Introduction

Aivoverenvuoto on kuolemaan johtava aivohalvauksen alatyyppi (Qureshi ym..), 2001a), jonka sairaalakuolleisuus on 40 % ja vammautumisaste 80 % (van Asch ym., 2010). ICH aiheuttaa 10-15 prosenttia kaikista aivohalvauksista, ja maailmanlaajuisesti ICH:n ilmaantuvuus on 2 miljoonaa tapausta vuodessa (van Asch ym., 2010), ja Yhdysvalloissa noin 120 000 tapausta vuodessa (Ribo ja Grotta, 2006; Broderick ym., 2007; Aguilar ja Freeman, 2010). Esiintyvyyden odotetaan kuitenkin kaksinkertaistuvan vuoteen 2050 mennessä (Qureshi ym., 2001b) ikääntymisen ja antikoagulanttien käytön yleistymisen vuoksi (Wang, 2010). Huomattavaa on, että ICH:hen ei ole olemassa tehokasta hoitoa, ja taudin patofysiologia on huonosti määritelty.

Neuroinflammaatio, jolle on ominaista keskushermoston neuroimmuunisolujen mikroglian aktivoituminen, on keskeinen tekijä ICH:n aiheuttamassa sekundaarisessa aivovauriossa ja neurologisten toimintojen menetyksessä (Wang ja Dore, 2007; Carmichael ym., 2008; Wang, 2010). Veren komponenttien, kuten trombiinin, Hb:n ja Hb:n aineenvaihduntatuotteiden, kuten hemiinin, kulkeutuminen aivoihin luo pohjan neuroinflammatorisille reaktioille ICH:n jälkeen (Wang ja Dore, 2007; Carmichael ym., 2008; Robinson ym., 2009; Wang, 2010; Cai ym., 2011; Dang ym., 2011; Babu ym., 2012; Lin ym., 2012; Weng ym., 2015; Min ym., 2017). Erityisesti mikroglian proinflammatorinen aktivaatio ICH:n jälkeen korreloi veri-aivoesteen vaurion, aivojen turvotuksen/ödeeman, hematooman laajenemisen, neurologisen heikkenemisen ja huonon toiminnallisen palautumisen kanssa (Platt ym., 1998; Hickenbottom ym., 1999; Leira ym., 2004; Zhao ym., 2007). Lisäksi ICH:n jälkeinen tulehdusreaktio säätelee myös verestä peräisin olevien monosyyttien/makrofagien rekrytointia aivoihin, joiden tiedetään säätelevän ICH:n aiheuttamaa aivovauriota ja sitä kautta toiminnallista toipumista (Tessier ym., 1997; Shiratori ym., 2010; Starossom ym., 2012).

Galektiinit ovat evolutiivisesti konservoituneiden hiilihydraatteja sitovien proteiinien perhe (Barondes ym., 1994a,b; Kasai ja Hirabayashi, 1996), jotka osallistuvat solujen aktivoitumiseen, erilaistumiseen, proliferaatioon, migraatioon ja apoptoosiin (Perillo ym., 1995; Yang ym., 1996; Perillo ym., 1998; Moiseeva ym., 1999; Vespa ym., 1999; Yamaoka ym., 2000; Goldring ym., 2002). Galektiiniperheen eri jäsenistä nousevat todisteet viittaavat Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n keskeisiin rooleihin neuroimmuunivasteissa useissa neuropatologisissa tiloissa (Jeon ym., 2010; Starossom ym., 2012; Parikh ym., 2015). Niiden soluvälitteisen ilmentymisen ja toiminnan ymmärtämisessä ICH:n jälkeen on kuitenkin kriittinen tietovaje. Tämän käsikirjoituksen tavoitteena on selvittää hemorragisen vamman aiheuttamaa Galektiini-1- ja Galektiini-3-ekspression modulaatiota ja soluvälitteistä ilmentymistä aivoissa prekliinisessä ICH-mallissa.

Materiaalit ja menetelmät

ICH:n indusoiminen

Intraserebraalinen verenvuoto indusoitiin aikuisilla urospuolisilla CD-1-hiirillä (8-12 viikkoa; n = 43), kuten aiemmin raportoitiin (Sukumari-Ramesh ym, 2012a,b, 2016; Bonsack et al., 2016; Sukumari-Ramesh ja Alleyne, 2016; Ahmad et al., 2017; Chen-Roetling et al., 2017). Lyhyesti hiiri nukutettiin (ketamiini ja ksylatsiini) ja tehtiin pieni viilto kallon paljastamiseksi. Kalloon tehtiin suurnopeusporalla porareikä (0,5 mm) noin 2,2 mm lateraalisesti bregmasta. Sitten hiiri asetettiin stereotaksiseen pääkehikkoon ja 26-G Hamiltonin ruiskulla ruiskutettiin 0,04U bakteerityyppistä IV-kollagenaasia (Sigma, St. Louis, MO, Yhdysvallat) 0,5 μL fosfaattipuskurisuolaliuoksessa (pH 7,4; PBS) vasempaan striatumiin (3,0 mm) stereotaksisessa ohjauksessa. Kun neula poistettiin, reikä suljettiin luuvahalla. Hiiret pidettiin 37 ± 0,5 °C:ssa pieneläinlämpötilan säätimellä koko toimenpiteen ajan. ICH:n jälkeinen hematooman ajallinen kuvio on esitetty (lisäkuva S1).

Western Blotting

Hiiret nukutettiin ja perfusoitiin transkardiaalisesti PBS:llä. Ipsilateraalinen aivokudos (sekä hematomaaliset että perihematomaaliset aivoalueet) kerättiin RIPA-puskuriin, joka sisälsi proteaasi- ja fosfataasi-inhibiittoreita, ja sille tehtiin sonikointi. Tämän jälkeen näytteet sentrifugoitiin 14 000 rpm 5 minuutin ajan 4 °C:ssa supernatantin keräämiseksi. Proteiinipitoisuudet arvioitiin BCA-proteiinimäärityssarjalla (Pierce, Rockford, IL, Yhdysvallat), ja 30-50 mikrogrammaa näytteitä ajettiin 4-20-prosenttisella natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinyylideenidifluoridikalvolle (PVDF). Blotteja inkuboitiin vastaavalla primaarivasta-aineella yön yli 4 °C:ssa. Tämän jälkeen inkuboitiin 2 tuntia vastaavan Alexa Fluor -merkityn sekundäärisen vasta-aineen kanssa. Blotit luettiin Li-Cor Odyssey -lähi-infrapunakuvantamisjärjestelmällä ja kvantifiointi tehtiin Quantity One -ohjelmistolla (Bio-Rad, Foster City, CA, Yhdysvallat).

Immunohistokemia

Hiiret nukutettiin ja perfusoitiin transkardiaalisesti PBS:llä. Aivot kerättiin ja sijoitettiin 4-prosenttiseen paraformaldehydiin yön yli 4 °C:ssa, minkä jälkeen ne pakastettiin. Aivot leikattiin sitten 25 mm:n koronaalileikkauksiksi kryostaatilla ja kiinnitettiin lasilevyille. Leikkeitä inkuboitiin 2 tuntia 10 %:n normaalissa aasin seerumissa huoneenlämmössä. Tätä seurasi yön yli kestävä inkubaatio vastaavan primaarivasta-aineen kanssa 4 °C:ssa. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin vastaavalla Alexa Fluor-merkityllä sekundäärisellä vasta-aineella 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Immunofluoresenssi määritettiin Zeiss LSM510 Meta konfokaalisella lasermikroskoopilla ja solujen yhteislokalisaatio määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Laird ym., 2010). Analysoimme kolme ei-peräkkäistä leikkausta eläintä kohti ja vähintään kolme satunnaista kenttää hematooman ympärillä.

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

RAW 264.7, hiiren makrofagisolulinja, istutettiin 24-kuoppalevylle ja sen annettiin inkuboitua 48 tuntia DMEM:ssä (DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle Medium), joka sisälsi 5 % nautaeläinten fetaalista seerumia, 5 % nautaeläinten kasvusiementä ja 1 % penisilliiniä/streptomysiiniä. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin hiiren rekombinantilla Galektiini-1:llä (6,25 tai 12,5 μg/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, Yhdysvallat) 1 tunnin ajan, minkä jälkeen soluja käsiteltiin 18 tuntia LPS:llä (100 ng/ml) tai heminillä (30 μg/ml). Supernatantti kerättiin ja sitä käytettiin IL-6:n osoittamiseen ELISA:lla valmistajan ohjeiden mukaisesti (Biolegend, San Diego, CA, Yhdysvallat). Lyhyesti sanottuna 96 kuoppalevy päällystettiin yön yli 4 °C:ssa spesifisellä sieppausvasta-aineella. Soluviljelmän supernatantti lisättiin kuoppiin 1 tunnin blokkauksen jälkeen ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämmössä. Sitoutumattomat aineet poistettiin pesemällä, ja kuoppiin lisättiin detektiovasta-aineliuos, jonka annettiin inkuboitua 1 h huoneenlämmössä. Lisähuuhtelun jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 μl Avidin- Horse Radish Peroxidase (HRP) -liuosta 30 minuutiksi huoneenlämmössä. Substraattiliuos lisättiin kuoppiin pesun jälkeen värin kehittymistä varten. Käytettiin stop-liuosta ja levy luettiin 450 nm:ssä mikrotiterilevyjen lukulaitteella (Bio-Tek, Epoch).

Genetic Knockdown of Galectin-3

RAW 264.7-solut transfektoitiin joko kontrolli-siRNA:lla (ON-TARGET plus Non-targeting Pool; GE Dharmacon) tai Galektiini-3-siRNA:lla (ON-TARGET plus Mouse Lgals3 siRNA; GE Dharmacon) käyttäen HiPerFect transfektioreagenssia (QIAGEN) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Galektiini-3:n knockdown varmistettiin 48 tuntia transfektion jälkeen western blottingilla, kuten aiemmin on kuvattu.

Statistinen analyysi

Tiedot analysoitiin t-testillä tai yksisuuntaisella varianssianalyysillä, jota seurasi Student-Newman-Keulsin post hoc -testi, ja ne ilmaistiin keskiarvona ± keskivirhe (SE). P-arvoa < 0,05 pidettiin merkitsevänä.

Tulokset

Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n ajallinen ilmentymiskuvio ICH:n jälkeen

Mutta sen arvioimiseksi, johtaako verenvuotovamma Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n ilmentymisen modulaatioon aivoissamme, hiirille indusoitiin ICH:ta tai Sham-menetelmää kollagenaasi-injektiolla. Ottaen huomioon Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n nousevan roolin neuroimmuunivasteissa, ipsilateraaliset aivoleikkeet sham- tai ICH-hiiristä arvioitiin käyttämällä sekä western blotting- että immunohistokemian analyysejä eri aikapisteissä, jotka vaihtelivat leikkauksen jälkeisestä 1. päivästä 7. päivään asti, joka on vamman jälkeinen ajanjakso, joka osoitti huomattavaa mikroglian/makrofagien ja astrosyyttien pro- sekä anti-inflammatorisen aktivaation induktiota ICH:n jälkeen (Sukumari-Ramesh ym, 2012b, 2016; Bonsack ym., 2016).

Huomionarvoista on, että ICH:n jälkeisten shameitaivojen tai kontralateraalisten aivoalueiden aivoleikkeissä Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n ilmentyminen oli hyvin marginaalista tai havaitsematonta, kun taas Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n ilmentymisen lisääntymistä havaittiin 3., 5. ja 7. päivänä ICH:n jälkeen (Kuvat 1, 2). Samansuuntaisesti Galektiini-1-immunopositiivisten solujen määrä lisääntyi merkittävästi noin 4-, 6- ja 4-kertaiseksi 3. päivänä, 5. päivänä ja 7. päivänä ICH:n jälkeen verrattuna näennäiseen (kuva 1B). Tämä havainto vahvistettiin edelleen western blotting -analyysillä, joka paljasti Galektiini-1:n huomattavan ja merkittävän induktioasteen 3. päivästä alkaen ICH:n jälkeen verrattuna shamiin (kuvat 1C, D). Lisäksi Galektiini-3:n induktio (kuva 2) heijasti Galektiini-1:n ilmentymistä ICH:n jälkeen, ja Galektiini-3:n immunopositiiviset solut olivat noin 15-, 28- ja 24-kertaisesti suuremmat 3., 5. ja 7. päivänä ICH:n jälkeen (kuva 2B) verrattuna näennäisnäytteenottoon, ja Western blotting -analyysi ja sitä seurannut densitometria-analyysi vahvistivat loukkaantumisen aiheuttaman Galektiini-3:n lisääntyneen ilmentymisen ICH:n jälkeen (kuvat 2C,D).

Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n solulokalisoituminen ICH:n jälkeen

Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n solulokalisoitumisen määrittämiseksi ICH:n jälkeen aivoleikkeille tehtiin kaksoisleimausimmunovärjäys. Galektiini-1:n ilmentymistä havaittiin enimmäkseen GFAP-positiivisissa astrosyyteissä (kuva 3A), ja stereotaktinen solujen laskenta osoitti, että 85 % Galektiini-1-positiivisista soluista ilmaisi GFAP:ta samanaikaisesti ICH:n jälkeen. Lisäksi Galektiini-1:n ilmentymistä havaittiin myös Iba1-positiivisissa mikroglioissa/makrofageissa ICH:n jälkeen (kuva 3B), mutta vain 12 % Galektiini-1-positiivisista soluista ilmaisi Iba1:tä samanaikaisesti.

Sen sijaan Galektiini-3:n ilmentyminen rajoittui enimmäkseen Iba1-positiivisiin soluihin (kuva 4A) ja Galektiini-3:n ilmentyminen puuttui GFAP-positiivisista soluista (kuva 5A), mikä osoittaa Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n erilaista soluvälitteistä ilmentymistä ICH:n jälkeen. Lisäksi Galektiini-3:n ilmentymistä havaittiin proinflammatorisissa, M1-mikroglia- tai makrofagimerkkiaineita sisältävissä CD16/32-positiivisissa soluissa (kuva 4B), mikä viittaa Galektiini-3:n uuteen rooliin neuroinflammatorisissa vasteissa ICH:n jälkeen. Huomionarvoista on, että 88 ja 92 prosenttia Galektiini-3-positiivisista soluista ilmaisi samanaikaisesti Iba1- ja CD16/32-positiivisia soluja. Huomionarvoista on, että Galektiini-3:a ilmentävät mikrogliat tai makrofagit osoittivat fagosytoivaa fenotyyppiä (kuvat 4A,B), mikä viittaa sen tutkimattomaan rooliin mikroglia- tai makrofagivälitteisessä fagosytoosissa ICH:n jälkeen. Lisäksi NeuN-positiiviset solut eivät ilmentäneet Galektiini-1:tä tai Galektiini-3:a (kuvat 3C, 5B).

Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n välityksellä tapahtuva tulehdusvasteen säätely

Toteuttaaksemme Galektiini-1:n ja Galektiini-3:n mahdollisen funktionaalisen roolin ICH:n jälkeen, teimme in vitro -tutkimuksia. Rekombinantti Galektiini-1 (6,25 ja 12,5 μg/ml) vaimensi merkittävästi LPS:n aiheuttamaa proinflammatorisen sytokiinin, interleukiini -6:n (IL-6), vapautumista RAW 264.7 -soluista ELISA-menetelmällä arvioituna verrattuna kontrolleihin (kuva 6), mikä viittaa Galektiini-1:n negatiiviseen säätelevään rooliin tulehduksessa.

Testaamaan Galektiini-3:n toiminnallista roolia suoritimme siRNA-välitteisen Galektiini-3:n geneettisen knockdownin RAW 264.7 soluja ja tutkittiin tulehdusreaktiota. Geenin vaimentaminen siRNA:lla vähensi merkittävästi Galektiini-3:n ilmentymistä RAW 264.7 -soluissa 52,95 prosentilla, kuten Western blotting osoitti (kuvat 7A, B). Erityisesti Galektiini-3:n siRNA:lla lääkitty geneettinen tyrmäys ei moduloinut LPS:n indusoimaa IL-6:n vapautumista (kuva 7C), kun taas Galektiini-3:n geneettinen tyrmäys lisäsi merkittävästi heminin (hemoglobiinimetaboliitti, joka kerääntyy suurina pitoisuuksina kallonsisäisiin hematoomaattisiin verenpurkaumiin) indusoimaa IL-6:n vapautumista (kuva 7D), mikä osoittaa Galektiini-3:n vielä tutkimatonta roolia tulehdusreaktion modulaattorina ICH:n jälkeen.

Keskustelu

Galektiinit ovat endogeenisten hiilihydraatteja sitovien proteiinien perhe, joilla on kriittisiä rooleja sekä fysiologisissa että patologisissa olosuhteissa olemalla vuorovaikutuksessa solujen pinnalla olevien glykosyloidun reseptorien kanssa ja moduloimalla solunsisäisiä signalointireittejä (Perillo ym, 1995, 1998; Yang et al., 1996; Moiseeva et al., 1999; Vespa et al., 1999; Yamaoka et al., 2000; Goldring et al., 2002; Laaf et al., 2019). Galektiinien hiilihydraatteja tunnistava domeeni (CRD) on sekvenssiltään huomattavan samankaltainen, ja niillä on kohonnut affiniteetti β-galaktosideja kohtaan, ja ne on alun perin määritelty sen perusteella, että ne kykenevät tunnistamaan disakkaridia N-asetyylilaktosamiinia (Barondes et al., 1994a,b; Kasai ja Hirabayashi, 1996). Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat kuitenkin huomattavia eroja niiden hiilihydraatteja sitovissa ominaisuuksissa (Hirabayashi ym., 2002; Leffler ym., 2002; Carlsson ym., 2007).

Galektiini-1:n, joka on galektiini-perheen ubikvitaalisimmin ekspressoituva jäsen (Stillman ym., 2006), on todettu osallistuvan synnynnäisen ja adaptiivisen immuniteetin säätelyyn, ja sitä esiintyy sekä solunsisäisissä että solunulkoisissa paikoissa (Verschuere ym., 2014). Galektiini-1:n solunulkoiset toiminnot perustuvat suurelta osin hiilihydraatteja sitoviin ominaisuuksiin, kun taas solunsisäiset toiminnot liittyvät pääasiassa hiilihydraateista riippumattomiin vuorovaikutuksiin (Verschuere ym., 2014). Johdonmukaisesti Galektiini-1:n roolin kanssa immuunivasteessa periferiassa Galektiini-1:n tiedetään tukahduttavan makrofagien aktivaatiota (Barrionuevo ym., 2007), edistävän T-solujen selektiivistä apoptoosia (Toscano ym., 2007), indusoivan anti-inflammatorisen sytokiinin, IL-10:n eritystä (van der Leij ym, 2004; Cedeno-Laurent ym., 2012) ja heikentää makrofagien typpioksidin (NO) tuotantoa (Correa ym., 2003).

Galektiini-1 ilmentyy laajalti hermokudoksissa alkionvaiheessa, mutta rajoittuu pääasiassa perifeerisiin kudoksiin kypsymisen myötä (Horie ja Kadoya, 2002). Johdonmukaisesti vahingoittumattomassa aivojen striatumissa Galektiini-1:n ilmentyminen oli marginaalista. Hemorragisen aivovamman yhteydessä GFAP-positiivisissa astrosyyteissä havaittiin kuitenkin hyvin huomattavaa Galektiini-1:n ilmentymistä. Galektiini-1 on mukana astrosyyttien erilaistumisessa ja sen jälkeisessä BDNF:n (Brain Derived Neurotrophic Factor) vapautumisessa aivovamman jälkeen, mikä viittaa Galektiini-1:n rooliin neuroprotektiossa (Sasaki et al., 2004; Qu et al., 2010). Lisäksi galektiini-1 on yksi aikuisten neurogeneesin keskeisistä säätelijöistä hiilihydraatteja sitovan kykynsä ansiosta ja edistää toiminnallista elpymistä aivohalvauksen jälkeen (Ishibashi ym., 2007). Galektiini-1:n antaminen vähensi neuronien apoptoosia, pienensi aivoinfarktin määrää ja paransi aivojen iskemiasta johtuvaa neurologista toimintaa (Qu ym., 2011). Myös natiivi ja rekombinantti galektiini-1 suojasi hiiren ja rotan pikkuaivoneuroneja glutamaatin neurotoksisilta vaikutuksilta (Lekishvili et al., 2006). Huomionarvoista on, että galektiini-1 deaktivoi tulehduksellista mikrogliaa ja suojaa tulehduksen aiheuttamalta neurodegeneraatiolta (Starossom ym., 2012). Lisäksi tutkimuksemme osoittivat, että rekombinantti Galektiini-1 heikentää proinflammatorisen sytokiinin, IL-6:n vapautumista LPS-stimuloiduista hiiren makrofageista RAW 264.7 verrattuna kontrolleihin, mikä viittaa Galektiini-1:n negatiiviseen säätelyrooliin tulehduksessa.

Galektiini-1 on yksi mikroglian/makrofagien aktivaatiota säätelevän CD45:n endogeenisistä ligandeista (Walzel et al., 1999). Lisäksi galektiini-1:n vuorovaikutus CD45:n kanssa johtaa tämän glykoproteiinin pysymiseen plasmakalvolla ja lisää sen fosfataasiaktiivisuutta. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että CD45 säätelee negatiivisesti proinflammatorista M1-mikroglian aktivaatiota mutta edistää anti-inflammatorista, M2-fenotyyppiä moduloimalla mitogeeniaktivoitua proteiinikinaasi p38:a (p38MAPK), cAMP-vaste-elementtiä sitovaa CREB:tä (cAMP response element binding) ja aktivoitujen B-solujen ydintekijä kappa-valoketjujen vahvistajaa (NF kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF kappa-light-chain-enhancer of activated B-s cells) -solunsiirtoväyliä (Starossom ym., 2012). Tähän vaikutukseen liittyi Galektiini-1:n sitoutuminen CD45:n ydin 2 O-glykaaneihin, mikä viittaa siihen, että aktivoituneiden mikroglialien/makrofagien glykaaniosuuksien ilmentyminen edellyttää Galektiini-1:n sitoutumista ja toimintaa (Starossom ym., 2012). Lisäksi Galektiini-1 tukahdutti metamfetamiinin aiheuttamaa neuroinflammaatiota ihmisen aivojen mikrovaskulaarisissa endoteelisoluissa (Parikh et al., 2015), ja Galektiini-1:n on ehdotettu osallistuvan neuriitin uloskasvuun ja synaptiseen liitettävyyteen. Kaiken kaikkiaan tiedot viittaavat siihen, että Galektiini-1:n induktio reaktiivisissa astrosyyteissä ICH:n jälkeen voisi olla solujen välinen viestintämekanismi, joka helpottaa astrosyyttien välittämää neuroprotektioiden säätelyä ICH:n jälkeen, mikä oikeuttaa lisätutkimuksiin.

Galektiini-3 on 25-35 kDa:n kimeerinen tyyppinen valkuaisaine, jonka toiminnot riippuvat tiukasti lokalisaatiosta (Thomas ja Pasquini, 2018). Galektiini-3:n ilmentymistä on havaittu tuman ja sytoplasman alueella (Liu ym., 2002). Lisäksi makrofagit ja aktivoitunut mikroglia voivat vapauttaa Galektiini-3:a solunulkoiseen tilaan, mikä johtaa solunulkoisen matriksin uudelleenmuotoiluun ja vastaavasti muuttuneeseen tulehdusvasteeseen (Li ym., 2008; Jeon ym., 2010). Klassisen endoplasmisen retikulumin/Golgin erittymisreitin sijasta galektiini-3 noudattaa erittymisessä ja viennissä vaihtoehtoista eritysreittiä (Mehul ja Hughes, 1997), ja vapautuessaan galektiini-3 on vuorovaikutuksessa useiden solunulkoisten reseptorien kanssa. Vaikka galektiini-3 liittyy läheisesti tulehdusreaktioiden kaskadiin, galektiini-3:n tarkka toiminnallinen rooli neuroinflammaatiossa on suurelta osin kiistanalainen. On kuitenkin raportoitu, että mikroglian vapauttama galektiini-3 toimi endogeenisena TLR-4 (Toll Like Receptor-4) -ligandina (Burguillos ym., 2015). Lisäksi galektiini-3:n geneettinen poisto vähensi neuronaalista menetystä ja galektiini-3-vasta-aineen antamisella oli neuroprotektiivisia vaikutuksia traumaattisen aivovamman prekliinisessä mallissa (Yip et al., 2017), mikä yhdessä viittaa galektiini-3:n haitalliseen rooliin aivovamman jälkeen. Sitä vastoin Galektiini-3:n kohdennettu deletointi pahensi iskeemistä aivovammaa ja neurodegeneraatiota aivoinfarktin jälkeen (Lalancette-Hebert et al., 2012), mikä viittaa Gelectin-3:n neuroprotektiiviseen rooliin aivovaurion jälkeen. Lisäksi Gelektiini-3 edistää angiogeneesiä ja neurogeneesiä, mikä viittaa sen mahdolliseen rooliin aivojen iskemian jälkeisessä korjauksessa (Yan et al., 2009). Galektiini-3 edisti myös oligodendroglian erilaistumista, mikä edistää toiminnallista elpymistä demyelinoivien häiriöiden jälkeen (Pasquini et al., 2011). Nämä Galektiini-3:n ristiriitaiset toiminnalliset roolit neuropatologian jälkeen voivat johtua Galektiini-3:n erilaisesta subcellulaarisesta ilmentymisestä tai aivosairauksien patofysiologian eroista, jotka vaativat lisätutkimuksia.

Yhtäpitävästi muiden neuropatologisten tilojen kanssa havaitsimme Galektiini-3:n kohonneen ilmentymisen ICH:n jälkeen, ja ilmentymistä havaittiin pääasiassa Iba1-positiivisissa soluissa, jotka ovat keskushermostokudoksen tulehdussoluja. Iba1-positiiviset solut ICH:n jälkeen voivat olla joko mikroglioita tai infiltroivia makrofageja, joilla on rooli synnynnäisessä immuunivasteessa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että mikroglioilla ja makrofageilla voi olla erilainen rooli aivopatologian jälkeen (Gao ym., 2017). Näiden linjojen mukaisesti primaarisilla mikrogliaviljelmillä tehdyt tutkimukset dokumentoivat Galectin-3:n proinflammatorisen roolin (Burguillos ym., 2015), kun taas makrofageilla tehdyt tutkimukset osoittavat anti-inflammatorisen roolin (MacKinnon ym., 2008), mikä edellyttää lisätutkimuksia. Lisäksi Galektiini-3:n geneettinen knockdown RAW 246.7 -soluissa lisäsi heminin indusoimaa IL-6:n, proinflammatorisen sytokiinin, vapautumista, mikä viittaa Galektiini-3:n rooliin tulehdusvasteissa ICH:n jälkeen. Lisäksi Galektiini-3:a ilmentävät mikrogliat tai makrofagit osoittivat fagosytoivaa fenotyyppiä, mikä viittaa sen tutkimattomaan rooliin mikroglia- tai makrofagivälitteisessä fagosytoosissa, jolla on keskeinen rooli hematooman purkautumisessa ja sitä seuraavassa aivojen toipumisessa ICH:n jälkeen. Johdonmukaisesti viimeaikaiset raportit viittaavat siihen, että makrofagit, jotka kerääntyvät keskushermostoon loisinfektion aikana, ilmentävät runsaasti Galektiini-3:a (Quenum Zangbede et al., 2018) ja aktivoitunut mikroglia fagosytoi soluja Galektiini-3:n kautta (Nomura et al., 2017). Lisäksi kohonneet plasman Galektiini-3-pitoisuudet liittyivät vahvasti tulehdukseen, vakavuuteen ja huonoihin lopputuloksiin potilailla, joilla oli akuutti ICH (Yan ym., 2016). Siksi tarvitaan lisätutkimuksia, joissa selvitetään Galektiini-3:n toiminnallisia rooleja ICH:n jälkeen.

Johtopäätös

Galektiini-1:llä ja Galektiini-3:lla oli erittäin syvä ja lisääntynyt ilmentyminen 3. päivästä 7. päivään loukkaantumisen jälkeen ICH:n jälkeisellä perihematomaalisella aivoalueella verrattuna Shamiin. Lisäksi Galektiini-1:n ilmentymistä havaittiin enimmäkseen GFAP-positiivisissa astrosyyteissä, kun taas Galektiini-3:n ilmentymistä havaittiin enimmäkseen Iba1- ja CD16/32-positiivisissa soluissa, jotka ovat CNS:n tulehdussoluja. Lisäksi geneettiset tutkimukset paljastivat sekä Galektiini-1:n että Galektiini-3:n negatiivisen säätelyroolin proinflammatorisen sytokiinin, IL-6:n, vapautumisessa ärsykkeestä riippuen. Kaiken kaikkiaan tiedot viittaavat siihen, että Galektiini-1 ja Galektiini-3 voisivat olla kohteena gliavasteiden ja siten aivovaurion moduloinnissa ICH:n jälkeen, mikä edellyttää lisätutkimuksia.

Eettiset lausunnot

Elkotutkimukset tarkistettiin ja hyväksyttiin Augustan yliopiston tutkimus- ja opetuskäytön eläinkomiteassa NIH:n ja USDA:n ohjeiden mukaisesti.

Tekijän kontribuutiot

FB suoritti immunohistokemialliset ja soluviljelytutkimukset sekä western blottingin ja osallistui tietojen analysointiin. SS-R ideoi ja suunnitteli kokeet, suoritti eläinleikkaukset, geneettiset tutkimukset ja tietojen analysoinnin sekä laati käsikirjoituksen. Molemmat kirjoittajat lukivat ja hyväksyivät lopullisen käsikirjoituksen.

Rahoitus

Tätä työtä on tuettu National Institutes of Healthin (R01NS107853) ja American Heart Associationin (14SDG18730034) apurahoilla SS-R:lle.

Erittely eturistiriidoista

Tekijät ilmoittavat, että tutkimus suoritettiin ilman kaupallisia tai taloudellisia suhteita, jotka voitaisiin tulkita mahdolliseksi eturistiriidaksi.

Täydentävä aineisto

Tämän artikkelin täydentävä aineisto löytyy verkosta osoitteesta: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fncel.2019.00157/full#supplementary-material

KUVIO S1 | Hematooman ajallinen kuvio ICH:n jälkeen.

Lyhenteet

CD16/32, Cluster of Differentiation 16/32; CD45: Cluster of Differentiation 45; CNS, keskushermosto; ELISA, entsyymisidonnainen immunosorbenttimääritys; GFAP, glial fibrillary acidic protein; Hb, hemoglobiini; Iba1, ionisoitunutta kalsiumia sitova adaptaattorimolekyyli 1; ICH, intrakerebraalinen verenvuoto; LPS, lipopolysakkaridi; NeuN, hermosolujen ytimet; PBS, fosfaattipuskurisuolaliuos; RIPA, radioimmunoprecipitation.