Nopea proteiininestekromatografia (FPLC) ja korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC): kaksi nestekromatografista menetelmää suorassa vertailussa. Tässä artikkelissa käsitellään näiden kahden tekniikan välisiä eroja painottaen erityisesti analyysien vaatimuksia.
Nimet nopea proteiininestekromatografia (FPLC) ja korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) antavat viitteitä näiden kromatografisten menetelmien välisistä eroista. Siinä missä HPLC toimii korkealla paineella pienten kemiallisten yhdisteiden analysoimiseksi, FPLC puhdistaa suuria biomolekyylejä, kuten proteiineja tai DNA:ta. Biomolekyylien kromatografia on hyvin vaativaa ja herkkää, koska ne eivät kestä korkeita lämpötiloja, korkeita paineita tai HPLC:ssä yleensä käytettäviä liuottimia. Näistä syistä biomolekyylien erottaminen edellyttää vaihtoehtoista lähestymistapaa HPLC:lle.
Nopeasta proteiininestekromatografiasta käytetään yleisesti useita termejä, kuten biokromatografia, bioseparointi tai biopuhdistus. Tätä kromatografian erikoismuotoa käytetään suurten, useiden kilodaltonien (kDa) biomolekyylien, kuten proteiinien, nukleotidien tai peptidien puhdistamiseen (kuva 1). FPLC:n käyttäjän tavoitteena on saada mahdollisimman paljon puhdasta ja natiivia tuotetta. Klassisen HPLC:n tavoitteena taas on tunnistaa ja kvalifioida analyyttejä, yleensä pieniä yhdisteitä, joiden koko vaihtelee muutamasta atomista noin 3000 Da:iin.
Haasteena puhtaan proteiinin saaminen soluotteesta
Tyypillisesti biomolekyylit puhdistetaan bakteeri- tai eukaryoottisoluista, jotka ovat täynnä proteiineja, DNA:ta, RNA:ta ja solukalvoja. Näin ollen kiinnostavan proteiinin puhdistaminen soluotteesta voi olla hyvin haastavaa. Biokemistit käyttävät useita temppuja: yksi on käyttää rekombinanttiproteiineja, joita solut yliekspressoivat. Kiinnostavan proteiinin yliekspressio mahdollistaa puhdistamisen suuremmissa määrissä. Toinen kikka on lisätä kiinnostavaan proteiiniin tunniste, jonka hartsi (pylväsmateriaali) tunnistaa spesifisesti. Proteiinit, joilla ei ole tagia, eivät sitoudu kolonniin ja eluoituvat välittömästi, kun taas haluttu proteiini rikastuu ja voidaan erottaa helposti.
Biomolekyylit puhdistetaan solulysaateista, mikä tarkoittaa paljon suurempia näytemääriä kuin analyyttisessä HPLC:ssä. Siksi näytteen injektointiin käytetään suurempia näytesilmukoita tai jopa pumppuja, joissa on suurempi virtausnopeus. Lisäksi FPLC- ja HPLC-kolonnien materiaalit eroavat täysin toisistaan. HPLC:ssä käytetään piihelmiä, joiden hiukkaskoko on hyvin pieni ja jotka kestävät hyvin korkeita paineita, kun taas FPLC:ssä tarvitaan agaroosi- tai polymeerimateriaalia, jonka hiukkaskoko on useimmissa menetelmissä suurempi. FPLC:ssä käytettävät hartsit eivät ole yhtä paineenkestäviä kuin silikahelmet, ja ne ovat hyvin herkkiä ilmakuplille. Lisäksi pylväsmateriaalin lisäksi myös pylväslaitteisto on erilainen. Klassisessa HPLC:ssä käytetään paineenkestäviä ruostumattomasta teräksestä valmistettuja kolonneja. Kuten jo mainittiin, paineenkestävyys ei ole tärkeää FPLC:ssä, joten on mahdollista käyttää läpinäkyviä ja bioyhteensopivia lasikolonneja. Tämä on suuri etu, sillä käyttäjä voi tarkistaa kolonnin ilmakuplien varalta tai seurata materiaalin kuntoa puhdistusajon aikana.
Diverse Biomolecules, Diverse Purification Methods
Erot kolonnimateriaalissa heijastuvat myös menetelmiin. Analyyttisessä HPLC:ssä käänteisfaasikromatografia hydrofobisilla stationäärifaaseilla ja polaarisilla liikkuvilla faaseilla on valittu menetelmä, kun taas FPLC:ssä käytetään useampia erilaisia menetelmiä (kuva 2). Yksi FPLC-menetelmä on koko-ekskluusiokromatografia (SEC), jossa molekyylit erotetaan toisistaan niiden koon mukaan. Pienemmät molekyylit voivat diffundoitua helmien huokosiin, kun taas suuremmat molekyylit kulkevat kolonnin läpi lähes pidättämättöminä. Pienemmät molekyylit eluoituvat pylväästä myöhemmin, jolloin syntyy gradientti näiden molekyylien koon mukaan. Toinen erotusmenetelmä on ioninvaihtokromatografia. Biomolekyylit erotetaan ja puhdistetaan niiden ominaisvarauksen mukaan, joka riippuu puskurin pH:sta. Mitä varautuneempi proteiini on, sitä paremmin se sitoutuu vastakkaisesti varautuneeseen hartsiin. Proteiinin eluoimiseksi pylväästä suolaionien pitoisuutta lisätään ajon aikana. Suolaionit kilpailevat proteiinin kanssa hartsiin sitoutumisesta. Toinen tärkeä FPLC-menetelmä on affiniteettikromatografia, jossa kiinnostava molekyyli voi sitoutua spesifisesti pylvääseen, kun taas muut molekyylit eivät voi ja eluoituvat sitoutumatta. Tällöin käytetään kolonnia, jossa on erityisiä väliaineita, jotka tunnistavat halutun biomolekyylin. Affiniteettikromatografian erityinen muoto on immobilisoitu metalli-ioniaffiniteetti (IMAC). Kiinnostavaa proteiinia on muutettava geneettisesti lisäämällä proteiiniin tunniste, joka koostuu yleensä kuudesta histidiinistä. IMAC-hartsi tunnistaa spesifisesti tämän ”Hisâtagin”. Eluointi tapahtuu lisäämällä imidatsolipitoisuutta, joka kilpailee His-tagilla varustettujen proteiinien kanssa. Lisäksi proteiinit voidaan erottaa toisistaan niiden spesifisen hydrofobisuuden perusteella käyttämällä hydrofobisen vuorovaikutuksen erotusmenetelmää. Hartsi on koottu siten, että hydrofobisimmat proteiinit sitoutuvat voimakkaimmin kolonniin ja eluoituvat suolagradienttia pienentämällä.
Halutun proteiinin puhdistamiseksi käytetään yleensä menetelmien yhdistelmää. Ensimmäisessä vaiheessa, niin sanotussa ”capture”-vaiheessa, proteiini puhdistetaan raakauutteesta. Tyypillisesti tähän ensimmäiseen puhdistusvaiheeseen käytetään affiniteettikromatografiaa. Toisessa vaiheessa, ”välivaiheessa”, poistetaan lisäkontaminaatio ioninvaihtokromatografialla tai hydrofobisella vuorovaikutuksella. Viimeisen ”kiillotusvaiheen” – yleensä koon ekskluusiokromatografiavaiheen – tavoitteena on päästä eroon kaikista jäljelle jäävistä epäpuhtauksista, jotta saadaan erittäin puhdas tuote. Tämä proteiinien puhdistusstrategia riippuu täysin tietystä biomolekyylistä. Joissakin tapauksissa kaksivaiheinen puhdistus voi olla riittävä. Mitä useampia menetelmiä yhdistetään, sitä enemmän kiinnostavaa proteiinia menetetään puhdistuksen aikana, mutta korkeampi puhtaus voidaan saavuttaa.
Puhdistuksen jälkeen saavutetusta näytteestä voidaan analysoida puhtaus, konsentraatio ja entsyymin toiminta tai aktiivisuus HPLC:llä, natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE), entsyymiaktiivisuusmäärityksillä tai massaspektrometrialla.
FPLC:n vaatimukset
Valkuaisaineet koostuvat ketjuksi rivittyneistä aminohapoista. Tämä ketju on taitettu kolmiulotteiseksi rakenteeksi, joka on avain kunkin proteiinin toimintaan ja aktiivisuuteen. Siksi on erittäin tärkeää säilyttää tämä proteiinirakenne puhdistusprosessin aikana. Ulkoiset tekijät, kuten korkea lämpötila, korkea paine, äärimmäinen pH tai liuottimet, voivat häiritä proteiinien rakennetta, ja siksi niitä vältetään FPLC:ssä. Proteiinien käyttölämpötila on yleensä 4 °C. Tämän vuoksi FPLC-laite sijoitetaan usein kylmäkammioon tai kylmähuoneeseen, jossa se altistuu alhaisen lämpötilan lisäksi myös tiivistyvälle kosteudelle. FPLC-järjestelmän komponentit on suunniteltava erityisesti näitä olosuhteita varten. Lisäksi FPLC-komponentit kohtaavat lisähaasteen, nimittäin eluentteina käytettävät suolapuskuriliuokset. Yleensä valitaan isosmoottinen pH ja suolapitoisuudet, jotka vastaavat soluympäristöä. Kromatografiajärjestelmät on yleensä valmistettu ruostumattomasta teräksestä. Toisaalta puskuriliuosten suola voi aiheuttaa korroosiota ja toisaalta ruostumattomasta teräksestä peräisin olevat metalli-ionit voivat häiritä proteiinia ja häiritä sen rakennetta. Siksi on tärkeää välttää ruostumatonta terästä ja käyttää bioyhteensopivaa materiaalia, kuten polyeetterieetteriketoni (PEEK) -keramiikkaa tai titaania, kun tehdään FPLC:tä. Kuten HPLC-järjestelmiä, myös FPLC-järjestelmiä ohjataan ohjelmistolla. FPLC- ja HPLC-ohjelmistojen välillä on huomattavia eroja. Jälkimmäistä käytetään pääasiassa näytteiden analysointiin, ja se sisältää paljon analyysityökaluja. FPLC:ssä ei sen sijaan tarvita monia analyysityökaluja, ja on tavallista luoda menetelmiä tilavuuden tai jopa kolonnin tilavuuden perusteella (kuva 3). Useimmissa FPLC-sovelluksissa käytetään mieluiten kolonnin tilavuuteen perustuvia menetelmiä, jolloin skaalaaminen on helppoa. FPLC-ohjelmistot ovat useimmiten hyvin intuitiivisia ja käyttäjäystävällisiä, ja niissä on suora ohjaus, joka mahdollistaa parametrien säätämisen ajon aikana. Näin käyttäjä voi reagoida erilaisiin tilanteisiin hyvin spontaanisti.
On siis selvää, että näiden kahden kromatografia-alueen välillä on suuria eroja (taulukko 1). Menetelmät, laitteistot ja ohjelmistot eroavat suuresti sen mukaan, analysoidaanko vai puhdistetaanko molekyyliä. FPLC-sovelluksissa haastetta lisäävät näytteiden herkkyys ja pyrkimys pitää ne mahdollisimman natiivina. Kaiken kaikkiaan molemmat tekniikat ovat erittäin mielenkiintoisia alueita, joista kaikkien alalla työskentelevien tulisi olla tietoisia.
Stephanie Runde on valmistunut Münchenin teknillisestä yliopistosta Saksassa biokemiasta. Hän väitteli tohtoriksi Berliinin vapaassa yliopistossa, Saksassa, ja työskentelee tällä hetkellä Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH:ssa FPLC:n tuotepäällikkönä.