NS2B-NS3-proteaasi

Kohteena olevan proteiinin kolmiulotteista rakennetta koskevat tiedot (3D-tiedot) on todettu lääkeaineiden keksimisen tärkeimmäksi edellytykseksi. Sekä röntgenkristallografisia rakenteita että kohdeproteiineille luotuja homologisia malleja on käytetty potentiaalisten ligandien tunnistamiseen kemiallisista tietokannoista, mutta 3D-kiteisten rakenteiden on dokumentoitu olevan tehokkaampia kuin in silico luotujen homologisten mallien. Siksi DENV NS2B-NS3 -proteaasin 3D-rakenne, jota on ehdotettu tärkeäksi terapeuttiseksi kohteeksi DENV-infektiota vastaan, haettiin proteiinidatapankista (PDB) PDB ID:2FOM40. NS2B-NS3pro:n kiderakenne erotettiin 1,5 Å:n resoluutiolla, ja siinä näkyi kaksi proteiiniketjua, eli ketju A, joka on taittunut muodostamaan NS2B-kofaktorin, ja ketju B, joka käsittää NS3pro-domeenin (kuva 2a). Tässä ketjun B proteaasidomeeni (NS3pro) (kuva 2b) valittiin rakenteeseen perustuvaan virtuaaliseen seulontaan G. lucidum -kasvintuhoojasta peräisin olevien valittujen triterpenoidien avulla.

3D-rakenne DENV:n NS2B-NS3-proteaasista: (a) nauhakaavio kahdesta proteiiniketjusta; ketju A (vihreä väri) kuvaa NS2B-kofaktoria ja ketju B (punainen väri) NS3pro-domeenia, ja (b) graafinen esitys DENV-proteaasin NS3pro-domeenista, johon on merkitty aminohappojäännösten kokonaislukumäärä, atomit, raskaat atomit ja nettovaraukset sekä ennustetut sekundäärirakenteen elementit (putki = alfakierre, nuolet = beeta-arkit).

Virtuaaliseulonta ja telakointisimulaatioanalyysi

Viime aikoina rakenteeseen perustuva virtuaaliseulonta on saavuttanut suosiota uusien johtavien yhdisteiden löytämiseksi suurista bioaktiivisista kemiallisista kirjastoista valittuja kohteita vastaan. Tähän lähestymistapaan kuuluu ligandien simuloitu telakointi valitun reseptorin aktiivisen kohdan alueelle, minkä jälkeen inhibiittorit asetetaan paremmuusjärjestykseen ja pisteytetään23. Tässä työssä suoritimme 22 tunnetun G. lucidum -kasvintuhoojasta peräisin olevan triterpenoidin rakennepohjaisen virtuaaliseulonnan NS3pro:ta vastaan Schrodinger-sarjan Glide-moduulin avulla (taulukko S1). Näitä inhibiittoreita analysoitiin edelleen Glide-moduulin XP-dockausprotokollalla, jotta saatiin tietoa sitoutumisenergiasta ja muista sitoutumismalleista aktiivisen keskuksen jäännösten kanssa. Havaittiin, että kaikilla valituilla triterpenoideilla oli merkittävä sitoutumisaffiniteetti NS2B-NS3pro:ta kohtaan lukuun ottamatta ganoderiinihappoa G (taulukko S1). Myös referenssi-inhibiittorin 1,8-dihydroksi-4,5-dinitroantrakinonin molekyylidockaus samaa aktiivista aluetta vastaan tuotti telakointipisteeksi -5,377 kcal/mol. Tämän vuoksi molekyylivuorovaikutusanalyysiin valittiin triterpenoidit, joiden telakointipisteet olivat paremmat kuin -5 kcal/mol-kynnysarvo. Valitsimme yhteensä neljä triterpenoidia eli ganodermanontriolin (-6,291 kcal/mol), lucidumoli A:n (-5,993 kcal/mol), ganoderiinihappo C2:n (-5,948 kcal/mol) ja ganosporeriinihappo A:n (-5,830 kcal/mol) mahdollisiksi DENV-proteaasin NS3pro-domeenin estäjiksi. Näitä telakointipisteitä pidettiin merkittävinä verrattuna tunnettuun inhibiittoriin 1,8-dihydroksi-4,5-dinitroantrakinoniin (-5,377 kcal/mol) ja raportoituihin bioaktiivisiin molekyyleihin nimbiiniin (-5,56 kcal/mol), desasetyylinimbiiniin (-5,24 kcal/mol) ja desasetyylisalanniiniin (-3,43 kcal/mol), jotka on saatu Azadirachta indicasta ja joilla on yhteistoimintaa DENV NS3pro:n kanssa41. Nämä tulokset osoittavat G. lucidumista peräisin olevien bioaktiivisten triterpenoidien potentiaalia DENV-proteaasin estäjinä ja viittaavat siihen, että niitä voitaisiin käyttää DENV-infektion viruslääkkeiden kehittämisessä.

Molekulaarinen vuorovaikutus- ja MM/GBSA-analyysi

Koska proteiini-ligandi-dokkeeratuissa komplekseissa esiintyvistä molekyylikontakteista voidaan saada parempi käsitys biologisten systeemien molekyylimekanismeihin liittyvistä mekanismeista,42 tutkittiin myös molekyylikontaktiprofiilien profilointia valituille triterpenoideille ja referenssi-inhibiittorille, jotka toimivat yhdessä DENV-proteaasin kanssa. NS3pro-Ganodermanontrioli-kompleksilla oli vuorovaikutusta maltillisilla yksinkertaisilla ja kaksinkertaisilla vetysidoksilla aktiivisella alueella Lys73- (3 Å), Thr120- (2,94 Å) ja Asn167- (3,26 Å, 2,86 Å) jäämien kanssa. NS3pro-Ganodermanontrioli-kompleksissa havaittiin myös muita hydrofobisia vetovoimatekijöitä jäämien Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 ja Ala164 kohdalla. Myös jäämillä His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167 ja Gly153 oli polaarisia ja glysiinivuorovaikutuksia ganodermanontriolin kanssa. NS3pro-Ganodermanontriolin telakoituneessa kompleksissa havaittiin myös positiivisen (Lys73 ja Lys74) ja negatiivisen varauksen (Asp75) vuorovaikutuksia jäännösten kanssa (Kuva 3a,b).

NS3pro-domeenin 3D- ja 2D-dockatut kompleksit, joissa näkyy molekyylien välisiä kontakteja vastaavien seulottujen triterpenoidien kanssa; (a,b) NS3pro-Ganodermanontrioli-kompleksi, (c,d) NS3pro-Lucidumol A-kompleksi, (e,f) NS3pro-Ganoderiinihappo C2 (g,h) NS3pro-Ganosporeric acid A. 2D-komplekseissa vihreällä, violetilla, punaisella, sinisellä ja harmaalla värillä merkityt jäännökset edustavat vastaavasti hydrofobista, positiivista, negatiivista, polaarista ja glysiinivuorovaikutusta, ja vaaleanpunaiset nuolet osoittavat vetysidoksen muodostumista.

NS3pro-Lucidumol A:n vuorovaikutusprofiileissa näkyi kaksi yksittäistä vetysidosta, jotka muodostuivat jäännösten Asp75 (3,31 Å) ja Asn152 (2,48 Å) kanssa, ja kaksinkertaisten vetysidosten muodostuminen Gly153:n kohdalla (2,11 Å, 2,84 Å), mikä edistää myös glysiinivuorovaikutusta glysiiniä sisältävän glysiinin kanssa. Lisäksi telakoituneessa kompleksissa havaittiin hydrofobisia (Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 ja Tyr161) ja polaarisia vuorovaikutuksia (His51, Ser135 ja Asn152). Asp75:llä on negatiivisia varausvuorovaikutuksia proteaasin aktiivisessa taskussa Lucidumol A:n kanssa (kuva 3c,d). Myös NS3pro:n kanssa telakoidussa ganoderiinihappo C2:n kompleksissa havaittiin kohtalaista kaksoisvetysidosten muodostumista Gly151:n kanssa (2,73 Å, 3,12 Å), kun taas yksinkertaisten vetysidosten muodostumista havaittiin jäännösten Trp50 (2,66 Å) ja Arg54 (1,93 Å) kanssa. Lisäksi tässä kompleksissa havaittiin myös suolasillan muodostumista ganoderiinihapon C2:n hydroksyyliryhmän ja proteaasin Arg54-jäännöksen välillä. Lisäksi NS3pro-Ganoderiinihappo C2 -kompleksissa havaittiin myös polaarisia (His51- ja Asn152-jäännös), negatiivisia (Asp75-jäännös) ja positiivisia (Arg54-jäännös) vuorovaikutuksia (kuvat 3e,f). NS3pro-Ganosporeriinihappo A:n telakoituneessa kompleksissa havaittiin kolme yksittäistä vetysidosta, jotka muodostuivat Thr120-, Asn152- ja Asn167-jäännösten kohdalle, kun taas Trp50-, Val72-, Ile123-, Val154-, Val155- ja Ala164-jäännösten kohdalla havaittiin hydrofobisia vuorovaikutussuhteita (kuvat 3g,h). Lisäksi ganosporeriinihappo A:n kanssa telakoidulla NS3pro:lla oli polaarisia (jäännökset Thr118, Asn119, Thr120, Asn152 ja Asn167), positiivisia (Lys73 ja Lys74) ja negatiivisia varauksellisia vuorovaikutuksia (Asp75).

Lisäksi referenssi-inhibiittori 1,8-dihydroksi-4,5-dinitroantrakinoni telakoitiin NS3pro-proteaasin aktiiviseen kohtaan, ja merkittävät vuorovaikutukset rekisteröitiin. Tässä kompleksissa on havaittavissa yksittäisen vetysidoksen muodostumista Phe130-jäännöksen kohdalla, kun taas His51:llä havaittiin suolasilta- ja pi-pi-vuorovaikutus inhibiittorin kanssa. Lisäksi telakoituneessa kompleksissa havaittiin myös hydrofobisia (Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 ja Tyr151), polaarisia (His51, Ser131 ja Ser135) ja glysiini- (Gly151 ja Gly153) vuorovaikutuksia.

Johtopäätöksenä todettiin, että kaikilla seulotuilla triterpenoideilla oli vetysidoksia NS3pro:n kanssa katalyyttisen triadin (His51-, Asp75- ja Ser135-jäännös) kohdalla sekä joidenkin muiden konservoitujen jäännösten (Phe130, Tyr150, Asn152 ja Gly153) kohdalla, joiden on raportoitu olevan merkittävässä roolissa substraatin sitoutumisessa DENV:n proteaasille43,44. Lisäksi joitakin muita jäännöksiä kirjattiin myös vetysidosten jakamiseksi eri ligandien kanssa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että ligandin ja jonkin NS3pro:n katalyyttisen triadin jäännöksen väliset vetysidokset voivat häiritä Asp75- ja His51-jäännöksen karboksyyli- ja imidatsoliryhmien välistä elektroninsiirtoa. Tällaisen häiriön on raportoitu johtavan epäonnistuneeseen nukleofiiliseen hyökkäykseen Ser135-jäännöksen hydroksyyliryhmään (ß-OH), joka on välttämätön proteolyyttisen aktiivisuuden käynnistymiselle43,44. Näin ollen pääteltiin, että seulotuilla triterpenoideilla voi olla vahva affiniteetti DENV:n NS3pro-domeenia kohtaan erilaisten molekyylien välisten vuorovaikutusten kautta, ja ehdotettiin, että ne voisivat toimia lääkkeinä DENV-infektiota vastaan NS2B-NS3pro:n estämisen kautta.

Lisäksi kaikkien neljän triterpenoidin, ganodermanontriolin, lucidumoli A:n, ganoderiinihappo C2:n ja ganosporeriinihappo A:n telakoituja komplekseja DENV:n NS3pro:n kanssa analysoitiin myös MM/GBSA-laskelmien avulla, jotta voitiin laskea vastaavien ligandien sitoutumisaffiniteetit aktiivisessa kohdassa. Nämä laskelmat osoittivat suhteellisen negatiivisia MM/GBSA-arvoja kaikille neljälle telakoidulle kompleksille, eli NS3pro-Ganodermanontriol (-24,465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19,735 kcal/mol), NS3pro-Ganoderic acid C2 (-19.039 kcal/mol) ja NS3pro-Ganosporeriinihappo A (-11,449 kcal/mol), kun taas viiteinhibiittorikompleksi NS3pro-1,8-dihydroksi-4,5-dinitroantrakinoni tuotti suuremman arvon (-38,934 kcal/mol). Nämä havainnot viittaavat siihen, että valittujen triterpenoidien inhibitioaktiivisuus NS3pro:ta vastaan voisi olla heikompi kuin referenssi-inhibiittorin, mutta myös siihen, että ennustetut telakointipisteet tukivat Ganodermanontriolin vahvempaa sitoutumisaffiniteettia NS3pro:n kanssa verrattuna muihin triterpenoideihin. Lisäksi ennustetut ΔG-arvot ja fysikaalis-kemialliset komponentit, eli ΔGBind Coulomb, ΔGBind kovalenttinen, ΔGBind vdW (van der Waalsin voimat), ΔGBind Solv SA (liuottimen saavutettavissa oleva pinta-ala) ja ΔGBind Solv GB (liukenemisenergian yleistetty Bornin energia) analyysi valituille triterpenoideille ja positiiviselle kontrolleille, jotka ovat kompleksoituneet DENV:n NS3pro-proteiinin kanssa, osoittavat, että, ligandista riippuen ΔGBind Coulomb ja/tai ΔGBind vdW vaikuttivat eniten triterpenoidi- ja vertailuinhibiittorikompleksien vakauteen DENV NS3pro -proteiinin kanssa. (Kuvat 4, S2, taulukko S2). Ganodermanontrioli todettiin siis lupaavimmaksi toiminnalliseksi triterpenoidiksi DENV NS3pro -proteiinille, ja sitä analysoitiin edelleen yhdessä muiden triterpenoidien kanssa molekyylidynamiikan ja in vitro -analyysin avulla.

Vapaa sitoutumisenergia (kcal/mol) laskettuna MMGBSA-menetelmällä seulotuille triterpenoideille ts. (a) Ganodermanontrioli, (b) Lucidumol A, (c) Ganoderiinihappo C2 ja (d) Ganosporeriinihappo A kompleksina DENV NS2B-NS3-proteaasin kanssa molekyylisen telakointisimulaation jälkeen.

Molekyylidynamiikka-analyysi (MD-analyysi)

Kohde-ligandista molekyylidocking-menetelmällä lasketun vuorovaikutustiedon perusteella ennustettu vuorovaikutustieto voidaan validoida edelleen molekyylidynamiikkasimuloinnilla ja kiteytystutkimuksilla38,41. Tässä arvioitiin valittujen triterpenoidi-NS3pro-domeenikompleksien stabiilisuutta 10 ns:n MD-simulaatiolla RMSD:n (RMSD = root mean square deviation), RMSF:n (RMSF = root mean square fluctuation) ja proteiini-ligandi-kontaktikartta-analyysin avulla.

Kaikkien neljän ligandin kanssa kompleksin muodostaneen DENV:n NS3pro:n kompleksien C-alfan ja selkärangan atomien RMSD-analyysi osoitti stabiileja ja hyväksyttävissä olevia vaihteluita 10 ns:n mittaisen MD-simulaatioanalyysin ajanjakson aikana (kuva 5). Mielenkiintoista on, että reseptorin lopullinen vaihtelu kirjattiin <2 Å RMSD:ksi, kun taas ganodermanontriolin inhibiittorilla todettiin vakaa ja 6 Å:n maksimivaihtelu kompleksissa NS3pro-domeenin kanssa simulaatiovälin lopussa (kuva 5a). Myös sekä reseptorin yksittäisille jäännöksille että ligandin atomeille lasketut RMSF-arvot osoittivat siedettävää vaihtelua (alle 2,8 Å) simulointivälin aikana (kuvat S3a, S4a). Kuitenkin myös ligandin syklopenta-fenanthren-7-one-renkaan keto- ja metyyliryhmissä havaittiin merkityksettömiä RMSF-heilahteluja 5-7 ns:n aikajakson aikana (Kuva. S3a).

RMSD NS3pro-proteiinin ja triterpenoidien alfa-hiiliatomien RMSD:lle G. lucidum ligandina, (a) NS3pro-Ganodermanontrioli, (b) NS3pro-Lucidumol A, (c) NS3pro-Ganoderiinihappo C2 ja (d) NS3pro-Ganosporeriinihappo A, 10 ns:n MD-simulaatioiden liikeradalla.

NS3pro-Lucidumol A-kompleksin RMSD-analyysi osoitti, että sekä reseptorin että ligandin variaatiot olivat alle 3 Å:n suuruisia 10 ns:n simulointivälin aikana (kuva 5b). Samaan aikaan RMSF-analyysi sekä NS3pro:lle että Lucidumol A:lle ennusti vaihteluita <3 Å, ja hyväksyttäviä poikkeamia havaittiin myös ligandin heptaanialueen metyyli- ja hydroksyyliryhmässä 10 ns:n simulointivälin aikana (Kuva S3b). Vastaavasti NS3pro-Ganodriinihappo C2-kompleksin ligandissa havaittiin hyväksyttäviä poikkeamia alkuvaiheen 2-5 ns:n aikana, minkä jälkeen se pysyi vakaana, ja lopullinen poikkeama oli alle 8 Å 10 ns:n simulointivälin aikana (kuva S4b).

NS3pro-Ganodriinihappo C2-kompleksissa havaittiin niin ikään merkityksettömiä poikkeamia reseptorissa alkuvaiheen 2-5 ns:n välisenä aikana, minkä jälkeen se pysyi vakaana, ja lopulliseksi poikkeamaksi kirjattiin simulointivälin aikana alle 1,75 Å:n poikkeama (kuva S4). Näitä hyväksyttäviä poikkeamia ligandissa (alle 6 Å) ja reseptorissa (3 Å) tukivat myös kyseisen kompleksin lasketut RMSF-arvot (kuvat S3c, S4c).

Lisäksi NS3pro-Ganosporeriinihappo A:n telakoidun kompleksin ligandin simulaatioanalyysi osoitti aluksi pientä poikkeamaa 6 ns:n ajan ligandin alkuperäisen heptaaniosan heptaaniryhmässä sijaitsevassa karboksyyliryhmässä, jonka jälkeen se saavutti vakaan tilan 4,6 Å RMSD:llä 10 ns:n ajanjakson loppuun asti (kuva 5d). Samaan aikaan NS3pro osoitti vakaita värähtelyjä noin 1,6 Å RMSD:n tienoilla, joissa oli merkityksettömiä poikkeamia alkuperäisellä N-terminaalialueella (kuva 5d). Nämä havainnot viittasivat vastaavan telakoidun kompleksin vakauteen, mitä tukevat reseptorin ja ligandin yksittäisten residuaalien (alle 3,5 Å) ja atomien (3 Å) RMSF-käyrät (kuvat S3d, S4d).

Simulointiradan käyristä luotiin myös proteiinin ja ligandin välinen vuorovaikutuskartta, joka kuvaa yksittäisten residuaalien osuutta molekyylien välisessä sidoksessa (kuva 6). NS3pro-Ganodermanontrioli-kompleksin proteiini-ligandi -vuorovaikutuskartassa näkyi Met49:n, Val72:n, Lys73:n, Lys74:n, Asp75:n, Leu76:n, Trp83:n, Glu88:n, Thr118:n, Thr120:n, Ile123:n, Val147:n, Leu147:n, Leu149:n, Asn152:n, Gly152:n, Gly153:n, Val153:n, Val154:n, Val155:n, Ala164:n, Ile165:n, Al165:n, Ala166:n ja Asn167:n jäänteitten osallistuminen, jotka ovat muodostaen vety- ja vetosidoksia sekä vetosidoksia ja hydrofonista vetovoimaista vetovoimaisuutta, ionivuorovaikutusta ja vesisiltoja (kuva 6a). Leu149- ja Asn152-jäännökset korostuivat, sillä ne muodostivat huomattavia vesisiltoja ja vetysidoksia 10 ns:n simulaatiovälin aikana (kuva 6a). Myös jäännös Asn152:n ennustettiin muodostavan vetysidoksia telakoituvassa kompleksissa (Kuva 3a,b), mikä viittasi tämän jäännöksen merkitykseen NS3pro:ssa vuorovaikutuksessa Ganodermanontriolin kanssa.

Normalisoitu pinoamainen pylväsdiagrammi telakoituneille komplekseille, i.eli (a) NS3pro-Gandomanontrioli, (b) NS3pro-Lucidumol A, (cc) NS3pro-Ganoderiinihappo C2 ja (d) NS3pro-Ganosporeriinihappo A erilaisilla MD-simuloinnin aikana lasketuilla kontakteilla ja vuorovaikutusprofiileilla. Vuorovaikutusosuuksien arvot >1,0 ovat uskottavia, koska jotkin jäännökset luovat useita samantyyppisiä vuorovaikutuksia.

NS3pro-Lukidumoli A:n vuorovaikutuskartassa näkyi His51:n, Arg54:n, Val72:n, Lys73:n, Lys74:n, Asp75:n, Leu128:n, Asp129:n, Phe130:n, Pro132:n, Ser135:n, Tyr150:n, Gly151:n, Asn152:n, Gly153:n ja Val154:n osallistuminen, Val155, Tyr161 ja Asn167 jäännökset vetysidoksissa, hydrofobisissa vuorovaikutuksissa ja vesisiltojen muodostuksessa, Asp75:n ja Gly153:n jäännösten ollessa suurimmat vesisiltojen muodostuksessa ja vetysidosten muodostuksessa (Kuva. 6b). Molekyylidockausanalyysi viittasi myös Gly153:n rooliin vetysidoksessa ligandin kanssa (kuvat 3c,d), mikä osoitti tämän jäännöksen merkityksen proteiinin ja ligandin vakaudessa. Lisäksi Tyr161:n, Asp75:n ja Leu128:n jäännöksillä oli myös merkittävä osuus vesivälitteisessä, vetysidoksessa ja hydrofobisessa vuorovaikutuksessa tämän ligandin kanssa (kuva 6b). Nämä tulokset viittasivat siihen, että Gly153, Tyr161, Asp75 ja Leu128 olivat merkittävällä tavalla vastuussa NS3pro-Lucidumol A-kompleksin vakaasta konformaatiosta simulointijakson aikana.

Nsekä NS3pro-Ganoderiinihappo C2 -kompleksissa esiintyi Lys28-, Ile36-, Trp50-, His51-, Arg54-, Val72-, Lys74-, Asp75-, Leu128-, Asp129-, Phe130-, Ser131-, Pro132-, Ser135-, Tyr150-, Gly151-, Asn152-, Gly153-, Val155- ja Tyr161- jäännösten osuutta erilaisissa molekyylien välisissä vuorovaikutussuhteissa proteiini-ligandi-kartoitukseen simulaatiossa simulaatiojakson aikana (Kuva 6c). Mielenkiintoista oli, että Arg54 vaikutti eniten molekyylien väliseen vuorovaikutukseen vetysidoksen muodostumisen kautta, jota seurasivat vesisillat ja ioninen vetovoima (kuva 6c). Tämän jäännöksen ennustettiin myös molekyylidockausanalyysissä muodostavan kaksi vetysidosta Ganoderiinihappo C2:n kanssa (kuvat 3e,f), mikä viittaa siihen, että se on keskeinen tekijä kohde-ligandin vakauden ylläpitämisessä simulaation aikana.

Kuten NS3pro-Ganohappo A:n vuorovaikutusprofiili osoitti, että Try50-, His51-, Arg54-, Asp71-, Val72-, Lys73-, Lys74-, Asp75-, Thr118-, Asn119-, Thr120-, Gly121-, Thr121-, Thr122-, Ile123-, Gly151-, Asn152-, Gly153-, Val154-, Val155-, Tyr161- ja Asn167-jäämät vaikuttivat aktiivisesti vesisiltoihin, hydrofobisiin- ja ionivuorovaikutussuhteiden muodostumiseen (kuva. 6d). Lys73-, Lys74-, Val155- ja Asn167-jäännösten ennustettiin kuitenkin vaikuttavan eniten ganosporeriinihappo A -ligandin kanssa kompleksoituneen NS3pro:n stabiilisuuteen vetysidosten kautta, minkä jälkeen tulivat vesisillat, hydrofobiset ja ioniset vuorovaikutukset (kuva 6d). Myös Asn167:n merkittiin muodostavan vetysidoksia Ganosporeric acid A:n kanssa telakoituneessa kompleksissa, mikä osoittaa sen merkittävän panoksen kompleksin vakauteen. Nämä tulokset vahvistivat ja viittasivat kunkin triterpenoidin merkittävään vakauteen DENV-proteaasin NS3pro-domeenin kanssa telakoituneissa komplekseissa. Näin ollen ehdotettiin jälleen, että näitä triterpenoideja voitaisiin käyttää DENV-infektiolääkkeiden formuloinnissa.