aldrichilta, USA. Ketamiini HCl (Indus Pharma, Pakistan), ksylatsiini HCl (FARVET, Peru), proparakaiini HCl (Alcon Laboratories, Inc., USA) ja normaali keittosuolaliuos (Otsuka Pakistan Ltd.) ostettiin paikallisesta apteekkiliikkeestä.

2.3. Tutkimuksen tulokset. Käsittely ja uuttaminen

Kuivattu kasvimateriaali jauhettiin ja uutettiin liottamalla jauhettua materiaalia (745 g) 70-prosenttisessa vesipitoisessa metanolissa (3 L) huoneenlämmössä. Seosta sekoitettiin ajoittain ruostumattomasta teräksestä valmistetulla sauvalla kahden viikon ajan maksimaalisen uutteen saamiseksi. Uute suodatettiin musliinikankaan ja sen jälkeen Whatman-suodatinpaperin numero 42 (125 mm) läpi. Uute tiivistettiin tyhjiörotaatiohaihduttimella (Yamato Rotary Evaporator, RE 801; Etelä-Korea) vesihauteessa, jonka vesihaute oli asetettu 40 °C:een. Uutteen lopullinen prosentuaalinen saanto oli 12,2 %.

2.4. Fytokemiallinen analyysi ja sormenjälki

Raakauutteelle tehtiin alustava fytokemiallinen analyysi kaikkien tärkeimpien kemiallisten ainesosien osalta käyttäen kemiallisia standardikokeita . Alkaloidien osalta uutetta (500 mg) ravistettiin 5 ml:ssa 1 %:n HCl:ää ja kuumennettiin varovasti 1 minuutin ajan vesihauteessa. Seuraavaksi otettiin 1 ml tätä liuosta ja lisättiin 0,5 ml Wagnerin reagenssia. Sameuden tai saostuman kehittyminen osoitti alkaloidien läsnäolon. Steroideja varten käytettiin Salkwoskin testiä, jossa lisättiin 2 ml kloroformia liuottamaan 100 mg uutetta koeputkeen. Sitten lisättiin varovasti 2 ml väkevää H2SO4:ää alemman kerroksen muodostamiseksi. Ylempään kerrokseen muodostui vihreä väri, joka osoitti steroidien läsnäolon. Saponiineja varten (vaahtotesti) 3 mg uutetta liuotettiin 10 ml:aan tislattua vettä ja ravistettiin voimakkaasti koeputkessa ja annettiin seistä 1 minuutin ajan. Yhtenäisen vaahdon muodostuminen osoitti saponiinien esiintymistä. Flavonoidien osalta (lyijyasetaattitesti) 1 mg:aan kasviuutetta lisättiin koeputkessa 1 ml lyijyasetaattiliuosta (5 %). Seoksen annettiin seistä häiriöttä. Keltaisen väristen saostumien muodostuminen osoitti flavonoidien esiintymisen. Fenoleja varten (ferrikloriditesti) otettiin 2 mg uutetta koeputkeen ja lisättiin 3 tippaa 10-prosenttista ferrikloridia. Sinertävän mustan värin ilmaantuminen osoitti fenolien esiintymistä. Glykosidien osalta (nitroprussiditesti) metanoliuutteeseen lisättiin muutama tippa 10-prosenttista natriumhydroksidia ja sen jälkeen edellä mainittuun liuokseen lisättiin natriumnitroprussidia. Sinisen värin ilmestyminen osoitti glykosidien esiintymistä uutteessa. Pelkistäviä sokereita varten Fehlingin liuos (A ja B) lisättiin vesipitoiseen metanoliuutteeseen (100 mg/ml) koeputkessa. Saatua liuosta kuumennettiin vesihauteessa 10 minuutin ajan. Punaruskean saostuman muodostuminen oli positiivinen merkki pelkistävien sokerien esiintymisestä. Proteiinien osoittamiseksi kasviuute käsiteltiin muutamalla pisaralla väkevää typpihappoa. Keltaisen värin muodostuminen osoitti proteiinien läsnäolon.

Ohutkerroskromatografiaa (TLC) käytettiin eri yhdisteiden, erityisesti tärkeimmän kemiallisen ainesosan, glykyrritsiinin, tunnistamiseen. Uutetta ja glykyrritsiiniä levitettiin silikageelillä (60 F254) päällystetyille TLC-levyille ja kehitettiin liikkuvassa faasissa n-butanoli, etikkahappo ja tislattu vesi (12 : 3 : 5). Keriinisulfaattia käytettiin ruiskutusreagenssina yhdisteiden visualisoimiseksi TLC-levyillä.

Korkeasuorituskykyistä nestekromatografiaa (HPLC) (Perkin Elmer, Series 200 Auto sampler) käytettiin uutteen ja glysyrritsiinin analysointiin. HPLC-sormenjälkimäärityksessä käytettiin seuraavia olosuhteita: UV-Vis-detektori (200-700 nm), kolonni (C18) (5 μm, 150 mm × 4,6 mm), liikkuva faasi, joka oli asetonitriili ja vesi suhteessa 10:90, injektiotilavuus, joka oli 20 μl, virtausnopeus, joka oli 1 ml/min, ja kalvosuodatin, jonka kalvo oli 0,45 μm. Yhdisteet havaittiin aallonpituudella 254 nm. G. glabra -yhdisteen osalta 100 mg uutetta otettiin 25 ml:aan 70-prosenttista vesipitoista metanolia mittapullossa (50 ml) ja sonikoitiin 50 minuutin ajan huoneenlämmössä. Glykyrritsiinin standardiliuos valmistettiin liuottamalla 5 mg glykyrritsiiniä metanoliin ja lopullinen tilavuus tehtiin 10 ml:ksi lisäämällä metanolia. G. glabra -uutteen ja glysyrritsiinin kantaliuokset suodatettiin ja kaasunpoistettiin ultraäänellä ennen analyysia.

2.5. Eläimet

Tässä tutkimuksessa eläinmallina käytettiin kumpaakin sukupuolta olevia kaneja (1,5-2 kg). Ne ostettiin Abbottabadin kaupungin paikallisilta markkinoilta. Kokeellinen protokolla hyväksyttiin CIIT Abbottabadin eläinten eettisen komitean määräysten mukaisesti hyväksymisnumerolla PHM.Eth / SP.14-714-CIIT-ATD heinäkuun 11. päivänä 2015, joka noudattaa kaikkia NIH Animal Ethical Guideline (1986) -suosituksia. Kaniinit jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään, joissa oli vähintään viisi eläintä per ryhmä. Tämän jälkeen kukin kani merkittiin edelleen korvaan ryhmien sisällä, jotta voitiin taata niiden jako koko koemenettelyn ajan. Eläimet sijoitettiin tavanomaisiin olosuhteisiin, ja niille annettiin vapaa pääsy ruokaan ja veteen.

2.6. Tutkimusmenetelmät. Sarveiskalvon palovamman aiheuttaminen kanin silmässä

CNV:n indusoimiseksi kaikkien koe-eläinten oikeat silmät vaurioitettiin alkalipolttamalla (1 N natriumhydroksidiliuoksella) käyttäen raportoitua protokollaa . Lyhyesti sanottuna koe-eläimiä näännytettiin 12 tuntia ennen kokeen aloittamista. Eläimet nukutettiin käyttämällä lihaksensisäistä ketamiinihydrokloridi-injektiota (50 mg/kg) ja ksylatsiinin (5 mg/kg) yhdistelmää. Tämän jälkeen kanin oikea silmä avattiin lankaspekulumin avulla, jotta alkalipoltto voitiin aiheuttaa kunnolla. Noin 2 minuuttia ennen palamista kunkin kanin oikeaan silmään annettiin muutama tippa proparakaiini-HCl:tä sarveiskalvon ärsytyksen minimoimiseksi. Whatman-suodatinpaperista valmistettiin 7 mm:n levy paperitaltalla. Suodatinpaperikiekot kastettiin varovasti 1 N natriumhydroksidiliuokseen noin 90 sekunniksi ja asetettiin sen jälkeen keskelle sarveiskalvoa 2 minuutiksi vakavien palovammojen aikaansaamiseksi. Silmät pestiin normaalilla suolaliuoksella kostuttamiseksi ja steriiliyden aikaansaamiseksi. Sarveiskalvon palamisen jälkeen kaneja pidettiin viikon ajan CNV:n kehittymistä varten ilman muita hoitoja.

2.7. Silmätippojen valmistaminen ja hoitoprotokollat

G. glabra -uutteen ajankohtainen liuos (2 % w/v) valmistettiin normaaliin suolaliuokseen käyttäen 10 % dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja muutamaa tippaa Tween-80:tä ja sekoitettiin vortex-sekoittimella. Vastaavasti glykyrritsiiniliuos (1 % w/v) valmistettiin normaaliin suolaliuokseen. Vehoaineen valmistamiseksi dimetyylisulfoksidi (DMSO) (10 % v/v) ja muutama tippa Tween-80:tä sekoitettiin normaaliin suolaliuokseen. Deksametasonia (0,1 %) (ALCON-COUVREUR, Belgia) hankittiin paikallisilta markkinoilta ja sitä käytettiin positiivisena kontrollina. Kaikki ajankohtaiset liuokset pakattiin paikallisilta markkinoilta ostettuihin erityisiin tippapulloihin ja säilytettiin 4 °C:ssa. Hoidot aloitettiin sarveiskalvon palovammojen 7. päivänä ja niitä jatkettiin seuraavat 21 peräkkäistä päivää. Eri eläinryhmien silmiä käsiteltiin paikallisesti 3 tipalla eri liuoksia kolme kertaa päivässä. Ensimmäistä ryhmää hoidettiin G. glabra -uutteella, kun taas toista ryhmää hoidettiin glysyrritsiinillä. Kolmas ryhmä sai lääkettä ja neljättä ryhmää, jota hoidettiin deksametasonilla (0,1 %), pidettiin positiivisena kontrollina.

2.8. Mikroskooppinen ja valokuvausanalyysi

CNV:n etenemistä kaikissa ryhmissä seurattiin säännöllisesti rakolamppumikroskoopilla (Olympus-CX21), johon oli manuaalisesti kiinnitetty keinotekoinen valonlähde. Valokuvat otettiin digitaalisella still-kameralla (DSC-W70, Sony, Japani), jonka suurennos oli ×12, 85 mm:n objektiivietäisyys, 100 %:n zoomausaste ja 29 cm:n kuvausetäisyys. Valokuvat otettiin päivinä 1, 7, 14, 21 ja 28 ja tallennettiin tietokoneelle myöhempää käyttöä varten.

2.9. Sarveiskalvokudosten histologiset tutkimukset

Kokeen viimeisenä päivänä eläimet uhrattiin kohdunkaulan sijoiltaanmenolla. Kokonaiset silmät irrotettiin ja säilytettiin 10 % neutraalissa formaliinissa. Säilytyksen jälkeen sarveiskalvon kudosnäytteet poistettiin koko silmästä kirurgisilla terillä. Kudokset siirrettiin sitten rei’itettyihin purkkeihin (kapseli) pihdeillä. Kudokset upotettiin ensin formaliiniin (15 %) ja sitten alkoholiformaldehydisuolaliuokseen (15 %) 3 tunniksi. Tämän jälkeen kudokset dehydratoitiin käyttämällä nousevia alkoholipitoisuuksia (etanoli). Tämän prosessin aikana kudoksia käsiteltiin 70-prosenttisella ja 80-prosenttisella alkoholilla 2 tunnin ajan ja lopuksi 100-prosenttisella alkoholilla 6 tunnin ajan. Seuraavassa vaiheessa näytteet puhdistettiin puhtaassa ksyleenissä 6 tunnin ajan (3 vaihtoa 2 tunnin välein eri purkeissa). Tämän jälkeen kudokset upotettiin parafiiniin automaattisella kuumakammiolla, jonka lämpötila-alue oli 58 ± 5 °C. Tämän jälkeen kudokset upotettiin parafiiniin. Kudokset upotettiin parafiiniin 4 tunniksi (2 tuntia kahdessa vuorossa ja eri purkeissa). Tämän jälkeen sarveiskalvokudoksista otettiin 4 μm:n leikkeet pyörivällä mikrotomilla (Thermo Fisher Scientific, Saksa). Asianmukaista fiksaatiota varten objektilasien päälle laitettiin muna-albumiinipisaroita ja kiinnitettiin yksi kudosleike. Tämän jälkeen objektilasit asetettiin 2 tunniksi mekaaniseen tarkkuusinkubaattoriin (slide warmer) (Model 4EM Cat. number 31574). Histologinen hematoksyliini-& eosiinivärjäys (H&E) suoritettiin eri vaiheiden kautta, mukaan lukien vahanpoisto, hydratointi, hematoksyliinivärjäys, värinpoisto (eosiinivärjäys) ja kuivaus.

3. Tulokset

3.1. Tulokset

3.1. Histologiset tulokset. G. glabra -uutteen fytokemiallinen analyysi

G. glabra -uutteen fytokemiallinen analyysi suoritettiin fytokemiallisten ainesosien pääluokkien esiintymisen selvittämiseksi. Tulokset paljastivat flavonoidien, hiilihydraattien, proteiinien, saponiinien ja fenolien esiintymisen, kuten taulukossa 1 esitetään. Alkaloidien, fytosterolien ja glykosidien esiintymistä ei vahvistettu tässä tutkimuksessa (taulukko 1).

Fytokemialliset komponentit Kemiallinen testi Esiintyminen Alkaloidit Wagnerin testi – Fytosterolitesti Salkowskin testi – Saponiineja Vaahto/Froth-testi + Flavonoidit Alkalireagenssitesti + Fenolit Rikkikloriditesti + Glykosidit Nitroprussiditesti – Hiilihydraatit Fehlingin testi + Proteiinit Xanthoproteiinitesti +

+ = todiste fytokemikaaleista; – = ei näyttöä fytokemikaaleista.

Taulukko 1

Fytokemiallinen analyysi G. glabra -uutteesta osoitti saponiinien, flavonoidien, fenolien, hiilihydraattien ja proteiinien esiintymisen.

Kemiallisilla testeillä saadut tulokset vahvistettiin vielä TLC-analyysillä. Ote standardoitiin sen tärkeimmän kemiallisen ainesosan, glykyrritsiinin, suhteen. Tulokset on esitetty kuvassa 1. Uutteen ainesosien retentiokertoimen (Rf) arvoja verrattiin glykyrritsiiniin. Kuten kuvasta 1 käy ilmi, G. glabra -uutteen näkyvän pisteen A Rf-arvo oli 0,43 ja B:n 0,15. Glykyrritsiinin (näkyvä piste C) Rf-arvo oli myös 0,15. Näiden tulosten perusteella voidaan vahvistaa, että glysyrritsiiniä esiintyi uutteessa yhtenä tärkeimmistä yhdisteistä.

Kuva 1

TLC-profiili G. glabra-uutteesta ja glykyrritsiinistä käyttäen silikageelillä päällystettyjä TLC-levyjä ja liikkuvana faasina n-butanoli : etikkahappo : vesi (12 : 3 : 5).

HPLC-analyysi raa’asta uutteesta, joka on peräisin G. glabrasta, ja glykyrritsiinistä, tehtiin, jotta saatiin eri kemiallisten ainesosien pääpiikit uutteisiin ja jotta voitiin vahvistaa tärkeimmän yhdisteen esiintyminen (glykyrritsiini). Tuloksena saadussa kromatogrammissa näkyi erilaisia piikkejä eri retentioajoilla G. glabra -uutteen osalta, kuten kuvassa 2(b) on esitetty. Kromatogrammissa näkyi myös glykyrritsiinin piikki retentioajalla 40 minuuttia, kuten kuvassa 2(a) on esitetty. Samoin kuin glysyrritsiinillä, myös uutteen kromatogrammissa havaittiin piikki samalla retentioajalla (40 min), kuten kuvassa 2(a) on esitetty. Tulokset vahvistivat glysyrritsiinin esiintymisen G. glabra -uutteen pääkomponenttina.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Kuva 2

HPLC-kromatogrammi seuraavista aineista: (a) glysyrritsiini ja (b) G. glabra -uute. HPLC-olosuhteet olivat aallonpituus (254 nm), liikkuva faasi (asetonitriili : vesi), injektiotilavuus (20 μl) ja virtausnopeus (1 ml/min).

3.2. HPLC-olosuhteet. CNV-analyysi G. glabra -uutetta, glysyrritsiiniä, Vehikkeliä ja positiivista kontrollia käsitellyistä ryhmistä

G. glabra -uutteen ja glysyrritsiinihoidon tehokkuuden havainnoimiseksi CNV:n etenemistä seurattiin mikroskooppisesti ja valokuva-analyysin avulla eri hoitopäivinä. Eri hoitopäivinä otetut valokuvat on esitetty kuvassa 3 uutetta ja lääkeainetta saaneiden ryhmien osalta. Mikroskoopilla havaittiin ja valokuvista voidaan myös nähdä, että jo ensimmäisellä hoitoviikolla neovesselin (NV) paksuus kasvaa uutetta saaneessa ryhmässä. Verisuonen paksuuden havaittiin kuitenkin pienenevän nopeammin toisen viikon jälkeen (kuva 3), ja se jatkui kokeen loppuun asti. Saadut tulokset osoittivat, että G. glabra -uute hävitti CNV:n lähes kokonaan kokeen 28. päivänä verrattuna ajoneuvokontrolliryhmään (kuva 3). Myös deksametasonilla (positiivinen kontrolli) käsitellyssä ryhmässä (kuva 3) oli sama suuntaus kuin G. glabra -uutteella käsitellyssä ryhmässä. Mikroskooppisesta havainnoinnista ja valokuvausanalyysistä kävi myös ilmi, että glysyrritsiinillä oli myös myönteisiä vaikutuksia CNV:n estämisessä. Kun silmät analysoitiin suuritehoisella resoluutiomikroskoopilla, nähtiin, että verisuonet haalistuvat vähitellen ja palautuvat normaaliin muotoon viimeisenä hoitopäivänä (kuva 3), ja vain muutama NV oli läsnä. Nämä tulokset osoittivat, että glysyrritsiinin anti-CNV-aktiivisuus oli hieman vähäisempi kuin raakauutteen.

Kuva 3

Representatiiviset valokuvat CNV:stä G. glabra-uutetta, glysyrritsiiniä, Vehikkeliä ja deksametasonia (positiivinen kontrolli) saaneessa ryhmässä päivinä 0, 7, 14, 21 ja 28. NV:n halkaisija ja paksuus vähenevät asteittain, ja se lähes hävisi viimeisenä koepäivänä. Glysyrritsiinillä käsitelty ryhmä osoitti myös NV:n halkaisijan ja paksuuden vähenemistä, mutta aktiivisuus oli vähäisempää kuin G. glabra -uutteella.

3.3. Kokeet. Histologinen analyysi G. glabra- ja glysyrritsiinillä käsitellystä sarveiskalvosta verrattuna ajoneuvo- ja positiiviseen kontrolliryhmään

Histologinen analyysi tehtiin tulehduksen esiintymisen, sarveiskalvon kuitujen palautumisen ja verisuonten olemassaolon selvittämiseksi. H&E-värjätyt edustavat mikrovalokuvat on esitetty kuvassa 4. Kunkin eläimen vasemman silmän histologiaa pidettiin vertailukudoksena, koska sille ei aiheutettu alkalipalovammoja ja sitä pidettiin normaaleissa olosuhteissa. Vertailusarveiskalvossa ei ollut epiteelin ja NV:n kasvua eikä muutoksia morfologiassa, kuten kuvassa 4 on esitetty. Vehikkelikontrolliryhmässä (kuva 4) oli laajoja verisuonia ja kollageenihäiriöitä, jotka osoittivat CNV:n kehittymistä. Toisaalta G. glabra -uutteella käsitellyn sarveiskalvon histologia osoitti, että sarveiskalvon alue oli lähes palautunut normaaliksi, verisuonet olivat lähes vähentyneet ja kollageenit olivat normaalissa muodossa. Glysyrritsiinillä käsitellyn ryhmän histologinen analyysi (kuva 4) osoitti, että vaikka sarveiskalvon alue on suurimmaksi osaksi palautunut normaaliin muotoonsa, on joitakin viitteitä siitä, että vaurioita on edelleen olemassa. Joitakin merkkejä epiteelin hypertrofiasta oli havaittavissa, ja verisuonia havaittiin myös vähemmän. Nämä tulokset osoittivat, että glysyrritsiini estää tehokkaasti CNV:tä, mutta vähemmässä määrin kuin G. glabra -uute. Vertailun vuoksi H&E-värjätyistä deksametasonilla käsitellyn sarveiskalvon (kuva 4) diakuvaus osoitti epiteelin kasvun ja verisuonten muodostumisen vähenemistä sarveiskalvon alueella, mutta kollageenikuidut olivat jotenkin tuhoutuneessa tilassa ja sattumanvaraisesti järjestäytyneet.

Kuva 4

Histologinen mikrokuva G. glabra-uutteella ja glykyrritsiinillä käsitelty ryhmä verrattuna ajoneuvokontrolliin ja positiiviseen kontrolliin.

4. Pohdinta

CNV on yksi tärkeimmistä sokeutumisen syistä kaikkialla maailmassa. On arvioitu, että noin 4,14 % maailman väestöstä kärsii tästä taudista . CNV:n tärkein molekulaarinen syy on angiogeenisten ja antiangiogeenisten tekijöiden välinen epätasapaino. Näistä tekijöistä verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) edistää verisuonten endoteelisolujen lisääntymistä, kulkua ja putkien muodostumista . CNV:tä on siis mahdollista hoitaa anti-VEGF-lääkkeillä, mutta sitä ei kuitenkaan voida täysin hoitaa pelkästään anti-VEGF-hoidolla, koska angiogeneesiä sääteleviä tekijöitä on myös muita . Lisäksi tulehdus ja angiogeneesi ovat toisistaan riippuvaisia prosesseja, joten anti-VEGF-hoito ei välttämättä onnistu . Aiemmin on havaittu, että otteet ja yhdisteet, joilla on kasvainten ja tulehduksen vastaista vaikutusta, ovat hyödyllisiä NV:n ja CNV:n estämisessä . G. glabran raakauute on osoittanut anti-inflammatorista vaikutusta, kun taas G. glabran vesiuute on estänyt angiogeneesiä in vivo -testeissä . Siksi oletettiin, että G. glabra -uutteella ja sen tärkeimmällä kemiallisella ainesosalla, glykyrritsiinillä, voi olla kyky kontrolloida CNV:tä, ja siksi tämä tutkimus tehtiin.

On tärkeää tuntea minkä tahansa uutteen kemiallinen koostumus ennen kuin sen biologisia vaikutuksia arvioidaan. Siksi G. glabra -uutteesta tehtiin fytokemiallinen analyysi, joka paljasti, että se sisältää tärkeitä kemiallisia ainesosia, kuten flavonoideja, hiilihydraatteja, proteiinia, saponiineja ja fenoleja. Aiemmissa tutkimuksissa raportoitiin saponiinien, flavonoidien, alkaloidien, terpenoidien, tanniinien ja glykosidien esiintymisestä, mutta hiilihydraatteja, proteiineja, flobatanniineja, fenolisia yhdisteitä ja antrakinoneja ei havaittu. Toisessa tutkimuksessa osoitettiin hiilihydraatteja, fenolisia yhdisteitä ja proteiineja sekä muita ainesosia G. glabra -uutteessa . Syynä näihin eroihin voivat olla kerättyjen kasvien vuodenaika ja ikä.

TLC- ja HPLC-menetelmät vahvistivat glykyrritsiinin esiintymisen raakauutteessa. Uutteen TLC- ja HPLC-kromatogrammit paljastivat yhdisteen, jonka Rf-arvo (0,15) ja retentioaika (noin 40 min) oli sama kuin standardin glykyrritsiinin. Nämä tulokset poikkeavat hieman aiemmista havainnoista, joissa standardiglysyrritsiinin havaintoarvo oli 0,22 . Tärkein syy tähän saattaa olla erilaisten reagenssien ja olosuhteiden käyttö edellisessä ja tässä tutkimuksessa. Aiemmassa tutkimuksessa liikkuvana faasina käytettiin kloroformia, metanolia ja vettä ja ruiskutusreagenssina anisaldehydi-rikkihappoa, kun taas tässä tutkimuksessa liikkuvana faasina käytettiin n-butanolia, etikkahappoa ja tislattua vettä ja ruiskutusreagenssina keriinisulfaattia.

Glysyrritsiinillä, joka on yksi G. glabra -valmisteen tärkeimmistä ainesosista, on raportoitu olevan tulehdusta lievittäviä ja syöväntorjunta-aktiviteetteja . Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että G. glabra -uute onnistui estämään CNV:tä, koska NV oli lähes vähentynyt 21 päivän hoidon jälkeen (kuva 3). Koska se oli tärkein yhdiste, ajateltiin, että CNV:n esto saattoi johtua glyserisiinistä. Glykyrritsiinin CNV-vastainen analyysi osoitti jonkin verran myönteisiä vaikutuksia CNV:n estoon, mutta se ei kyennyt täysin vähentämään verisuonia sarveiskalvon alueella (kuva 3). Glykyrritsiini on triterpenoidiglykosidi (saponiini), jossa on glykyrretiinihappoa. Aiemmin on raportoitu, että glykyrrhetiinihapolla on suora vaikutus mineralokortikoidireseptoreihin ja se tuottaa tulehduksen kaltaisia vaikutuksia , mikä voi olla yksi syy glykyrritsiinin vähäisempiin vaikutuksiin. Tämä tutkimus viittaa siihen, että glysyrritsiinin ohella jotkin muut yhdisteet saattavat olla vastuussa CNV:n estämisestä G. glabra -uutteessa.

Olikin tärkeää tutkia G. glabra -uutteen ja glysyrritsiinin vaikutuksia sarveiskalvokudoksen mikroskooppiseen anatomiaan (mikroanatomia). Siksi tehtiin histologinen analyysi, ja sen tulokset vahvistivat G. glabra -uutteen anti-CNV-vaikutukset. Lisäksi ei ollut selviä merkkejä myrkyllisyydestä, sillä kollageenikuidut olivat järjestäytyneet riviin G. glabra -uutteella käsitellyn eläimen sarveiskalvossa. G. glabra -uutteella käsitellyn sarveiskalvon mikroskooppinen anatomia oli hyvin samanlainen kuin normaalin kontrollin. Toisaalta deksametasonilla (positiivinen kontrolli) käsitellyssä sarveiskalvossa ei ollut merkkejä verisuonista, mutta kollageenisäikeet olivat edelleen sekaisin, mikä osoitti, että deksametasonilla voi olla joitakin myrkyllisiä vaikutuksia sarveiskalvoon. Vaikka aiemmissa tutkimuksissa on myös raportoitu deksametasonin toksisista vaikutuksista, tarvitaan lisätutkimuksia tämän ilmiön vahvistamiseksi mikroanatomisella tasolla. On myös tärkeää mainita, että vaikka glykyrritsiinillä onnistuttiin suurelta osin hallitsemaan CNV:tä, se ei pystynyt täysin korjaamaan alkalivaurioitunutta sarveiskalvoa, ja joitakin verisuonia havaittiin myös.

5. Johtopäätökset

Tuloksista voidaan päätellä, että G. glabran raa’an uutteen silmätipat estivät verisuonten kasvua sarveiskalvon alueella, mikä osoittaa, että se olisi tehokas CNV:n hoidossa. Lisäksi G. glabran tärkein yhdiste, glykyrritsiini, ei pystynyt täysin estämään CNV:tä. Tämä tarkoittaa sitä, että jokin muu aine tai jotkut muut aineet voivat olla glykyrritsiinin ohella vastuussa uutteen CNV:tä ehkäisevästä vaikutuksesta. Tätä varten tarvitaan lisätutkimuksia biotesteihin perustuvasta eristämisestä CNV:n estämisestä vastaavan pääkomponentin (pääkomponenttien) tunnistamiseksi. Lisäksi molekyylitutkimukset ovat myös hyödyllisiä G. glabra -uutteen tarkan molekyylimekanismin selvittämiseksi CNV:n hoidossa.

Interintäristiriidat

Tekijät ilmoittavat, että heillä ei ole eturistiriitoja.

Tekijöiden kontribuutiot

Syed Luqman Shah ja kaikki muut kirjoittajat osallistuivat tasapuolisesti tähän työhön. Kaikki kirjoittajat ovat hyväksyneet lopullisen työn.

Kiitokset

Tekijät haluavat kiittää Christie Rongea, farmasian laitos, Froedtert & the Medical College of Wisconsin, 9200 West Wisconsin Avenue, Milwaukee, WI, hänen avustaan kielellisissä/grammaattisissa korjauksissa.