Tavanomainen lähestymistapa geenien toiminnan tutkimiseen on lisätä tai inaktivoida geeni soluun tai yksilöön ja tarkkailla muutoksia solun biologisessa käyttäytymisessä tai yksilön fenotyypeissä geenin toiminnan tunnistamiseksi.

Siten geenin toiminnan tutkiminen voidaan suorittaa seuraavien kahdenlaisten strategioiden mukaisesti:

• Funktion menetys

• Funktion voitto

Funktion menetys

Geenin tyrmäys (knockout) on yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä, joiden avulla voidaan tutkia hiirillä tapahtuvaa toiminnon menetystä. Geenien knockout tarkoittaa kohdegeenien biologisten toimintojen selvittämistä tutkimalla organismeja, jotka kantavat inaktivoituja (knocked out) kohdegeenejä. Tämä tekniikka edellyttää, että kohdegeenien osasekvensseihin tehdään muutoksia, jotka poistavat tiettyjen geenien toiminnot käytöstä ja siten inaktivoivat kohdegeenin toiminnan osittain tai kokonaan. Geenin tyrmäys voidaan jakaa edelleen tavanomaiseen geenin tyrmäykseen ja ehdolliseen geenin tyrmäykseen.

Tavanomainen geenin tyrmäys

• Tavanomainen tyrmäys (lyhenne: KO) tarkoittaa tiettyjen elintärkeiden eksonien, kohdegeenin funktionaalisten domeenien tai jopa kaikkien eksonien tyrmäystä kaikissa hiiren soluissa, jolloin kohdegeenin ilmentyminen lakkaa.

• KO-hiiret kantavat muokattuja kohdegeenisekvenssejä kaikissa kudoksissa ja soluissa. Kohde-geenit eivät ekspressoidu homotsygoottisissa hiirissä

• KO-hiiriä käytetään yleensä tutkimaan kohde-geenien tai proteiinien toimintojen vaikutuksia fysiologiaan tai patologiaan.

Conditional Gene knockout

• Conditional Knockout (lyhenne: CKO) on hiiren genomin ajallista ja spatiaalista spesifistä muokkaamista rajoittamalla geeninmuokkaus hiiren tiettyihin tiettyihin solutyyppeihin tai tiettyyn kehitysvaiheeseen

• Geenin kohdentamista käytetään CKO-hiirissä siten, että kohdegeenin yhden tai useamman tärkeän eksonin kylkeen sijoitetaan loxP-paikkoja. Kohdegeenin ilmentyminen oli normaalia ennen risteytystä Cre-rekombinaasia ilmentävän kannan kanssa. Risteytettäessä Cre-rekombinaasia ilmentävien siirtogeenisten hiirten kanssa kohdegeeni voidaan tyrmätä tietyssä kudoksessa tai solutyypissä, ja sen ilmentyminen säilyy normaalina muissa kudoksissa tai solutyypeissä.

• CKO-hiiriä käytetään yleensä sellaisten geenien tutkimiseen, jotka aiheuttavat alkion letaliteettia, kohdegeenien tai -proteiinien toimintoja tietyssä kudoksessa tai solutyypissä tai kohdegeenien tai -proteiinien roolia tietyssä ajanjaksossa tai vaiheessa.

Tapaus: Drd2 KO- ja Drd2 CKO-hiirimallien käyttö aivojen immuunivasteen tutkimuksessa

Gain of function

Tutkimus geenin toiminnasta havainnoimalla muutoksia solun tai yksilön biologisissa ominaisuuksissa, joihin kohdegeeni oli tuotu tuottamaan uutta tai korkeampaa ilmentymistasoa.

Sattumanvarainen siirtogeeni

Sattumanvarainen insertiotransgeneesi on eksogeenisen geenin satunnaista integroimista hiiren genomiin sellaisten hiirimallien tuottamiseksi, joilla on kohdegeenin yliekspressio. Sitä käytetään tutkimaan kohdegeenin yliekspression vaikutuksia fysiologiaan ja patologiaan.

Kohdegeenin yliekspressio

Eksogeeninen DNA-sekvenssi ekspressoituu hiirissä stabiilisti sen jälkeen, kun se on kolhiintunut hiiren Gt (ROSA) 26Sor- eli niin sanottuun Rosa26-geenin lokukseen. Eksogeenisen geenin ekspressio voi olla myös kudosspesifistä tai lääkeaineindusoitua.

• Käytetään geenin ja proteiinin toiminnan yliekspressiokokeisiin

• Voidaan käyttää KO-fenotyyppien pelastuskokeisiin

geenin knock-in

Knock-in (lyhenne: KI) tarkoittaa spesifisten mutaatioiden tai eksogeenisten DNA-sekvenssien tuomista kohdegeenin paikkaan.

(1) Emäsmutaation tuominen kohdegeeniin ihmisen geneettisen sairauden mallin jäljittelemiseksi.

(2) Reportterigeenin, kuten EGFP:n, RFP:n, mCherryn, YFP:n, LacZ:n ja luciferaasin tuominen hiiren endogeeniseen geeniin kohdegeenin ilmentymismallin havainnoimiseksi.