FRAP:ia voidaan käyttää myös kalvon ulkopuolisten proteiinien seurantaan. Kun kiinnostava proteiini on tehty fluoresoivaksi, yleensä ilmentämällä se GFP-fuusioproteiinina, konfokaalimikroskoopilla fotobleachataan ja seurataan sytoplasman, mitoottisen karan, ytimen tai muun solurakenteen aluetta. Alueen keskimääräinen fluoresenssi voidaan sitten piirtää kuvaajaan valohäviön jälkeen kuluneen ajan funktiona, ja tuloksena saadusta käyrästä voidaan saada kineettisiä kertoimia, esimerkiksi proteiinin sitoutumisreaktioille ja/tai proteiinin diffuusiokertoimelle väliaineessa, jossa sitä seurataan. Usein ainoina dynamiikkatekijöinä pidetään diffuusiota ja sitoutumis- ja sitoutumattomuusvuorovaikutuksia, mutta periaatteessa proteiinit voivat liikkua myös virtauksen kautta, ts, Tämä voi johtua sytoplasman tai nukleoplasman virtauksesta tai kuljetuksesta solun filamentteja, kuten mikrotubuluksia, pitkin molekyylimoottoreiden toimesta.

Analyysi on yksinkertaisinta silloin, kun fluoresenssin palautumista rajoittaa joko diffuusionopeus valkaistulle alueelle tai nopeus, jolla valkaistut proteiinit irtautuvat valkaistulla alueella sijaitsevista sitoutumispaikoistaan ja korvautuvat fluoresoivalla proteiinilla. Tarkastellaan näitä kahta rajaa tavallisessa tapauksessa, jossa GFP-fuusioproteiinia valkaistaan elävässä solussa.

Diffuusion rajoittama fluoresenssin palautuminenEdit

Ympyränmuotoiselle valkaisupisteelle, jonka säde on w {\displaystyle w}

ja diffuusio-ohjatulla palautumisella fluoresenssi kuvataan Soumpasiksen johtamalla yhtälöllä (joka sisältää muunnetut Besselin funktiot I 0 {\displaystyle I_{0}}

ja I 1 {\displaystyle I_{1}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) ) {\displaystyle f(t)=e^{-2\tau _{D}/t}\left(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)\right)}

mit τ D {\displaystyle \tau _{D}}}

diffuusiolle ominainen aikaskaala ja t {\displaystyle t}

on aika. f ( t ) {\displaystyle f(t)} {\displaystyle f(t)} on aika.

on normalisoitu fluoresenssi (muuttuu 1:ksi, kun t {\displaystyle t}

menee äärettömään). Diffuusion aikaskaala valkaistulle pisteelle, jonka säde on w, {\displaystyle w}

on τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, jolloin D on diffuusiokerroin.

Huomaa, että tämä koskee hetkellistä valkaisua, jossa on asteittainen funktioprofiili, eli fraktio f b {\displaystyle f_{b}}

proteiinista, jonka oletetaan valkaistuvan hetkellisesti hetkellä t = 0 {\displaystyle t=0}

on f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, ja f b ( r ) = 0 , r > w {\displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, sillä r {\displaystyle r}

on etäisyys valkaistun alueen keskipisteestä. Oletetaan myös, että palautuminen voidaan mallintaa diffuusiolla kahdessa ulottuvuudessa, joka on myös sekä tasainen että isotrooppinen. Toisin sanoen, että diffuusio tapahtuu tasaisessa väliaineessa, joten efektiivinen diffuusiovakio D on sama kaikkialla, ja että diffuusio on isotrooppista eli tapahtuu samalla nopeudella kaikilla tason akseleilla.

Käytännössä solussa mikään näistä oletuksista ei pidä täysin paikkaansa.

1. Huuhtoutuminen ei tapahdu hetkessä. Etenkin jos tarvitaan suuren alueen voimakasta valkaisua, valkaisu voi viedä huomattavan osan diffuusion aikaskaalasta τ D {\displaystyle \tau _{D}}
   

   . Tällöin merkittävä osa valkaistusta proteiinista diffundoituu valkaistulta alueelta todella valkaisun aikana. Tämän huomioimatta jättäminen aiheuttaa merkittävän virheen D:hen.

2. Valkaistun profiilin ei tarvitse olla säteittäinen askelfunktio. Jos valkaistu piste on käytännössä yksittäinen pikseli, valkaisu sijainnin funktiona on tyypillisesti diffraktiorajoitteinen ja määräytyy käytetyn konfokaalisen laserkeilausmikroskoopin optiikan mukaan. Tämä ei ole säteittäinen askelfunktio, ja se vaihtelee myös tasoon nähden kohtisuorassa olevaa akselia pitkin.
3. Solut ovat tietenkin kolmiulotteisia, eivät kaksiulotteisia, samoin kuin valkaistu tilavuus. Diffuusion huomiotta jättäminen tasosta (pidämme sitä xy-tasona) on järkevä approksimaatio vain, jos fluoresenssi palautuu pääasiassa diffuusion kautta tässä tasossa. Tämä pätee esimerkiksi, jos valkaistaan sylinterinmuotoinen tilavuus, jonka akseli on z-akselin suuntainen, ja jos tämä sylinterinmuotoinen tilavuus kulkee koko solun korkeuden läpi. Tällöin diffuusio z-akselin suuntaisesti ei aiheuta fluoresenssin palautumista, koska kaikki proteiini valkaistaan tasaisesti z-akselin suuntaisesti, joten sen huomiotta jättäminen, kuten Soumpasiksen yhtälössä tehdään, on vaaratonta. Jos diffuusio z-akselia pitkin kuitenkin vaikuttaa fluoresenssin palautumiseen, se on otettava huomioon.
4. Ei ole mitään syytä olettaa solun sytoplasman tai nukleoplasman olevan täysin spatiaalisesti yhtenäinen tai isotrooppinen.

Siten Soumbaasin yhtälö on vain hyödyllinen approksimaatio, jota voidaan käyttää silloin, kun edellä luetellut oletukset ovat hyviä approksimaatioita todelliselle tilanteelle ja kun fluoresenssin palautumista rajoittaa todellakin diffuusion aikaskaala τ D {\displaystyle \tau _{D}}

. Huomaa, että se, että Soumpasis voidaan sovittaa riittävästi dataan, ei välttämättä tarkoita, että oletukset pitävät paikkansa ja että diffuusio hallitsee palautumista.

Reaktiorajoitteinen palautuminenEdit

Fluoresenssia ajan funktiona kuvaava yhtälö on erityisen yksinkertainen toisessa raja-arvossa. Jos suuri määrä proteiineja sitoutuu pienessä tilavuudessa oleviin paikkoihin siten, että siellä fluoresenssisignaalia hallitsee sitoutuneiden proteiinien signaali, ja jos tämä sitoutuminen tapahtuu kaikki yhdessä tilassa, jonka sammumisnopeus on koff, niin fluoresenssi ajan funktiona saadaan seuraavalla kaavalla

f ( t ) = 1 – e – k off t {\displaystyle f(t)=1-e^{-k_{{\text{off}}t}}}}

Huomaa, että palautuminen riippuu vain sitoutumisen irtoamisnopeuden vakiosta koff. Se ei riipu sitoutumisen nopeudesta. Tosin se riippuu useista oletuksista

1. On-nopeuden on oltava riittävän suuri, jotta sidotun proteiinin paikallinen konsentraatio ylittää huomattavasti vapaan proteiinin paikallisen konsentraation, ja näin ollen voimme jättää huomiotta vapaan proteiinin osuuden f:ään.
2. Reaktio on yksinkertainen bimolekulaarinen reaktio, jossa proteiini sitoutuu paikallisiin paikkoihin, jotka eivät liiku merkittävästi palautumisen aikana
3. Vaihtuminen on paljon hitaampaa kuin diffuusio (tai mikä tahansa kuljetusmekanismi on vastuussa liikkuvuudesta), koska vain silloin diffuusiossa oleva fraktio palautuu nopeasti ja toimii tällöin fluoresoivan proteiinin lähteenä, joka sitoutuu ja korvaa sidotun valkaistun proteiinin ja lisää näin fluoresenssia. Kun r on valkaistun pisteen säde, tämä tarkoittaa, että yhtälö pätee vain, jos sidotun proteiinin elinikä 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{\text{off}}>>r^{2}/D}
   

   .

Jos kaikki nämä oletukset täyttyvät, eksponentiaalin sovittaminen elpymiskäyrään antaa off-nopeusvakion, koff. Muut dynamiikat voivat kuitenkin antaa eksponentiaalin kaltaisia palautumiskäyriä, joten eksponentiaalin sovittaminen ei välttämättä tarkoita, että palautumista hallitsee yksinkertainen bimolekulaarinen reaktio. Yksi tapa erottaa toisistaan palautuminen, jonka nopeus määräytyy sitoutumattomuuden perusteella, ja palautuminen, jota rajoittaa diffuusio, on huomata, että palautumisnopeus sitoutumattomuuden perusteella tapahtuvassa palautumisessa on riippumaton valkaistun alueen r koosta, kun taas se skaalautuu muodossa r – 2 {\displaystyle r^{-2}}

, diffuusion rajoittaman palautumisen tapauksessa. Jos siis pieni ja suuri alue valkaistaan, jos palautumista rajoittaa sitoutumattomuus, palautumisnopeudet ovat samat molempien valkaistujen alueiden koossa, kun taas jos palautumista rajoittaa diffuusio, se on paljon hitaampaa suuremmalla valkaistulla alueella.

Diffuusio ja reaktioEdit

Yleisesti fluoresenssin palautumista ei hallitse yksinkertainen isotrooppinen diffuusio eikä yksi yksinkertainen sitoutumattomuusnopeus. Tapahtuu sekä diffuusiota että sitoutumista, ja itse asiassa diffuusiovakio ei välttämättä ole tasainen tilassa, ja sitoutumiskohtia voi olla useampia kuin yksi tyyppi, ja näillä paikoilla voi myös olla epätasainen jakautuminen tilassa. Myös virtausprosessit voivat olla tärkeitä. Tämä monimutkaisempi käyttäytyminen merkitsee, että datan kuvaamiseen tarvitaan malli, jossa on useita parametreja; mallit, joissa on vain joko yksi diffuusiovakio D tai yksi off-nopeusvakio, koff, ovat riittämättömiä.

On olemassa malleja, joissa on sekä diffuusio että reaktio. Valitettavasti yksittäinen FRAP-käyrä voi olla riittämätön todiste, jotta se sopisi luotettavasti ja yksiselitteisesti (mahdollisesti kohinaiseen) kokeelliseen dataan. Sadegh Zadeh et al. ovat osoittaneet, että FRAP-käyriä voidaan sovittaa diffuusiovakion ja on-rate-vakion eri arvopareilla, tai toisin sanoen, että FRAP-käyrien sovitukset eivät ole ainutlaatuisia. Tämä on kolmen parametrin (on-rate-vakio, off-rate-vakio ja diffuusiovakio) sovituksissa. Sovitukset, jotka eivät ole yksikäsitteisiä, eivät yleensä ole käyttökelpoisia.

Siten malleissa, joissa on useita parametreja, yksi FRAP-koe voi olla riittämätön kaikkien malliparametrien estimoimiseksi. Silloin tarvitaan lisää dataa, esim. valkaisemalla erikokoisia alueita, määrittämällä joitakin malliparametreja itsenäisesti jne.

.