… (Zhang et al., 2009) aiheuttivat vakavia ongelmia Flv4- ja Flv2-proteiinien karakterisoinnille. Ensin spekuloitiin, että tällainen kalvoassosiaatio tapahtuu Sll0218-proteiinin kautta, joka on integraalinen kalvoproteiini, jolla on neljä ennustettua transmembraaniheliksiä. Näin ei kuitenkaan käynyt, sillä Flv4 pysyi suurelta osin kalvofraktiossa myös ilman Sll0218-proteiinia (D fl v2-, D sll0218-19- ja D sll0218- 19/ fl ag – fl v4 -mutantit) (tietoja ei ole esitetty). Lisäksi Sll0218-proteiini liittyy suureen kalvokompleksiin Flv2/Flv4-heterodimeeristä riippumatta ( kuva 4). Lopuksi muuttamalla kaksivaiheista jakomenetelmää kalvojen alifraktiointia varten Sll0218-proteiini lokalisoitui tylakoidikalvoon, kun taas Flv4 ja Flv2 pyrkivät kyseisessä järjestelmässä assosioitumaan plasmakalvoon (kuva 2D). Jälkimmäinen assosiaatio näytti olevan voimakkaasti kationiriippuvainen (kuvat 2B ja 2C). Samanlainen käyttäytyminen raportoitiin hiljattain toiselle Synechocystis-proteiinille, vaikka kalvoassosiaatioon johtava mekanismi on epäselvä (Carmel et al., 2011). Flv2/Flv4-heterodimeerimallin ja sekvenssikohdistuksen perusteella proteiinin pinnalla tunnistettiin joitakin oletettuja metallin sitoutumiskohtia, joihin liittyy His-, Asp- ja Glu-jäämiä. Pintaan sitoutuneita metalleja havaittiin myös homologisissa rakenteissa. Esimerkiksi Synechococcus sp:n fl avodoxiinin kaltaisella domeenilla (PDB ID: 3HLY) on Ca 2+ , ja M. thermoacetica FprA:n (PDB ID: 1YCF, 1YCG ja 1YCH) pinnalla on useita Zn 2+ -sidottuja kohtia (Silaghi-Dumitrescu et al., 2005). Rakenteiden metalli-ionit ovat peräisin kiteytysliuoksesta, mutta osa metallia sitovista jäännöksistä on konservoitu tai korvattu samanlaisilla jäännöksillä mallissamme (ks. lisätaulukko 2 verkossa). Yhdessä nämä jäännökset saattavat olla vastuussa Flv2:n ja Flv4:n kationiriippuvaisesta assosioitumisesta kalvofraktioon. Mallin sähköstaattisen pintapotentiaalin analyysin perusteella Flv4-monomeerin pinta on negatiivisemmin varautunut (kuva 8B) ja sen pinnalla on enemmän oletettuja metallin sitoutumiskohtia kuin Flv2-monomeerin (ks. lisätaulukko 2 verkossa). Kun otetaan huomioon, että eristyspuskurissa käytetty kationikonsentraatio on paljon suurempi kuin todellisissa fysiologisissa olosuhteissa (kuvat 2B-2D), Flv2/Flv4:n sitoutuminen kalvoon in vivo saattaa olla ohimenevää ja palautuvaa. Flv2/Flv4:n erikoistuminen plasmakalvoon solun rikkoutuessa (kuva 2D) voi liittyä myös sen pintavaraukseen, sillä plasmakalvon sisäpinta on negatiivisempi kuin oikeanpuoleinen tylakoidikalvo (Barber, 1982; Körner ym., 1985). Tylakoidikalvon pintavaraus voi kuitenkin muuttua dramaattisesti fotosynteesin aikana, mikä voi välittää Flv2/Flv4:n kauttakulkusitoutumista myös tylakoidikalvoon. Sll0218-proteiini lokalisoitui yksiselitteisesti suuren molekyylimassan kompleksiin tylakoidikalvolla. Sll0218-proteiinin outo käyttäytyminen kalvon osafraktioiden tavanomaisessa kaksivaiheisessa jakojärjestelmässä viittasi kuitenkin siihen, että Sll0218-proteiini ei ole jakautunut tasaisesti tylakoidikalvossa. Se liittyy suureen kompleksiin, joka on vain marginaalisesti pienempi kuin suuri PSII-dimeeri. PSII-dimeerin ja PSII-monomeerikompleksien suhdeluvun heikkeneminen tapahtuu vain mutanteissa, joista puuttuu Sll0218-proteiini ( D sll0218-19 ja D fl v4 ), mutta ei D fl v2:ssa (kuva 5, taulukko 1). Näin ollen oletamme, että Sll0218 voi toimia chaperonina ilman CO 2 -tason olosuhteissa kootun PSII-dimeerin stabiloinnissa. Vaikka PSII-kompleksi on eristetty sekä monomeerisessä että dimeerisessä muodossa (Rögner ym., 1987; Hankamer ym., 1997; Adachi ym., 2009), on yleisesti hyväksytty, että in vivo PSII-kompleksi toimii dimeerinä sekä syanobakteereissa että korkeammissa kasveissa (Hankamer ym., 1999; Kuhl et al., 2000), kun taas monomeerinen PSII voi olla PSII:n normaalin kokoonpanon ja korjauksen välituote (Aro et al., 2005; Nixon et al., 2010). Vaikka PSII:n in vivo dimeroituminen syanobakteereissa on kyseenalaistettu detergenttien käytön vuoksi tylakoidikompleksien liuotuksessa ja in vitro -analyysissä (Takahashi et al., 2009; Watanabe et al., 2009), on olemassa vakuuttavia todisteita dimerin muodostumisesta mutanttien lähestymistavoilla. Monomeerin ja monomeerin rajapinnassa sijaitsevien pienten PSII-alayksiköiden PsbM ja PsbT on osoitettu olevan ratkaisevan tärkeitä PSII:n asianmukaisen kokoonpanon ja korjauksen kannalta (Ohnishi ja Takahashi, 2001; Iwai et al., 2004; Bentley et al., 2008). Koska Sll0218-proteiini ilmentyy vain alhaisissa (eli ilman CO 2 -olosuhteissa), oletamme, että PSII-dimeerien kokoaminen eroaa Sll0218-proteiinien läsnä- tai poissaolosta riippuen (ks. jäljempänä). Fotosynteesin optimointi edellyttää tiukkaa säätelyä aurinkoenergian imeytymisen ja muuntamisen kemialliseksi energiaksi sekä sen hyödyntämisen välillä myöhemmissä aineenvaihduntateissä. Vesiympäristössä eläville fotoautotrofeille, kuten syanobakteereille, CO 2 on välttämätön mutta usein vähäinen substraatti. Luonnollisissa ympäristöissä CO 2 :n riittämätön saatavuus, erityisesti kun se yhdistetään voimakkaaseen säteilytykseen, johtaa fotosysteemien suureen herätepaineeseen (Huner, 1998) ja rajoittaa fotosynteesin nopeutta. Tästä selviytymiseksi syanobakteereissa käynnistetään voimakkaasti useita CO 2 -konsentraatiomekanismeja matalan Ci:n olosuhteissa, jotta CO 2 -konsentraatio ribuloosi-1,5-bis-fosfaattikarboksylaasi/oksygenaasin ympärillä kasvaisi ja samalla indusoitaisiin syklistä elektronivirtausta, joka tuottaisi enemmän ATP:tä (katsaus teoksessa Kaplan ja Reinhold, 1999; Giordano et al., 2005; Badger et al., 2006; Price et al., 2008). Microarray- ja proteomitutkimukset ovat paljastaneet matalan CO 2 -stimulonin (Wang ym., 2004; Eisenhut ym., 2007; Battchikova ym., 2010), johon kuuluu myös operoni sll0217-19 ( fl v4- fl v2 ), jota säädellään yhtä voimakkaasti kuin indusoituvan CO 2 -rikastusmekanismin geenejä. Myös fl v2- ja fl v4-geeneillä on voimakas valovaste (Hihara et al., 2001; Zhang et al., 2009). Fl v4- ja fl v2 -inaktivaatiomutantit osoittivat suurta alttiutta PSII:n fotoinhibitiolle ilman CO 2 -olosuhteissa (Zhang ym., 2009). Lisäksi äskettäiset tutkimuksemme operonin ilmentymisestä paljastivat tämän operonin fl v4- fl v2 tiukan säätelyn pienten säätely-RNA:iden avulla (M. Eisenhut, J. Georg, S. Klähn, I. Sakurai, H. Silén, P. Zhang, W.R. Hess ja E.-M. Aro, julkaisemattomat tiedot). Tällainen vahva induktio ja säätely fl v4- fl v2-operonin antisense-RNA:lla yhdessä PSII:n havaitun suojelun kanssa ilman CO-tasolla ja korkean …