Onko formamidi uskottava prebioottinen esiaste?

Kemikaalien luonteesta, jotka näyttelivät prebioottisten esiasteiden roolia alkukantaisella Maapallolla, kiistellään yhä. Yleisessä lähestymistavassa ongelmaan olisi otettava huomioon seuraavat tarkasteltavien yksinkertaisten orgaanisten yhdisteiden fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet. Nimittäin: (i) biogeenisten lähtöaineiden suhteellinen runsaus, jota voidaan pitää edellytyksenä geneettisten prosessien varhaiselle alkamiselle tällä planeetalla, ii) niiden stabiilisuus, iii) niiden kyky reagoida monimutkaisempien rakenteiden synnyttämiseksi toistettavia reittejä noudattaen. Yksinkertaisiin kemiallisiin prosesseihin perustuvien lähtöaineiden muodostuminen ja kaikkien informaatiomolekyylien kokoamiseen käytettävien rakennusaineiden lähes samanaikainen läsnäolo ovat muita tärkeitä edellytyksiä.

(i) Saatavuus

Formamidi (H2NCOH) täyttää vaadittavat kriteerit, jotka koskevat sen runsautta ja leviämistä maailmankaikkeudessa. Komeettojen-asteroidien ja tähtienvälisten pilvien molekyylikoostumuksen analyysi osoittaa, että neljästä yleisimmästä ja biologisesti merkityksellisimmästä alkuaineesta H, O, C ja N (lukuun ottamatta He:tä) koostuvat yhdisteet ovat isosyanaatti HNCO ja formamidi H2NCOH . Formamidia havaittiin tähtienvälisen väliaineen kaasufaasissa , pitkäkestoisessa komeetassa Hale-Boppissa ja alustavasti nuoren tähtikappaleen W33A ympärillä olevien jyvien kiinteässä faasissa. Mahdollista formamidin tuotantoa Europan kaltaisissa olosuhteissa havaittiin (Hand, K.; Carlson, R. W., Department of Geological & Environmental Sciences, Stanford University; henkilökohtainen tiedonanto, heinäkuu 2006).

(ii) Stabiilisuus

Formamidi täyttää vaaditut stabiilisuuden kriteerit. Tätä aihetta on tarkasteltava syaanivetykemian (HCN) yhteydessä. Oròn keskeisen kokeen jälkeen, joka koski adeniinin synteesiä HCN:stä, on tehty lukuisia tutkimuksia, joissa on pyritty arvioimaan tämän yhdisteen roolia alkukantaisten nukleiinihappojen synnyssä. Kaksi ongelmaa on kuitenkin edelleen ratkaisematta HCN-kemian prebioottisen merkityksen osalta: (i) HCN:n termodynaaminen epävakaus hydrolyyttisissä olosuhteissa, (ii) suppea valikoima nukleobaaseja, joka rajoittuu vain puriineihin, jotka voivat muodostua sen kondensaatioprosessissa. Jälkimmäisen havainnon perusteella ehdotettiin nukleiinihappojen täysin puriinipohjaista esiastetta, jossa nykyisissä nukleiinihapoissa esiintyvät pyrimidiinit olisivat niiden isoelektronisten ja isogeometristen puriinien postentsymaattisia korvikkeita. HCN on kaasu monenlaisissa ympäristöolosuhteissa. Näin ollen HCN:n kemia homogeenisessa liuoksessa (pitkälti hyväksytty kemiallinen prebioottinen skenaario alkukantaisella maapallolla) edellyttää ensin imeytymistä veteen. Adsorptioprosessin jälkeen HCN:n polymerisaatio ja hydrolyysi kilpailevat keskenään, ja tulokset määräytyvät sen pitoisuuden mukaan. Nämä kaksi reaktiota ovat ekvivalentteja, kun HCN:n pitoisuudet ovat 0,01-0,1 M (pH 8-9). Hydrolyysi formamidiksi (kuva 1, yhtälö A) vallitsee laimeissa liuoksissa, kun taas polymerisaatio vallitsee korkeammissa pitoisuuksissa . HCN:n vakaan tilan pitoisuus primitiivisessä valtameressä laskettiin sen tuotannon ja hydrolyysin arvioitujen nopeuksien perusteella olevan pH7:ssä 4 × 10-12 M 100 °C:ssa ja 2 × 10-5 M O °C:ssa. Nämä pitoisuudet ovat aivan liian alhaisia, jotta polymerisaatio nukleobaaseiksi tapahtuisi, mikä suosii hydrolyysiä formamidiksi .

Sen vuoksi, että HCN on haihtuvampaa kuin vesi, sitä ei voida konsentroida pelkällä haihduttamisella pH:ta alhaisemmalla pH:lla kuin sen pKa:lla (9,2 25 °C:ssa). Tämä viittasi eutektiseen jäätymiseen keinona, jolla HCN saavuttaa riittävän konsentraation polymerisaatiota varten .

Samaisessa tutkimuksessa formamidin hydrolyysinopeudeksi (ja vakaan tilan konsentraatioksi) ammoniumformiaatiksi (kuva 1, yhtälö B) arvioitiin myös 2 × 10-18, 1 × 10-15 ja 1 × 10-9 M 200, 100 ja 0 °C:n lämpötiloissa olettaen, että alkuaikojen valtameressä formamidia muodostui vain HCN:n hydrolyysin kautta.

Tekijät esittävät näiden tietojen perusteella, että ”on epätodennäköistä, että formamidilla olisi voinut olla merkittävä rooli prebioottisessa kemiassa”, mikä on varsin lopullinen lause tälle yhdisteelle!

Tämä oletus ei kuitenkaan ota huomioon sitä, että (i) formamidi voi muodostua prebioottisista yhdisteistä, jotka ovat suurelta osin levinneet alkukantaisessa maapallossa muista kuin HCN:stä, ja (ii) että formamidi on nestemäinen laajalla lämpötila- ja painearvojen vaihteluvälialueella, kiehumispisteen ollessa 210 °C ja atseotrooppisten vaikutusten ollessa hyvin vähäisiä . Näin ollen, toisin kuin HCN, formamidi voidaan kuivauslaguunimallissa helposti konsentroida, mikä lisää sen stabiilisuutta konsentroinnin yhteydessä ja tarjoaa riittävän konsentraation, jotta polymerisaatio nukleobaaseiksi voi tapahtua. Formamidin hydrolyysiä vedessä tarkasteltiin uudelleen tutkimalla liuottimen deuteriumin kineettistä isotooppivaikutusta. Tämän analyysin tuloksena khyd-vakiolle saatiin arvo 1,1 × 10-10 s-1, joka vastaa t1/2:n arvoa n. 200 vuotta 25 °C:ssa ja pH:ssa 7,0.

(iii) Reaktiivisuus

Orgaanisena yhdisteenä, joka kykenee tuottamaan ”paikan päällä” monia muita yksinkertaisia kemikaaleja, jotka ovat hyödyllisiä nukleobaasien synteesissä, formamidia voidaan pitää monikäyttöisenä prebioottisena esiasteena. Muodostuvien esiasteiden suhde riippuu erityisistä ympäristöolosuhteista.

190-210 °C:ssa ja ilmanpaineessa formamidi hajoaa termisesti joko ammoniakiksi (NH3) ja hiilimonoksidiksi (CO) (kuva 1, yhtälö C) tai HCN:ksi ja vedeksi (kuva 1, yhtälö D). HCN:n muodostumista suositaan yleensä sopivien katalyyttien läsnä ollessa, eli alumiinioksidien kanssa saanto 400 °C:n ja 600 °C:n välisissä lämpötiloissa on >90 %, kun taas katalyyttien puuttuessa NH3:n ja CO:n muodostusreaktio on vallitseva. Myös muita hajoamistuotteita havaitaan. Näitä ovat polymeeriset vetysyanidijohdannaiset, jotka mahdollisesti tuottavat nukleobaaseja hydrolyyttisissä olosuhteissa. Suuren dielektrisyysvakionsa ansiosta formamidi on lisäksi erinomainen liuotin sekä metallioksideille että epäorgaanisille suoloille, jotka voivat toimia katalyytteinä nukleobaaseiksi kondensoituvissa prosesseissa.

Siten formamidiin pääkomponenttina perustuvan reaktioseoksen koostumusta voidaan säätää ympäristössä olevan reaktorin koostumuksella, joka tarjoaa HCN:stä poiketen kaikki prebioottiset esiasteet, jotka ovat välttämättömiä sekä puriini- että pyrimidiini-nukleobaasien synteesissä. Vallitsevien tuotteiden paneelin koostumus riippuu reaktioympäristössä olevien katalyyttien erityisistä fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista, kuten jäljempänä selostetaan.

Nukleiinien esiasteiden synteesi formamidista

Nukleiiniset emäkset, yksi aminohappo ja kondensaattori

Nukleiiniset emäkset

Olemme havainneet, että formamidilla on se ainutlaatuinen ominaisuus, että se voi kondensoitua sekä puriini- että pyrimidiini-nukleobaaseiksi yksinkertaisesti kuumennettaessa 110-160 °C:n lämpötiloissa suurelta osin diffusoituneiden metallioksidien ja kivennäisaineita . Saadut tuotteet on lueteltu taulukossa 1, ristissä testattujen katalyyttien kanssa ja ryhmitelty (likimääräisesti) lisääntyvän monimutkaisuuden mukaan. Puriini on ainoa yhdiste, joka saadaan kuumentamalla formamidia ilman katalyyttejä. Tämän laajan tuotekokonaisuuden olennaisimmat näkökohdat ovat:

– kunkin katalyytin läsnäollessa saatujen yhdisteiden paneeli on ”puhdas”. Tuotteita havaitaan vain vähän, ja joissakin tapauksissa synteesi on hyvin spesifinen, kuten fosfaattimineraalin pyromorfiitin tapauksessa, joka tuottaa yksinomaan sytosiinia, tai lasteniitin tapauksessa, joka tuottaa lähes yksinomaan N-formyyliglysiiniä. Toisissa tapauksissa saadaan runsaampia tuotepaneeleja, kuten pyrofosfaatti Na4P2O7, joka tuottaa (puriinin lisäksi) adeniinia, hypoksantiinia (guaniinin bioisosteria), urasiilia, sytosiinia, N-formyyliglysiiniä ja karbodiimidiä; ja TiO2:n kanssa, jolloin saadaan (puriinin lisäksi) adeniini, N9-formyylipuriini, N9-N6-diformyyliadeniini, sytosiini, tymiini ja 5-hydroksimetyyliurasiili.

– Melko mielenkiintoista on, että TiO2 katalysoi myös puriinisyklonukleosidien synteesiä (ei raportoitu taulukossa 1, ks. viite 23). Tällä havainnolla on erityistä prebioottista merkitystä, koska tiedetään, että prebioottisissa olosuhteissa on vaikea muodostaa β-glykosidisidosta erikseen syntetisoitujen nukleobaasien ja sokerien välille . Joka tapauksessa jopa suhteellisen monimutkaisempien seosten tapauksessa tuoteprofiilit säilyttävät siisteyden luonteensa eivätkä yleensä sisällä hajoamistuotteita tai lisäyhdisteryhmiä.

Glysiini ja karbodiimidi

Fosfaattimineraalien katalysoimissa formamidipohjaisissa synteeseissä havaittiin α-aminohappojohdannainen N-formyyliglysiini, johon usein liittyi myös karbodiimidi . Karbodiimidi, joka on tärkeä aine aminohappojen kondensoitumisessa peptideiksi, voisi olla vastuussa formyyliglysiinin muodostumisesta in situ syntyneestä glysiinistä , mikä viittaa formamidi-fosfaattisysteemin rooliin peptidien prebioottisessa synteesissä.

Havaittiin myös olemassa olevien nukleiinihappojen komponenttien synteettisten polkujen välittäjäaineita, esim, 4-aminoimidatsoli-5-karboksamidi (AICA), 4-formyyliaminoimidatsoli-5-karboksamidi (f-AICA) ja 5-hydroksimetyyliurasiili.

Kemialliset mekanismit, joihin kaikki nämä synteesit perustuvat, kuvataan ja niistä keskustellaan kriittisesti .

Kemomimeesin käsite prebioottisten esiasteiden valitsijana

Kuten edellä mainittiin, nukleiinihappojen ensimmäisten prebioottisten esiasteiden identiteetti on edelleen kiistanalainen kysymys. Toisaalta yksinkertaisten orgaanisten molekyylien reaktiomekanismien analyysi paljastaa tapauksia, joissa syntyy myös keskeisiä välituotteita, jotka vastaavat nykyisissä biologisissa poluissa havaittuja. Näihin vastaavuuksiin sovelletaan kemomimesiksen käsitettä. Tämä termi, jonka Eschenmoser ja Loewenthal esittivät ensimmäisen kerran vuonna 1992 , viittaa yleensä kemialliseen reaktioreittiin, jota voidaan käyttää mallina entsymaattisille prosesseille, jotka esiintyvät myöhemmin evoluutiossa ja tuottavat samoja lopputuotteita. Tämän ominaisuuden perusteella voidaan periaatteessa erottaa kaksi prebioottisten esiasteiden luokkaa: esiasteet, jotka pystyvät synnyttämään kemomimeettisen prosessin, ja esiasteet, jotka eivät pysty siihen. Formamidikemia osoittaa mielenkiintoisia kemomimeettisiä tapauksia.

Esimerkiksi 5-aminoimidatsoli-4-karboksamidi (AICA) ja 5-formamido-imidatsoli-4-karboksamidi (f-AICA), joita saatiin suurella saannolla hypoksantiinin lisäksi kuumennettaessa formamidia montmorilloniittien läsnäollessa (taulukko 1), ovat myös keskeisiä välituotteita (ribonukleotidi-5′-monofosfaatteina) inosiini-5′-monofosfaatin (IMP) nykyisen biosynteesin viimeisissä vaiheissa, joka on pääasiallinen reitti puriininukleotideihin solussa (kuva 2).

Samoin formaldehydin lisääminen valmiiksi muodostettuun urasiilirakennelmaan tymiinin synteesin aikana formamidista ja TiO2:sta on keskeinen vaihe metyyliosan käyttöönotossa, mikä on sopusoinnussa tymidiinin olemassa olevan biosynteesin kanssa. Tässä reaktiossa uridiiniin lisätään formaldehydiyksikkö, joka on naamioitu metyleenitetrahydrofolaatin (MTHF) aktivoiduksi metyleeniyksiköksi, jolloin saadaan 5-hydroksimetyyliurasiili-5′-monofosfaatti (HMU-5′-monofosfaatti). Tymidiini saadaan peräkkäisellä hydridisiirtymällä.

Mahdollisuus, että varhaisilla kemiallisilla tapahtumilla oli mallin rooli monimutkaisempien (mutta myös tehokkaampien ja selektiivisempien) entsymaattisten polkujen kehityksessä, on kiehtova käsite, jota on arvioitava tarkemmin tutkittaessa molekyylisen evoluution molekyylisiä informaatiopolymeerejä.

Problems in prebiotic polymerization

Activated precursors

Lineaarisiin polymeereihin perustuvan geneettisen informaation evoluutio edellyttää templaattivälitteistä replikaatiomekanismia. Mallin avulla tapahtuva monistuminen mahdollistaa kertyneen informaation säilyttämisen ja ajoittaisen muuttamisen, mikä luo kemiallisesti perustuvia evoluutiosääntöjä. Oligonukleotidien templaattiohjattuun synteesiin perustuvat ei-entsymaattiset itsereplikoituvat järjestelmät on raportoitu (muun muassa ne, jotka raportoitiin vuonna , tarkasteltu vuonna ), ja ne ovat periaatteellinen todiste tämän yleisen mekanismin uskottavuudesta. Ensimmäiset esigeeniset polymeerit eivät välttämättä koostuneet nykyiset nukleiinihapot muodostavista sokeriryhmistä, eivätkä nukleosidit olleet väkisin sidoksissa toisiinsa nykyisin esiintyvillä fosforiesterisidoksilla. Mahdollisista vaihtoehdoista raportoitiin kattavat analyysit. Suorien todisteiden tai päinvastaisten vankkojen viitteiden puuttuessa voidaan kuitenkin turvallisesti olettaa, että geneettinen evoluutio sai alkunsa RNA:n kaltaisten polymeerien pohjalta, että riboosi- ja fosfodiesterisidokset olivat varsinaisia komponentteja, joiden ominaisuudet mahdollistivat ja käynnistivät evoluution, että molekyylihevoset eivät muuttuneet juoksun aikana. Syyt, jotka puoltavat fosfaattia yhdyselementtinä, ovat vakiintuneet .

Yleinen ongelma johtuu siitä, että fosfodiesterisidoksen muodostuminen on termodynaamisesti ylämäkeä. Siten fosfodiesterisidonnaisten oligonukleotidien templaattiohjattu proteiiniton prebioottinen synteesi vaati todennäköisesti kemiallisesti aktivoitujen nukleotidien käyttöä.

Formamidi-katalysoitu nukleosidien fosforylaatio

Aktivoitujen nukleosidien tuottamiseksi ehdotettujen mekanismien prebioottinen merkitys on kyseenalainen . Muuten tärkeä havainto, jonka mukaan kemiallisesti aktivoidun nukleosidin 5′-fosforimidatsolidi-adenosiinin (ImpA) kuivattaminen montmorilloniittisaven pinnalle esi-absorboitunutta dekanukleotidia voitiin pidentää jopa 30 lisänukleotidilla, ja vastaavat tulokset vertailukelpoisissa systeemeissä vuonna , kärsivät samasta rajoituksesta. Näin ollen kyseessä oli todennäköisesti tehokas ja kestävä katalyyttinen mekanismi nukleosidien aktivoimiseksi (mahdollisesti fosforyloimiseksi). Olemme havainneet, että nukleosidien fosforylaatio tapahtuu helposti formamidin ja fosfaatin luovuttajan läsnä ollessa. Luovuttaja voi olla liukoinen mono-, di- tai trifosfaatti tai erilainen fosforyloitu nukleosidi tai jokin useista kiteisistä fosfaattimineraaleista, kuten hydroksyyliapatiitti, libeteniitti ja pseudomalakiitti (tietoja ei ole esitetty yksityiskohtaisesti, toimitettu julkaistavaksi muualla). Fosforylaatio tapahtui riboosiryhmän 5′, 3′ tai 2′ C-atomilla ja 2′:Myös 3′ ja 3′:5′ syklisiä fosforiesterimuotoja havaittiin. Orgelin uraauurtavan havainnon perusteella, jonka mukaan dinukleosidifosfaatit muodostuivat adenosiinin 2′:3′ syklisestä fosfaatista, tällä syklisen fosfaatin ribonukleotidisysteemillä on mahdollisesti erityistä prebioottista merkitystä.

Vesipitoinen vs. ei-vesipitoinen

Linjaisten polymeerien kemiallisesti suhteellisen helppo muodostuminen aktivoiduista esiasteista ei ratkaise ongelmaa polymeerien alkuperästä. Van Holden kriittisesti arvioima vakiotilan Gibbsin vapaan energian muutoksen (ΔG°’) ongelma ja polymeerien luontainen epävakaus liuoksessa rajoittavat polymeerien muodostumista ja säilymistä vesiympäristössä. ΔG°’ -ongelma on suurin este nestemäisessä faasissa tapahtuville polymerisaatioille prebioottisissa olosuhteissa.

Edellä mainittu nukleosidien fosforylaatio mineraalipinnoilla saatiin formamidin läsnäollessa. Aktivoidut nukleiinimonomeerit voivat siis muodostua nestemäisessä ei-vesipitoisessa ympäristössä polymerisaation termodynamiikan kanssa yhteensopivissa olosuhteissa, mikä tarjoaa toimivan ratkaisun. Jos formamidilla saataisiin aktivoituja esiasteita nukleosidien fosforylaation kautta ja mahdollistettaisiin niiden polymerisaatio yksinkertaisella trans-fosforylaatioreaktiolla (vielä hypoteettinen mutta kemiallisesti uskottava prosessi), pregeneettisten molekyylien evoluutiota rajoittavaksi tekijäksi muodostuisi tuloksena syntyvien polymerisoituneiden muotojen stabiilisuus. Toisin sanoen, kun tarkastellaan olosuhteita, joissa esigeeniset polymeerit voisivat spontaanisti polymerisoitua, monistua ja kehittyä, fysikaalis-kemialliset parametrit, jotka suosivat tai mahdollistavat juuri polymeerisen tilan säilymisen, ovat ensiarvoisen tärkeitä. Siksi on kiinnostavaa määritellä ne termodynaamiset alkutilat, joissa polymeerinen tila olisi voinut suosia monomeeristä tilaa.

Nämä tilat tunnistettiin sekä deoksiribo- että ribojärjestelmille, mikä osoittaa, että tietyt lämpötilan ja liuottimen yhdistelmät suosivat polymeeristä tilaa. Nämä kapeikot ovat RNA:n kohdalla huomattavan laajempia kuin DNA:n kohdalla (vrt. tiedot kohdassa vs ).

”RNA-maailman” hypoteesin puitteissa tämä havainto osoittaa, että RNA:n kolmen tärkeän ominaisuuden lisäksi olisi otettava huomioon myös ominaisuus, jonka mukaan RNA:n pysyvyys on suotuisa. Tämä neljäs ominaisuus koostuu polymerisaatioprosessiin ja polymeerien stabiilisuuteen liittyvien termodynaamisten ja kineettisten parametrien kokonaisuudesta. Oligomeerien pysyvyyttä suosivat olosuhteet voisivat mahdollisesti antaa tietoa ympäristöstä, jossa ur-geneettiset molekyylit syntyivät ja säilyivät.

Kestävyys kriittisenä fenotyyppinä informaatiota sisältävien polymeerien evoluutiolle

Kuvitellessamme rekonstruoidaksemme siirtymävaihetta monomeereistä nykyisin tuntemiimme informaatiota sisältäviin polymeereihin ja tiivistäessämme yhteen edellä raportoidut tiedot olemme havainneet, että formamidi 1) kondensoituu kaikiksi nukleiinisiksi emäksiksi, joita tarvitaan muodostamaan nykyisiä nukleiinihappoja. Tämä prosessi vaatii vain kohtuullisen lämpötilan (110-160 °C) ja helposti saatavilla olevia katalyyttejä. 2) Muodostuu useita yhdisteitä, jotka kätkevät sisäänsä piilotetun β-glykosidisidoksen, mikä mahdollisesti ratkaisee kemiallisen pulman, jonka nukleiinien emästen reagoimattomuus sokerien kanssa aiheuttaa. 3) Esivalmistettujen nukleosidien formamidipohjaista fosforylaatiota havaittiin (muualla toimitetut tiedot), mikä tarjoaa uskottavan ratkaisun ongelmaan, joka liittyy kemiallisesti kestävään mekanismiin, jota tarvitaan aktivoitujen esiasteiden ei-nopeaan ja korkeatuottoiseen tuotantoon. Polymeerien muodostumisen voisi olettaa tapahtuvan formamidiohjatun templaattiohjatun trans-fosforylaatioprosessin kautta. Sopiva templaatti voisi olla mineraalipinta tai nukleiinipolymeerit. Nämä prosessit tarjoavat yksinkertaisen kemiallisen kehyksen, johon on kuvattu kaikki vaiheet yhden hiiliatomin yhdisteestä H2NCOH:sta aktivoituihin nukleotideihin. Kaikki nämä reaktiot edellyttävät formamidia rakennusaineena ja/tai katalysaattorina.

Mutta nykyiset organismit elävät vedessä, eivät formamidissa. Ja nukleiinihappojen rakenne ja ominaisuudet viittaavat vahvasti siihen, että vuorovaikutus veden kanssa on yksi niiden läheisimmistä ominaisuuksista. Missä vaiheessa siirtyminen formamidiympäristöstä veteen on voinut tapahtua?

Tässä vaiheessa olemme hypoteettisella pohjalla. Lähdetään liikkeelle mallista, jossa ribo-oligonukleotidin synteesi on tapahtunut yhdistämällä valmiiksi syntetisoituja nukleosideja ], jotka on fosforyloitu formamidikatalysoidulla fosforylaatiolla ja yhdistetty formamidikatalysoidulla trans-fosforylaatiolla (hypoteettinen). Nukleosidien väliset fosfodiesterisillat ovat voineet syntyä monomeerien välillä, jotka ovat sitoutuneet yksittäisinä yksikköinä fosfaattimineraalien pinnoille, jotka tarjoavat sekä fosfaattiosuuksien lähteen että oikean tilajärjestyksen. P-P-etäisyys venytetyssä nukleiinihapossa on vakiintunut 9,15 Å, mikä vastaa hyvin fosfaattimineraalien kidesolujen mittasuhteita, joiden a- ja b-arvot useissa eri mineraaleissa vaihtelevat 6 ja 10 Å:n välillä (ensimmäisen sukupolven vaihe). Vaihtoehtoisesti tai myöhemmässä vaiheessa fosfodiesterisillat olisivat muodostuneet aktivoitujen monomeerien välille, jotka ovat sitoutuneet yksittäisinä yksikköinä nukleiinihappomallille (toisen sukupolven vaihe). Molemmissa vaiheissa tarvitaan formamidia fosfaattisiltojen muodostumista ohjaavana kemikaalina.