Viime vuosikymmenen aikana kemogeneettiset ja optogeneettiset tekniikat ovat mullistaneet integratiivisen neurotieteen tarjoamalla uusia työkaluja, joilla voidaan manipuloida palautuvasti tiettyjen populaatioiden tai välittäjäainejärjestelmien aktiivisuutta suuremmalla selektiivisyydellä (Sternson ja Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et ai., 2017). Verrattuna optogenetiikkaan, joka mahdollistaa nopean ja vaiheittaisen neuronaalisen modulaation suurella ajallisella resoluutiolla, kemogenetiikka mahdollistaa järjestelmien laajemman modulaation, mikä on erityisen hyödyllistä tutkimuksissa, joissa keskitytään tonaalisiin ilmiöihin (esim. dopamiinin vaikutuksen tutkiminen motivaatioprosesseihin; Whissell et ai., 2016). Kemogeneettisten työkalujen joukossa käytetään laajalti suunnittelijareseptoreita, jotka on yksinomaan aktivoitu suunnittelijalääkkeillä (DREADD), ja niitä kutsutaan biologiseksi ”lukko-avain”-järjestelmäksi solujen aktiivisuuden valikoivaan manipulointiin G-proteiinien signalointireittien kautta. Rothin ryhmä kehitti ensimmäisenä erittäin tyylikkään järjestelmän (Armbruster ym, 2007, tämä G-proteiiniin kytketty reseptori (GPCR) on muskariinireseptori: lukko, joka on mutatoitu reagoimaan vain klotsapiini-N-oksidiin (CNO), avain, joka on epätyypillisen antipsykoottisen klotsapiinin johdannaismetaboliitti, jolla muutoin ei ole mahdollisesti mitään farmakologista aktiivisuutta.

Joissakin julkaisuissa on kuitenkin vuodesta 2016 lähtien tuotu esiin huolestuttavia kysymyksiä CNO:n käytön suhteen. Ensinnäkin suhteellisen suurilla systeemisesti annetuilla CNO-annoksilla (10 mg/kg) voi olla farmakologista off-target-aktiviteettia, kuten osoittaa sellaisten käyttäytymisvaikutusten indusoituminen rotilla ja hiirillä, joita DREADD:t eivät välitä (MacLaren ym., 2016; Gomez ym., 2017; Baerentzen ym., 2019). Lisäksi Gomez et al. (2017) osoittivat, että CNO ei läpäise helposti veri-aivoesteen, sillä saattaa olla alhainen DREADD-sitoutumisaffiniteetti, ja se metaboloitui takaisin klotsapiiniksi, jolloin siitä tuli DREADD:ien todellinen vaikuttaja. Näiden silmiinpistävien havaintojen perusteella he ehdottivat pienten klotsapiiniannosten (0,1 mg/kg) suoraa käyttöä DREADD:n aktivoimiseksi CNO:n sijasta. Pienien klotsapiiniannosten käyttämiseen suurten CNO-annosten sijasta, jotka muuttuvat vähitellen klotsapiiniksi, liittyy kuitenkin kaksi suurta rajoitusta. Ensinnäkin ei ole ilmeistä, että klotsapiini akuutissa injektiossa tai pitkittyneessä diffuusiossa vaikuttaa DREADD:iin samalla tavalla (Mahler ja Aston-Jones, 2018). Toiseksi, koska klotsapiini on epätyypillinen antipsykoottinen aine, sillä on lukuisia endogeenisiä kohteita, kuten serotoniini-, muskariini- tai dopaminergisiä reseptoreita, joilla on suhteellisen voimakkaat affiniteetit (Meltzer, 1989; Schotte ym., 1993; Brunello ym., 1995; Ashby ja Wang, 1996; Armbruster ym., 2007) ja jotka todennäköisesti aiheuttavat off-target-vaikutuksia, jopa pienillä annoksilla. DREADD-kokeisiin suositellun 0,1 mg/kg klotsapiiniannoksen onkin todettu lisäävän merkittävästi ahdistuneisuuteen liittyvää käyttäytymistä hiirillä (Manzaneque et al., 2002) sekä rotilla (vaikutus, jonka havaitsimme myös me; R. Goutaudier ja S. Carnicella, julkaisemattomat havainnot), joissa klotsapiini vaikuttaa myös liikkumiseen mahdollisen sedaation kautta ja heikentää kognitiivista joustavuutta (Ilg et al., 2018).

Vaikka näiden vaikutusten esiintyminen voi riippua käytetystä lajista, kannasta tai sukupuolesta, ja ne voivat olla hyvin diskreettejä (koska ne eivät vaikuta kaikkiin käyttäytymisulottuvuuksiin); niillä on potentiaalia häiritä merkittävästi eläinten suoriutumista erilaisissa käyttäytymistehtävissä. Korkea stressi ja ahdistus voivat olla sekoittavia tekijöitä esimerkiksi muisti- tai kipututkimuksissa (Sousa et al., 2006; Sorge et al., 2014). Lisäksi väärinkäytön huumeisiin tai psykiatrisiin häiriöihin, kuten skitsofreniaan, ahdistuneisuuteen tai kognitiiviseen joustavuuteen liittyvä käyttäytyminen voi muuttaa koko fenotyyppiä (Floresco ym., 2009; Koob ja Schulkin, 2018). Näiden havaintojen perusteella klotsapiinin suhteen tarvitaan tärkeitä varotoimia, jotta vältytään puolueellisilta käyttäytymistutkimuksilta.

Olisiko uusi molekyyli, joka on suunniteltu nimenomaan DREADD-oireyhtymiä varten, valikoivampi? Yhdiste 21 (C21) on synteettinen DREADD-ligandi, joka kehitettiin vuonna 2015 (Chen ym., 2015) ja karakterisoitiin osittain in vitro sekä in vivo vuonna 2018 (Thompson ym., 2018). Jälleen kerran pienillä annoksilla (<3 mg/kg) sen kuvattiin olevan vailla käyttäytymiseen liittyviä off-target-vaikutuksia ja kykenevän muuttamaan DREADD-ekspressoivien eläinten käyttäytymistä. Tätä tutkimusta vahvistivat Jendryka et al. (2019), jotka tekivät farmakokineettisiä ja farmakodynaamisia kokeita hiirillä ja C21:llä (3 mg/kg). He osoittivat, että 30 minuuttia C21:n antamisen jälkeen molekyylin konsentraatio CSF:ssä oli >10 kertaa suurempi kuin DREADD:n aktivoitumisen arvioitu EC50 (CSF = 40 nm ja EC50DREADDs = 3 nm), ja ilman takaisimetaboliaa klotsapiiniksi. Tuoreen BioRxiv preprint -tutkimuksen tulokset rotilla, hiirillä ja makakeilla (Bonaventura et al., 2018) viittaavat kuitenkin siihen, että vaikka C21:llä on alhainen aivojen läpäisevyys, jo 1 mg/kg:n annos voi muuttaa aivotoimintaa villityypin hiirillä. Lisäksi havaittiin heikko affiniteetti ja miehitys DREADD:iin in vitro rotan aivoviipaleissa sekä in vivo hiirillä ja makakeilla positroniemissiotomografiatutkimuksessa. Perustuen samaan kokeelliseen tutkimukseen kuin C21:n kohdalla, he ehdottivat vaihtoehdoksi kahta muuta ligandia, JHU37152:ta ja JHU37160:tä, joilla on korkeampi in vivo -tehokkuus DREADD:iin ja mahdollisesti vähemmän off-target-vaikutuksia (Bonaventura et al., 2018). Vaikka tämä uuden sukupolven DREADD-ligandit vaikuttavat lupaavilta, ne ovat uutuutensa vuoksi edelleen heikosti karakterisoituja ja rakenteellisesti edelleen homologisia klotsapiinin ja CNO:n kanssa. Täydellinen karakterisointi solu-käyttäytymistutkimuksessa on siksi ratkaisevan tärkeää, jotta voidaan sulkea pois CNO: lle havaitut mahdolliset sudenkuopat.

Vaihtoehtoinen ratkaisu kemogeneettisten lähestymistapojen selektiivisyyden parantamiseksi olisi käyttää toista lukko- ja avainyhdistelmää. Sellaisenaan κ-opioidireseptori-DREADD (KORD) on ihmisen κ-opioidireseptorista johdettu mutatoitunut inhiboiva GPCR (Vardy et al., 2015). Verrattuna klassisiin DREADD-yhdisteisiin, jotka sitovat klotsapiinia, CNO-, C21- tai JHU-yhdisteitä, KORDiin sitoutuu salvinoriini B, joka on KOR-selektiivisen agonistin salvinoriini A: n huumeiden kaltainen metaboliitti. Vaikka tätä kemogeneettistä lähestymistapaa käytettiin tyylikkäästi yhdistettynä aktivoivaan DREADDiin, jotta saatiin luotua ”ON- ja OFF” -järjestelmä samassa neuronipopulaatiossa (Vardy et ai.., 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), sitä käytetään edelleen marginaalisesti, koska se vähentää neuronaalista aktiivisuutta vain lyhyen ajanjakson aikana (Aldrin-Kirk ja Björklund, 2019). Lisäksi salvinorin B:llä on jonkin verran affiniteettia endogeeniseen KOR:iin suurina pitoisuuksina, eikä sille ole vielä tehty perusteellista karakterisointia, kuten DREADD:hen liittyville yhdisteille tällä hetkellä tehdään (Roth, 2016). GPCR:n korvaaminen mutatoidulla ionikanavalla, toinen vaihtoehtoinen suunniteltu reseptori, jota kutsutaan ligandi-ohjatuiksi ionikanaviksi (ligand-gated ion channels, LGIC), on Stensonin laboratorion kehittämä vaihtoehto (Magnus et ai., 2011). DREADD:iin verrattuna LGIC:t yhdistävät mutatoidun nikotiinireseptorin ligandia sitovan domeenin toisen valitun reseptorin ionihuokosdomeeniin luodakseen kimeerisen ionikanavan. DREADD:ien tavoin tämä hybridikanava aktivoituu pienellä agonistilla, joka on peräisin kinuklidinyylibentsamidista, α7-nikotiinisen asetyylikoliinireseptorin agonistista, ja se mahdollistaa ioninvaihdon neuronikalvon läpi. Muiden tälle lähestymistavalle ominaisten rajoitusten (Aldrin-Kirk ja Björklund, 2019) ohella se jakaa DREADD-kanavien kanssa myös farmakologisen ligandin käytön, joka voi mahdollisesti olla vuorovaikutuksessa endogeenisten reseptorien kanssa koeolosuhteista riippuen. Lopuksi, kaikki nämä lukot ovat peräisin endogeenisistä reseptoreista, eivätkä ne sellaisenaan pääse eroon farmakologiaan luontaisesti liittyvistä rajoituksista.

Tämän viimeaikaisen kehityksen ja jäljellä olevien kysymysten lisäksi on esitettävä ratkaiseva kysymys: löydetäänkö koskaan täysin selektiivistä ja inerttiä avainta? Todennäköisesti ei. On tärkeää pitää mielessä, että DREADD:t ovat kemogeneettisiä välineitä, joissa yhdistyvät genetiikka ja farmakologia. Vaikka geneettiset lähestymistavat mahdollistavat tehokkaan lukkojen (eli DREADD:ien) ilmentymisen hallinnan tietyissä solupopulaatioissa tai alipopulaatioissa ehdollisilla lähestymistavoilla, ne ovat peräisin endogeenisistä GPCR:istä, ja sellaisenaan niihin sovelletaan samoja rajoituksia kuin avaimen klassiseen farmakologiaan. Siksi on epätodennäköistä, että löydetään molekyylejä, joilla on korkea sitoutumisaffiniteetti DREADD:iin ilman affiniteettia joihinkin niistä lukuisista reseptoreista, joita on jo olemassa aivoissa ja jotka ovat läheistä sukua DREADD:ille. Esimerkiksi klotsapiinilla on erittäin suuri affiniteetti DREADD:iin, mutta myös serotoniinergiseen reseptoriin 5-HT2 (Ki = 10-8 molemmille; Armbruster ym., 2007; Gomez ym., 2017), ja suuri affiniteetti laajaan joukkoon muita GPCR-reseptoreita (Ki = 10-7 – 10-6; Armbruster ym., 2007). Jopa synteettisillä ligandeilla, jotka on erityisesti suunniteltu tätä kemogeneettistä tekniikkaa varten, on huomattava affiniteetti endogeenisiin reseptoreihin. Esimerkiksi vaikka JHU37152:lla ja JHU37160:lla on pienempi affiniteetti 5-HT-reseptoreihin kuin klotsapiinilla, niillä on kaiken kaikkiaan samanlainen kohdeprofiili kuin tällä lääkkeellä, ja niillä on jopa suurempi affiniteetti muskariinireseptoreihin (Bonaventura et al., 2018), mikä viittaa mahdollisesti voimakkaampiin off-target-vaikutuksiin. C21:llä on myös suurempi affiniteetti histaminergiseen H1-reseptoriin kuin DREADD-reseptoreihin (Ki > 10-8 ja Ki = 10-7,2, vastaavasti; Thompson et al., 2018) ja suurempi sitoutumispotentiaali opioidireseptoreihin kuin klotsapiinilla (Bonaventura et al., 2018). Tämän tehokkaan lähestymistavan sudenkuoppien minimoimiseksi on keskeisestä valinnasta riippumatta noudatettava kriittisiä varotoimia (kuva 1).

Ensin ennen mitä tahansa käyttäytymiskoetta on testattava koeolosuhteet parhaan ligandin ja optimaalisen annoksen tai optimaalisten annosten löytämiseksi, kokeellisesta lähestymistavasta riippuen. DREADDeja ei pidä pitää avaimet käteen -työkaluna; solu-, neurokemialliset tai elektrofysiologiset kokeet on suoritettava ennen käyttäytymistutkimusta (Mahler et ai., 2014; Beloate et ai., 2016; Boekhoudt et ai., 2016), jotta voidaan vahvistaa ligandin tehokkuus valitulla annoksella kiinnostavassa järjestelmässä. Lisäksi mukaan on otettava myös DREADD:tä vailla olevia kontrollieläimiä, jotta voidaan varmistaa, ettei ligandilla tai reseptorilla sinänsä ole epäspesifisiä neurobiologisia vaikutuksia, jotka saattavat aktivoitua välittäjäaineen vaikutuksesta tai joilla voi olla konstitutiivinen aktiivisuus (Saloman et al., 2016).

Toisekseen, jos mahdollista, on testattava kahta erilaista DREADD:n ligandia, jotta voidaan varmistua siitä, että havaitut käyttäytymisvaikutukset ovat spesifisesti DREADD:n välittämiä. Spesifiset farmakologiset vaikutukset DREADD:iin olisivat samanlaisia, mutta off-target-vaikutukset voivat erota.

Kolmanneksi, ja kriittisin kohta, on käytettävä tavanomaisia farmakologisia kontrolleja. Samaa filosofiaa kuin farmakologiassa on sovellettava, ja kuten neurobiologisissa kokeissa, ryhmät siirtogeenisistä eläimistä, jotka eivät ilmentäisi DREADDeja (esim. DREADD-tyhjät virusvektorit), on integroitava, jotta ligandin ja valitun annoksen selektiiviset vaikutukset voidaan todentaa (Smith ym., 2016, Campbell ja Marchant, 2018; Mahler ja Aston-Jones, 2018; esimerkkinä tätä suunnitelmaa noudattavista kokeellisista kokeellisista tutkimuksista ks. myös Xia ym., 2017; Cope ym., 2019). Tämä lausunto saattaa vaikuttaa triviaalilta, mutta absoluuttisen selektiivisen ligandin tavoittelu ja tämän lähestymistavan houkuttelevuus ovat jo johtaneet joihinkin ylimalkaisiin käyttäytymistutkimuksiin, jotka on joskus suoritettu täysin ilman tätä kontrollia.

Johtopäätöksenä DREADD:t tarjoavat täsmällisen tavan manipuloida hermopiirejä ja käyttäytymistä, ja ne tarjoavat loistavan vaihtoehdon optogenetiikalle, jotta voidaan tonaalisesti manipuloida tiettyä solujen alipopulaatiota, mikä avaa jännittäviä uusia tutkimusväyliä. Aivan kuten valon lämpöominaisuudet optogenetiikassa voivat kuitenkin johtaa epäspesifisiin vaikutuksiin (ks. myös Owen et al., 2019), kemogenetiikassa tarvitaan suurempaa varovaisuutta, ja vakiokontrollien on oltava pakollisia. DREADD:n rajoitukset on tunnustettava, ja on varattava aikaa mahdollisten off-target-vaikutusten välttämiseen tai hallintaan ja sen tarkistamiseen, että tämä lähestymistapa ei sinänsä aiheuta harhaa. Käyttämällä genetiikan vahvuuksia ja kiinnittämällä samalla huomiota farmakologian heikkouksiin voidaan maksimoida tämän lähestymistavan mahdollisuudet.