Plasmidien rakentaminen

Jokainen tässä tutkimuksessa testattu kimeerinen anti-HA scFv rakennettiin siirtämällä kuusi CDR-silmukkaa anti-HA:n vasta-aineesta 12CA5 kuhunkin valittuun scFv-rakenteeseen. \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{{\mathrm{{{HA}}}}\) plasmidi rakennettiin kahdessa vaiheessa: (1) CDR-silmukkaan varttunut scFv:n g-blokki ja EcoRI-restriktiokohtien avulla linearisoitu H4K20me1-minttukehon 15F11-vektori38 ligatoitiin Gibson-assemblyn avulla (talon valmistama master mix); (2) scFv:n ja EGFP:n yhdistävä linkkeri sekä EGFP korvattiin joustavaa (G4S) × 5 -linkkeriä koodaavalla g-blokilla ja mEGFP:llä Gibson-assemblyn avulla NotI-restriktiokohtien kautta. Muiden neljän kimeerisen scFv-plasmidin osalta kukin CDR-silmukkaan varttunut scFv-gblock ligatoitiin EcoRI-restriktiokohtien avulla linearisoituun \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{\mathrm{HA}}}}\)-vektoriin Gibson-asennuksen kautta.

Kohdeplasmidi 1 × HA-mCh-H2B rakennettiin korvaamalla Addgenen plasmidin sfGFP sfGFP-H2B (Plasmidi # 56367) sfGFP:llä 1 × HA-epitoopilla merkityllä mCherryn g-blokilla, jossa 1 × HA-epitoopin ja mCherryn väliin lisättiin NotI-restriktiokohta seuraavaa kloonausta varten. 4 × HA-mCh-H2B konstruoitiin korvaamalla 1 × HA-mCh-H2B-konstruktion 1 × HA-tunniste 4 × HA-epitooppi gblockilla AgeI- ja NotI-restriktiokohtien kautta. 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) rakennettiin korvaamalla 1 × HA-mCh-H2B-konstruktion 1 × HA-tag 1 × HA:lla smHA:lla, joka oli monistettu Addgene-plasmidista smHA-KDM5B-MS2 (Plasmidi # 81085) käyttäen alukkeita NZ-098 ja 099 (kaikki alukesekvenssit on esitetty lisätaulukossa 1). SmHA-H2B rakennettiin korvaamalla 1 × HA-mCh-H2B-konstruktion 1 × HA-mCh-H2B 1 × HA-mCh:lla smHA:lla, joka oli monistettu plasmidista smHA-KDM5B-MS2 käyttäen alukkeita NZ-098 ja 100.

Toinen kohdeplasmidi 4 × HA-mCh-β-aktiini rakennettiin korvaamalla 4 × HA-mCh-H2B:n H2B:lla β-aktiiniamplikoni BglII- ja BamHI- restriktiokohtien kautta. β-aktiiniamplikoni monistettiin Addgenen plasmidista smFlag-ActinB-MS2 (Plasmid # 81083) käyttäen alukkeita NZ-073 ja NZ-074.

4 × HA-mRuby-Kv2.1-plasmidi tuotettiin monistamalla ensin 4 × HA-tag 4 × HA-mCh-H2B:stä alukkeita NZ-105 ja 106 käyttäen. Tämän jälkeen 4 × HA-amplikoni lisättiin julkaistuun plasmidiin pCMV-mRuby2-Kv2.161 (lahja tohtori Michael Tamkunilta), joka oli linearisoitu AgeI:llä tehdyllä restriktiodigestillä Gibson-assemblaatiolla. SmHA-Kv2.1-plasmidi luotiin PCR-monistamalla rotan Kv2.1:n koodaava sekvenssi pBK-Kv2.140:stä ja sen jälkeen ligoimalla se AsiSI- ja PmeI- restriktiokohtiin plasmidissa smHA-KDM5B-MS2 käyttäen alukkeita Kv2.1-1 ja 2.

H2B-mCh-1 × HA rakennettiin kahdessa vaiheessa: (1) korvattiin 1 × HA-mCh-H2B:n 1 × HA-tunniste H2B:llä AgeI- ja NotI-kohtien kautta, jossa H2B monistettiin 1 × HA-mCh-H2B:stä käyttäen alukkeita NZ-092 ja 093; (2) korvattiin mCherryn C-terminaalissa oleva H2B 1 × HA-tunnisteella BglII- ja BamHI-kohtien kautta, jossa 1 × HA-tunniste syntetisoitiin päällekkäisellä PCR:llä alukkeiden NZ-094 ja 095 avulla. Mito-mCh-1 × HA konstruoitiin korvaamalla H2B H2B-mCh-1 × HA:ssa H2B gblock23:lla Mito gblock23:lla AgeI- ja NotI-kohtien kautta. Mito-mCh-smHA konstruoitiin korvaamalla Mito-mCh-1 × HA:n 1 × HA-tunniste smHA:lla, joka oli monistettu smHA-KDM5B-MS2:sta käyttäen alukkeita NZ-096 ja 097. mCh-H2B tuotettiin korvaamalla sfGFP-plasmidin sfGFP-H2B sfGFP gblockilla mCherryllä Gibson-asennusta käyttäen.

Plasmidit FB-mCh, FB-Halo ja FB-SNAP muodostettiin korvaamalla \(\chi _{15{\mathrm{{F}}11}^{\mathrm{HA}}}}\) mEGFP mCherry-, HaloTag- ja SNAP-tag gblockilla.

pET23b-FB-GFP, plasmidi rekombinanttista frankenbody-ekspressiota ja -puhdistusta varten, koottiin Gibsonilla FB-GFP-amplikonista ja julkaistusta plasmidista pET23b-Sso7d62,63, joka oli linearisoitu NdeI- ja NotI- restriktiokohdilla. FB-GFP-amplikoni monistettiin \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{\mathrm{{HA}}}}\) PCR:llä alukkeilla NZ-075 ja 077.

Translaatiomääritystä varten reportterikonstruktiot smHA-KDM5B-MS2 ja SunTag-kif18b saatiin Addgenelta (plasmidit # 81085 ja # 74928), ja SunTag scFv-plasmidia (plasmidi # 60907) muokattiin poistamalla linkkerissä koodattu HA-epitooppi. HA-epitooppi poistettiin QuikChange Lightning -ohjelmalla (Agilent Technologies) valmistajan ohjeiden mukaisesti paikkaohjatulla mutageneesillä käyttäen alukkeita HAout-1 ja 2.

G-blokit syntetisoi Integrated DNA Technologies ja rekombinanttiplasmidit sekvenssivarmisti Quintara Biosciences. Alukkeiden sekvenssit on esitetty lisätaulukossa 1. Kaikki kuvantamiskääntämisessä käytetyt plasmidit valmistettiin NucleoBond Xtra Midi EF kitillä (Macherey-Nagel), jonka lopullinen pitoisuus oli noin 1 mg ml-1.

U2OS-soluviljely

U2OS-soluja (ATCC HTB-96) kasvatettiin inkubaattorissa 37 °C:n lämpötilassa, kostutettuna, 5 % CO2:ssa DMEM-väliaineessa (Thermo Scientific), jota täydennettiin 10 %:lla (v/v) naudan sikiöseerumilla (Altas Biologicals), 1 mM l-glutamiinilla (Gibco) ja 1 %:lla (v/v) penisilliinillä-streptomysiinillä (Gibco tai Invitrogen).

Transfektio ja helmien lataaminen

Proteiinien lokalisaation seurantaa varten solut istutettiin 35 mm:n MatTek-kammioon (MatTek) 2 päivää ennen kuvantamista ja transfektoitiin ohimenevästi LipofectamineTM LTX -reagenssilla, jossa oli mukana PLUS-reagenssi (Invitrogen), valmistajan ohjeen mukaisesti 18-24 h ennen kuvantamista.

Translaation kuvantamiseksi MCP-Halo-proteiinilla leimatulla mRNA:lla solut istutettiin 35 mm:n MatTek-kammioon (MatTek) päivää ennen kuvantamista. Kuvantamispäivänä ennen helmien lataamista MatTek-kammion väliaine vaihdettiin Opti-MEMiin (Thermo Scientific), jossa oli 10 % naudan sikiöseerumia. Plasmidien (smHA-KDM5B-MS2/FB) ja puhdistetun MCP-HaloTag-proteiinin17 seos ladattiin helmiäisillä aiemmin kuvatulla tavalla6,17,26. Lyhyesti sanottuna, kun Opti-medium oli poistettu MatTek-kammiosta, 4 µl plasmidien (1 µg kumpikin) ja MCP-HaloTagin (130 ng) seosta PBS:ssä pipetoitiin solujen päälle ja ~106 µm:n suuruiset lasihelmet (Sigma Aldrich) jaettiin tasaisesti solujen päälle. Tämän jälkeen kammiota koputettiin voimakkaasti seitsemän kertaa, ja Opti-mediumia lisättiin takaisin soluihin. 3 tuntia helmien lataamisen jälkeen solut värjättiin 1 ml:lla 0,2 nM JF646-HaloTag-ligandia48 , joka oli laimennettu fenolipunattomaan täydelliseen DMEM:ään. Solut pestiin 20 minuutin inkubaation jälkeen kolme kertaa fenolipunattomalla täydellisellä DMEM:llä lasihelmien ja sitoutumattomien väriaineiden poistamiseksi. Tämän jälkeen solut olivat valmiita kuvantamista varten.

Translaation kuvantamista varten ilman mRNA-merkintää MatTek-kammioon istutetut solut transfektoitiin ohimenevästi tarvittavilla plasmideilla, smHA-KDM5B-MS2/FB:llä, SunTag-kif18b/Sunin kanssa tai ilman sitä (HA-epitooppi poistettu), käyttäen LipofectamineTM LTX -reagenssia, jossa oli mukana PLUS-koostumusta antava reagenssikastike (Invitrogen), valmistajan ohjeen mukaisesti kuvantamispäivänä. 3 tuntia transfektion jälkeen väliaine vaihdettiin fenolipunattomaan täydelliseen DMEM:ään. Tämän jälkeen solut olivat valmiita kuvantamista varten.

FB-GFP:n puhdistaminen

E. coli BL21 (DE3) pLysS-soluja, jotka oli transformoitu pET23b-FB-GFP:llä, kasvatettiin 37 °C:ssa OD600-tiheyteen 0,6 2xYT-mediassa, joka sisälsi ampisilliiniä (100 mg L-1) ja kloramfenikolia (25 mg L-1) ravistellen. Proteiiniekspression indusoimiseksi lisättiin isopropyyli-β-d-tiogalaktosidia (IPTG) 0,4 mM:n loppupitoisuutena, ja lämpötila laskettiin 18 °C:een. Solut kerättiin 16 tunnin kuluttua sentrifugoimalla ja resuspendoitiin PBS-puskuriin, jota täydennettiin 300 mM NaCl:lla, proteaasi-inhibiittoreilla (ThermoFisher) ja 0,2 mM AEBSF:llä (20 ml L-1 -viljelmä), ja lysoitiin sonikoimalla. Lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla. Supernatantti ladattiin kahteen yhdistettyyn HisTrap HP 5 ml:n kolonniin (GE Healthcare), pestiin ja eluoitiin lineaarisella gradientilla 0-500 mM imidatsolia. POI:ta sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin käyttäen Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO -sentrifugisuodatinyksikköä (EMD Millipore) ja ladattiin kokoa poissulkevaan HiLoad Superdex 200 PG -pylvääseen (GE healthcare) HEPES-pohjaisessa puskurissa (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01 % NP40, 10 % glyseroli ja 1 mM DTT). FB-GFP-proteiinia sisältävät fraktiot kerättiin, konsentroitiin ja varastoitiin -80 °C:ssa, kun ne oli pikapakastettu nestemäisellä typellä.

Immunovärjäys

U2OS-solut transfektoitiin ohimenevästi 4 × HA-mCh-H2B:llä tai 4 × HA-mCh-β-aktiinilla LipofectamineTM LTX -reagenssilla PLUS-reagenssin (Invitrogen) kanssa. 26 tuntia transfektion jälkeen solut fiksoitiin 4 %:n paraformaldehydillä (Electron Microscopy Sciences) 10 minuutin ajan huoneenlämmössä, permeabiloitiin 1 %:ssa Triton 100:aa PBS:ssä, pH 7,4, 20 minuutin ajan, estettiin Blocking One-P:llä (Nacalai Tesque) 20 minuutin ajan ja värjättiin 4 °C:n lämpötilassa yön yli puhdistetulla FB-GFP-proteiinilla (0,5 µg ml-1 10 %:n estopuskurissa). Seuraavana aamuna solut pestiin PBS:llä, ja POI kuvattiin Olympus IX81 -pyörivällä levykonfokaalimikroskoopilla (CSU22-pää) käyttäen ×100 öljyimmersio-objektiivia (NA 1,40) seuraavissa olosuhteissa: 488 nm (0,77 mW; mitattuna objektiivin takimmaisesta polttotasosta; tässä kaikki laserin tehomittaukset vastaavat objektiivin takimmaista polttotasoa) ja 561 nm (0,42 mW) sekventiaalinen kuvaaminen 50 aikapisteen ajan ilman viivettä, 2 × 2 spin rate, 100 ms valotusaika. Kuvat otettiin Photometrics Cascade II CCD-kameralla käyttäen SlideBook-ohjelmistoa (Intelligent Imaging Innovations). Immunovärjäyskuvat tuotettiin keskiarvoistamalla 50 aikapisteen kuvat kullekin kanavalle Fiji64:llä.

Western blots

U2OS-solut transfektoitiin ohimenevästi 4 × HA-mCh-H2B:llä tai 4 × HA-mCh-β-aktiinilla LipofectamineTM LTX -reagenssilla PLUS-reagenssilla. 10 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja lysoitiin 120 µl RIPA-puskurissa, jossa oli cOmplete-proteaasi-inhibiittoria (Roche). 6,5 µl kutakin solulysaattia ladattiin NuPAGETM 4-12 % Bis-Tris-proteiinigeelille (Invitrogen) ja ajettiin 60 minuuttia 100 V:ssa ja 25 minuuttia 200 V:ssa. Proteiinit siirrettiin PVDF-kalvolle (Invitrogen), estettiin estopuskurissa (5-prosenttinen maitojauhe 0,05-prosenttisessa TBS-Tween 20:ssä) 1 tunnin ajan ja värjättiin yön yli joko puhdistetulla FB-GFP-proteiinilla (0,5 µg ml-1 estopuskurissa) tai anti-HA:n vanhempien vasta-aineella 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat #11583816001; 2000-kertainen laimennos loppupitoisuudeltaan 0,5 µg ml-1:n estopuskurissa). Ensisijaista vasta-ainetta 12CA5 inkuboitiin lisäksi 1 h antihiiren vasta-aineella/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; 5000-kertainen laimennus estopuskurissa). POI havaittiin GFP:n fluoresenssista FB-GFP:n osalta tai Alexa 488:sta anti-HA-vasta-aineen osalta Typhoon FLA 9500:lla (GE Healthcare Life Sciences) seuraavissa olosuhteissa: heräteaallonpituus 473 nm, LPB-suodatin (≥510 nm), 300 V:n fotomonistinputki ja 10 µm:n pikselikoko. Leikkaamattomat ja käsittelemättömät western blotit toimitetaan lisäkuvassa 3.

Fluoresenssin palautuminen fotobleachingin jälkeen

FB:n sitoutumisaffiniteetin tutkimiseksi HA-epitooppeihin elävissä soluissa FRAP-kokeet suoritettiin soluilla, jotka transfektoitiin ohimenevästi 4 × HA-mCh-H2B:llä (1,25 µg) ja FB-GFP:llä (1,25 µg) 24 tuntia ennen FRAP:tä. Kuvat otettiin Olympus IX81 -pyörivän levyn konfokaalimikroskoopilla (CSU22-pää), joka oli yhdistetty Phasor-valokuvamanipulaatioyksikköön (Intelligent Imaging Innovations) ja jossa oli ×100-öljyimmersio-objektiivi (NA 1,40). Ennen photobleachingia otettiin 20 tai 10 kuvaa 1 tai 5 sekunnin aikavälein. Kuvat otettiin 488 nm:n laserilla (0,77 mW) 100 ms:n valotusajalla ja sen jälkeen 561 nm:n laserilla (0,42 mW) 15 ms:n valotusajalla. Pyörivä levy asetettiin pyörimisnopeudelle 1 × 1. Pre-FRAP-kuvien ottamisen jälkeen käytettiin p488 nm:n laseria (Phasor-yksiköstä fotobleachingia varten) 17 mW:n teholla 100 ms:n valotusajalla tai 4 mW:n teholla 500 ms:n valotusajalla ympyränmuotoisen alueen fotobleachingiin ytimessä. Fotobleachingin jälkeen otettiin 30 kuvaa ilman viivettä tai 500 ms:n viiveellä, minkä jälkeen otettiin 100 kuvaa 1 s:n viiveellä ja 100 kuvaa 5 s:n viiveellä käyttäen samoja kuvausasetuksia kuin ennen FRAP-kuvausta otetut kuvat. Fotobleached-pisteen fluoresenssin intensiteetti ajan funktiona vietiin Slidebook-ohjelmiston avulla. Ytimen ja taustan fluoresenssin intensiteetti saatiin Fiji64 -ohjelmalla sen jälkeen, kun solujen liikkeet oli korjattu StackReg Fiji -lisäohjelmalla65. FRAP-käyrä ja puolikas saatiin käyttämällä easyFRAP-webiä66 verkkosivuston ohjeiden mukaisesti. Kuvat 4b, d luotiin Mathematica-ohjelmalla (Wolfram Research).

MCP-puhdistus

MCP-HaloTag puhdistettiin immobilisoidulla metalliaffiniteettikromatografialla17. Lyhyesti sanottuna His-merkitty MCP-HaloTag puhdistettiin Ni-NTA-agaroosilla (Qiagen) pakatun kolonnin läpi valmistajan ohjeiden mukaisesti pienin muutoksin. Kiinnostunutta proteiinia ilmentävä E. coli lysoitiin PBS-puskurissa, jossa oli täydellinen proteaasi-inhibiittorien sarja (Roche) ja 10 mM imidatsolia. Hartsi pestiin PBS-pohjaisella puskurilla, joka sisälsi 20 ja 50 mM imidatsolia. Proteiini eluoitiin sitten PBS-puskurissa, jossa oli 300 mM imidatsolia. Eluoitu His-merkitty MCP dialysoitiin HEPES-pohjaisessa puskurissa (10 % glyserolia, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01 % NP-40 detergentti ja 1 mM DTT), pakastettiin nestemäisessä typessä ja varastoitiin -80 °C:n lämpötilassa.

Solujen valmistelu nascent chain -seurantaa varten

Reportaattoriplasmidi smHA-KDM5B-MS2 (Addgene-plasmidi #81085) ja FB-konstruktio transfektoitiin joko transienttisesti ilman MCP-HaloTag-proteiinia tai ladattiin MCP-HaloTag-proteiinilla varustetuilla helmiäisillä 35 mm:n MatTek-kammioihin istutettuihin U2OS-soluihin 4-6 h ennen kuvantamista. Jos MCP-HaloTag-proteiiniin oli ladattu helmi, solut värjättiin 3 tuntia myöhemmin JF646-HaloTag-ligandilla, minkä jälkeen ne pestiin fenolipunattomalla täydellisellä DMEM-medialla. Jos MCP-HaloTag-proteiinia ei tarvittu, solujen väliaine vaihdettiin fenolipunattomaan täydelliseen DMEM-mediaan 3 h transfektion jälkeen. Tämän jälkeen solut olivat valmiita kuvantamista varten.

Multipleksoitua kuvantamista varten kaksi reportteriplasmidia, smHA-KDM5B-MS2 ja SunTag-kif18b, sekä kaksi koetinta, FB-mCh ja Sun-GFP (josta oli poistettu HA-epitooppi), transfektoitiin ohimenevästi U2OS-soluihin, jotka oli sijoitettu MatTek-kammioon 4-6 tuntia ennen kuvantamista. Kolme tuntia myöhemmin solujen väliaine vaihdettiin fenolipunattomaan täydelliseen DMEM-mediaan. Tämän jälkeen solut olivat valmiita kuvantamista varten.

Kuvantamisolosuhteet translaatio- ja kolokalisaatiomäärityksiä varten

Yksittäisten mRNA:iden ja niiden translaatiotilanteen kuvantamiseksi FB:llä käytettiin räätälöityä laajakenttäfluoresenssimikroskooppia, joka perustui kallistettuun valaistussuunnitelmaan (HILO)17,67. Lyhyesti sanottuna herätesäteet, 488, 561 ja 637 nm:n kiinteän tilan laserit (Vortran), kytkettiin ja fokusoitiin akselin ulkopuolella objektiivin (APON 60XOTIRF, Olympus) takimmaiseen polttotasoon. Kaikki ilmoitetut lasertehot mitattiin objektiivin takafokaalitasosta. Emissiosignaalit jaettiin kuvantamislaatuisella, erittäin litteällä dikropeilillä (T660lpxr, Chroma). Jakamisen jälkeen pidemmät emissiosignaalit (kaukopunainen) johdettiin kaistanpäästösuodattimen läpi (FF01-731/137-25, Semrock). Lyhyemmät emissiosignaalit (punainen ja vihreä) johdettiin jakamisen jälkeen joko punaisen kaistanpäästösuodattimen (FF01-593/46-25, Semrock) tai vihreän kaistanpäästösuodattimen (FF01-510/42-25, Semrock) läpi, joka oli asennettu suodatinpyörään (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). Pidemmät (kaukopunainen) ja lyhyemmät (punainen ja vihreä) emissiosignaalit havaittiin kahdella erillisellä EM-CCD-kameralla (iXon Ultra 888, Andor) tarkentamalla 300 mm:n akromaattisella kaksoislinssillä (AC254-300-A-ML, Thorlabs). Olympuksen ×60-objektiivin, 300 mm:n putkilinssin ja iXon Ultra 888:n yhdistelmällä saadaan ×100-kuva 130 nm:n pikselillä-1. Lämpötilaa (37 °C), kosteutta ja 5 %:n hiilidioksidipitoisuutta (Okolab) säätelevä inkubaattori on varustettu pietsosähköisellä lavalla (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) elävien solujen kuvantamista varten. Laserit, kamerat, pietsosähköinen lava ja suodatinpyörä synkronoitiin avoimen lähdekoodin mikrokontrollerilla, Arduino Mega -levyllä (Arduino). Kuvantaminen suoritettiin avoimen lähdekoodin Micro-Manager-ohjelmistolla (1.4.22)68.

Kuvakoko asetettiin keskelle 512 × 512 pikseliä2 (66,6 × 66,6 µm2) ja kameran integrointiaika 53,64 ms. Kameroiden lukuaika kuvantamiskoon, lukutilan (30 MHz) ja pystysuuntaisen siirtymänopeuden (1,13 µs) yhdistelmästä oli 23,36 ms, jolloin kuvantamisnopeutemme oli 13 Hz (70 ms kuvaa kohti). Punaisia ja vihreitä signaaleja kuvattiin vuorotellen. Emissiosuodattimen asentoa muutettiin kameran lukuaikana. Läpilyönnin minimoimiseksi kaukopunainen signaali kuvattiin samanaikaisesti vihreän signaalin kanssa. Solujen koko paksuuden kuvaamiseksi kuvattiin 13 z-pinoa 500 nm:n askelkoolla (yhteensä 6 µm) pietsosähköisellä lavalla. Tämä johti siihen, että solujen kokonaiskuvausnopeutemme oli 1 Hz kuvattaessa joko punaista tai vihreää signaalia ja 0,5 Hz kuvattaessa sekä punaista että vihreää signaalia riippumatta kaukopunakuvauksesta.

Kuvissa 1c, d, 2a, e kuvattiin solujen yhtä tasoa yhtäjaksoisesti 6,5 Hz:n taajuudella 100 aikapisteen ajanjakson ajan, ja se keskiarvoistettiin koko ajanjakson ajalta (laserit: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (kuva 1c), 90 µW (kuva 1d), 19 µW (kuva 2a), 155 µW (kuva 2e); 637 nm, 220 µW). Kuvassa 2b (vasemmalla) solua kuvattiin jatkuvasti 0,5 Hz:n taajuudella, 488 nm:n (100 µW) ja 561 nm:n (10 µW) lasereilla 13 z-patsaalla jokaista aikapistettä kohti ja keskiarvoistettiin koko ajan. Saadut 13 z-pinon keskiarvot dekonvolvoitiin Fiji-ohjelmalla. Kuvissa 6b, c, e ja f soluja kuvattiin 10 sekunnin välein 13 z-pinolla aikapistettä kohti (laserit: 488 nm, 13 µW (kuva 6b), 18 µW (kuva 6c); 561 nm, 172 µW (kuva 6f); 637 nm, 150 µW (kuvat 6b, c), 35 µW (kuva 6e)). Kuvassa 7b solua kuvattiin jatkuvasti 0,5 Hz:n taajuudella 13 z-pinolla jokaista ajanhetkeä kohti (laserit: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). Kuvassa 8b soluja kuvattiin 14 sekunnin välein 13 z-pinolla joka aikapisteessä (laser: 488 nm, 70 µW). Kuvassa 8c soluja kuvattiin 40 sekunnin välein 13 z-pinolla jokaisessa aikapisteessä (laser: 488 nm, 130 µW). Moottoroitujen translaatiopisteiden nopeuden määrittämiseksi (kuva 8e) neuronit kuvattiin jatkuvasti 1 Hz:n taajuudella 13 z-patsaalla joka aikapisteessä.

Kuvissa 2b (oikealla) ja 2c ko-lokalisaatio kuvattiin edellä kuvatulla Olympus IX81 -pyörivän levyn konfokaalimikroskoopilla (CSU22-pää) käyttäen ×100-öljyimmersio-objektiivia (NA 1,40) seuraavissa olosuhteissa: 488 nm:n (0,77 mW) ja 561 nm:n (0,42 mW) peräkkäinen kuvaaminen viiden aikapisteen ajan ilman viivettä useilla z-viipaleilla koko solurungon peittämiseksi kunkin aikapisteen osalta, 1 × 1 pyörimisnopeus, valotusaika säädetty solun kirkkauden mukaan. Kuvat otettiin Photometrics Cascade II CCD-kameralla käyttäen SlideBook-ohjelmistoa (Intelligent Imaging Innovations). Kuvissa näkyvät kuvat luotiin laskemalla keskiarvo viidestä aikapisteestä, minkä jälkeen kaikkien z-viipaleiden maksimiprojektio suoritettiin Fiji64:llä.

Translaatiokohtien hiukkasseuranta

Yksittäisten translaatiokohtien havaitseminen ja seuranta suoritettiin maksimi-intensiteettiprojektiokuvista mukautetulla Mathematica (Wolfram Research) -koodilla17. Lyhyesti sanottuna kuvat käsiteltiin kaistanpäästösuodattimella hiukkasten korostamiseksi, minkä jälkeen ne binarisoitiin niiden intensiteettikeskipisteiden havaitsemiseksi sijainteina käyttämällä sisäänrakennettua Mathematica-rutiinia ComponentMeasurements. Havaittuja hiukkasia seurattiin ja yhdistettiin ajallisesti lähimmän naapurin haun avulla. MRNA:iden ja translaatiokohtien tarkat koordinaatit (superresolved-paikat) määritettiin sovittamalla (käyttämällä sisäänrakennettua Mathematica-rutiinia NonlinearModelFit) alkuperäiset kuvat 2D Gaussin kuviin, jotka olivat seuraavan muotoisia:

jossa IBG on taustafluoresenssi, I hiukkasen voimakkuus, (x0, y0) hiukkasen sijainti ja (σx, σy) leviää hiukkasesta. Kahden kameran välinen siirtymä rekisteröitiin käyttämällä sisäänrakennettua Mathematica-rutiinia FindGeometricTransform, jolla löydettiin muunnosfunktio, joka parhaiten sovitti 100 nm:n halkaisijaltaan olevien Tetraspeck-helmien sovitetut sijainnit tasaisesti levittäytyneinä eri puolille kuvakenttää.

Kuvissa 6c, e, f, 7c, 8b, d hiukkaset seurattiin räätälöidyillä Mathematica-koodeilla, ja ne piirrettiin edelleen Mathematicalla. Kuvassa 7c keskimääräiset keskimääräiset neliösiirtymät laskettiin Gaussin sovitetuista koordinaateista (2D maksimi-intensiteettiprojektiokuvista). Diffuusiovakio saatiin sovittamalla viisi ensimmäistä aikapistettä suoralle, jonka kaltevuus on m = 4D, jossa D on diffuusiokerroin. Yksittäiset moottoroidut translaatiopisteet (kuva 8e) seurattiin Fiji-lisäosalla TrackMate69 maksimiprojektion jälkeen ja piirrettiin edelleen Mathematica-ohjelmalla. Kaikki Mathematica-koodi on saatavana pyydettäessä.

1×HA-merkittyjen proteiinien yksittäisten molekyylien seuranta soluissa

Päivää ennen kuvantamista solut istutettiin MatTek-kammioon ja transfektoitiin transienttisesti 1 × HA-mCh-H2B:llä ja FB-Halolla käyttäen LipofectamineTM LTX -reagenssia, jossa oli mukana PLUS-reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 3 tuntia transfektion jälkeen väliaine vaihdettiin täydelliseen DMEM:ään. Ennen kuvantamista solut värjättiin natriumboorihydridillä (NaBH4) käsitellyllä Halo-ligand TMR:llä (Promega)45 . Lyhyesti sanottuna 1 µl 1 mM Halo ligand TMR -väriainetta pelkistettiin 10 minuutin ajan 200 µl:ssa 50 mM NaBH4-liuosta (esiliuotettu PBS:ään 10 minuutin ajan, pH 7,4). Seuraavaksi 200 µL pelkistettyä TMR:ää laimennettiin 800 µL:lla fenolipunavapaata DMEM:ää, jotta saatiin 1 ml pelkistettyä TMR-mediaa. Transfektoitujen solujen väliaine korvattiin pelkistetyllä TMR-medialla, minkä jälkeen solut asetettiin inkubaattoriin (5 % CO2, 37 °C) 30 minuutiksi värjäystä varten. Tämän jälkeen solut pestiin kolme kertaa fenolipunattomalla DMEM:llä. Pesujen välillä soluja inkuboitiin 5 minuutin ajan inkubaattorissa (5 % CO2, 37 °C).

Solut kuvattiin räätälöidyllä laajakenttäisellä fluoresenssimikroskoopilla, joka perustui kallistettuun valaistukseen (HILO)17,67. Kuvantamisen näkökenttä asetettiin 256 × 256 pikseliin2 (33,3 × 33,3 µm2), ja kameran integrointiaika asetettiin 30 ms:ksi. Soluja kuvattiin 7,7 mW:n 561 nm:n laserilla kuvausnopeudella 43,8 ms kuvaa kohti yhteensä 10 000 aikapisteen ajan (7,3 min). Kuvantamisen aikana 6,2 mW 405 nm:n laseria käytettiin 50 ms:n ajan kerran 10 s:n välein Halo-TMR:n pelkistetyn ligandin fotoaktivoimiseksi. Yksittäisiä molekyylejä seurattiin käyttämällä Fiji-lisäosaa TrackMate69 . Jotta voitiin varmistaa, että jäljet edustavat 1 × HA-mCh-H2B:hen sitoutunutta FB-Haloa, jäljet suodatettiin edelleen Mathematicassa. Suodattimella poistettiin jäljet, joiden pituus oli alle 16 ruutua. Lisäksi kaikkien ruutujen välisten hyppyjen oli oltava alle 220 nm:n pituisia. Tätä kriteeriä ovat käyttäneet muutkin erottamaan kromatiiniin sitoutuneet transkriptiotekijät sitoutumattomista46. Lopuksi Mathematicassa raidat värikoodattiin joko sen mukaan, milloin ne otettiin (kuten täydentävässä kuvassa 5), tai ruutujen välisten hyppyjen keskimääräisen koon mukaan (kuten kuvassa 5).

Puromysiinihoito

U2OS-solut, jotka transfektoitiin ohimenevästi smHA-KDM5B-MS2:lla ja FB:llä, tai joihin ladattiin helmi, jossa oli smHA- KDM5B-MS2:ta, FB:tä ja MCP-Halo-Tagia, kuvattiin edellä kuvatulla tavalla siten, että ruutujen välissä pidettiin 10 sekunnin välein. Kun 5 tai 10 aikapistettä oli otettu esikäsittelykuvina, soluja käsiteltiin 0,1 mg ml-1 puromysiinin loppupitoisuudella juuri ennen 6. tai 11. aikapisteen ottamista. Puromysiinin lisäämisen jälkeen soluja kuvattiin samoissa olosuhteissa kuin esikäsittelykuvauksessa, kunnes translaatiopisteet hävisivät.

Neuroniviljely ja transfektio

Kissan aivokuoren neuronit saatiin alkion päivän (E)18 sikiöiden hylätyistä aivokuoreista, jotka oli aiemmin leikelty hippokampuksen saamiseksi, ja ne pakastettiin Neurobasal-väliaineessa (ThermoFisher Scientific), joka sisälsi 10 % nautaeläinten sikiöseerumia (FBS, Atlas Biologicals) ja 10 % dimetyylisulfoksidia (Sigma-Aldrich, D8418) nestemäisessä typpilannoitteessa. Kylmäkonservoidut rottien kortikaaliset neuronit istutettiin tiheydellä ∼15 000-30 000 solua/cm2 MatTek-maljoille (MatTek) ja niitä viljeltiin Neurobasal-väliaineessa, joka sisälsi 2 % B27-lisäainetta (ThermoFisher Scientific), 2 mM l-alaniinia/l-glutamiinia ja 1 % FBS:ää (Atlas Biologicals). Transfektiot suoritettiin 5-7 vuorokauden viljelyn jälkeen Lipofectamine 2000:lla (ThermoFisher Scientific) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neuronit, jotka ekspressoivat 4 × HA-mRuby-Kv2.1:tä ja FB-GFP:tä yhdessä, kuvattiin 1-2 päivää transfektion jälkeen (kuva 2b). Neuronit, jotka ilmentävät samanaikaisesti smHA-Kv2.1:tä ja FB-GFP:tä, kuvattiin 1-7 päivää transfektion jälkeen (täydentävä kuva 2 vasemmalla). Translaatiomäärityksiä varten neuronit kuvattiin 4-12 tuntia transfektion jälkeen. Kaikki neuronien kuvantamiskokeet suoritettiin lämpötilakontrolloidussa (37 °C), kostutetussa, 5 % CO2-ympäristössä Neurobasal-mediassa ilman fenolipunaista (ThermoFisher Scientific). Neuronin identiteetti varmistettiin seuraamalla kuvattavasta solurungosta lähteviä prosesseja satojen mikronien matkalta, jotta voitiin varmistaa, että ne olivat todellisia neuriitteja.

Seeprakalan kehityksen seuranta

Kaikki seeprakalojen kokeet on hyväksynyt Tokyo Techin geneettisten kokeiden turvallisuustoimikunta (I2018001), ja eläinkäsittelyssä toimitaan ohjeiden mukaisesti. FB-GFP:n visualisoimiseksi seeprakalan alkiossa valmistettiin mRNA:t FB-GFP:lle ja N × HA-mCh-H2B:lle. FB-GFP:tä ja N × HA-mCh-H2B:tä koodaavat DNA-fragmentit lisättiin T7-promoottoria ja poly A70:tä sisältävään plasmidiin. Seuraavat plasmidit (T7-FB-GFP ja T7-N × HA-mCh-H2B) linearisoitiin XbaI-restriktiokohdalla in vitro -transkriptiota varten käyttäen mMESSAGE mMACHINE kittiä (ThermoFisher Scientific). RNA puhdistettiin RNeasy Mini Elute Cleanup Kitillä (QIAGEN) ja resuspendoitiin veteen. Ennen mikroinjektiota seeprakalan (AB) munat dechorionoitiin liottamalla 2 mg ml-1 pronaasissa (Sigma Aldrich; P5147) 0,03 % merisuolassa 10 minuutin ajan. Seos (~0,5 nL), joka sisälsi mRNA:ta (200 pg kumpaakin FB-GFP:lle ja N × HA-mCh-H2B:lle), ruiskutettiin 1-soluisen alkion keltuaiseen (lähellä soluosaa). Negatiivista kontrollia varten HA-mCh-H2B-mRNA jätettiin pois. 5-10 minuuttia mRNA-injektion jälkeen injektoitiin Cy5-merkitty Fab, joka on spesifinen endogeeniselle histoni H3 Lys9 -asetylaatiolle (CMA310)25 (100 pg ~0,5 nl:ssa). Injektoituja alkioita inkuboitiin 28 °C:ssa neljän solun vaiheeseen asti ja upotettiin 0,5 % agaroosiin (Sigma Aldrich, A0701) 0,03 %:n merisuolassa eläimen napa alaspäin 35 mm:n lasipohjalevylle (MatTek). Fluoresenssikuvat kerättiin konfokaalimikroskoopilla (Olympus; FV1000), joka oli varustettu lämmitetyllä lavalla (Tokai Hit), joka oli asetettu 28 °C:een, ja UPLSAPO ×30 silikoniöljy-immersio-objektiivilla (NA 1,05), jota käytettiin FV1000:n sisäänrakennetulla FLUOVIEW ver.4.2 -ohjelmistolla. Kolme värikuvaa otettiin peräkkäin 5 minuutin välein käyttäen 488, 543 ja 633 nm:n lasereita (640 × 640 pikseliä; 0,662 µm pikseli-1, reikä 800 μm; 2,0 μs pikseli-1) ilman keskiarvoistusta. Maksimi-intensiteettiprojektiot luotiin 20 z-pinosta 5 μm:llä.

Seeprakalan alkioiden sisällä olevia ytimiä seurattiin 4D:ssä käyttäen Fiji-lisäosaa TrackMate69. Tulokset jälkikäsiteltiin ja piirrettiin Mathematica-ohjelmalla. Ytimien lukumäärän ja pinta-alan sekä keskimääräisen ydin-, sytoplasma- ja ydin:sytoplasma-intensiteetin kvantifioimiseksi ajan funktiona mitattiin kaikkien ytimien intensiteetti maksimi-intensiteettiprojektioissa käyttämällä sisäänrakennettua Mathematica-funktiota ComponentMeasurements. ComponentMeasurements vaatii mitattavien kohteiden binäärimaskit. Ytimien binäärimaskit tehtiin käyttämällä sisäänrakennettua Mathematica-funktiota Binarize ja sopivaa intensiteettikynnystä, jotta Cy5-merkitystä Fabista (joka on spesifinen endogeeniselle histoni H3 Lys9 -asetylaatiolle) otetuissa kuvissa saatiin esiin vain ytimet. Kunkin ytimen ympärillä olevan sytoplasman maskit tehtiin laajentamalla ydinmaskeja 4 pikselillä (käyttämällä sisäänrakennettua komentoa Dilation) ja vähentämällä sitten laajentuneesta maskista alkuperäiset ydinmaskit, joita oli laajennettu 1 pikselillä. Näin luotiin kunkin ytimen ympärille rengasmaiset maskit, joista mitattiin keskimääräinen sytoplasman intensiteetti.

Pintaplasmoniresonanssi

Puhdistetun FB:n sitoutumiskinetiikka HA-epitooppimerkkiin mitattiin pintaplasmoniresonanssilla (OpenSPR, Nicoyalife). Kun biotiini-leimattu HA-peptidi oli vangittu Streptavidiini-anturisirulla (Nicoyalife), laimennettua puhdistettua FB-GFP:tä PBS-juoksupuskurissa, pH 7,4, virrattiin hitaasti anturisirun yli 5 minuutin ajan vuorovaikutuksen mahdollistamiseksi. Tämän jälkeen juoksevan puskurin annettiin virrata 10 minuutin ajan dissosiaatiotietojen keräämiseksi. Epäspesifinen sitoutumiskäyrä saatiin virtaamalla sama FB-GFP-konsentraatio samassa juoksutuspuskurissa toisen Streptavidiini-anturisirun yli (Nicoyalife). Kontrolliaineisto kerättiin täsmälleen kuten kokeessa. FB-GFP:n 100 ja 30 nM:n kohdalla sitoutumisvaste oli huomattavasti suurempi kuin kontrollissa, ja ei-spesifinen sitoutumisvuorovaikutus oli mitätön. Siksi valitsimme nämä kaksi pitoisuutta sitoutumiskinetiikan sovittamista varten. Kun kontrolli oli vähennetty, saatiin signaalivaste vs. aika -käyrä, joka on esitetty täydentävässä kuvassa 4. Sitoutumiskineettiset parametrit saatiin sovittamalla käyrä yksi-yksi-sitoutumismalliin TraceDrawer-ohjelmistolla (Nicoyalife) (Supplementary Fig. 4).

Raportointiyhteenveto

Lisätietoa tutkimussuunnittelusta on saatavissa tämän artikkelin yhteydessä linkitetystä Nature Research Reporting Summary -julkaisusta.