DDRGK1:tä tarvitaan ER:n homoeostaasiin

Ymmärtääksemme DDRGK1:n selkärakenteellista roolia tarkastelimme, mitä vaikutuksia on ollut DDRGK1:n pudottamisella, kun käytettiin kahta aiemmin kuvattujen siRNA:iden seosta21 . Havaitsimme, että DDRGK1:n knockdown aiheutti sekä MCF7- että HepG2-soluissa apoptoottisen solukuoleman, jota luonnehtivat Annexin V/PI-värjäytyminen (kuva 1a), kaspaasi-3-aktivoituminen ja PARP:n pilkkoutuminen (kuva 1b). On huomattava, että voimme havaita DDRGK1:n knockdownin aiheuttaman kaspaasi-3:n pilkkoutumisen HepG2-soluissa mutta emme MCF7-soluissa, koska MCF7-solut ovat kaspaasi-3-puutteellisia22. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi (Q-PCR) osoitti, että DDRGK1:n knockdown lisäsi pro-apoptoottisten geenien BAX, BAK, NOXA, DR5 ja Bid ilmentymistä, kun taas anti-apoptoottisen geenin Bcl-2:n ilmentyminen väheni (kuvat 1c,d). Tärkeää oli, että havaitsimme, että DDRGK1:n knockdown MCF7- ja HepG2-soluissa indusoi ER-stressivasteet, jolloin BiP:n, HSPA8:n ja CHOP:n ER-stressille spesifinen geeniekspressio lisääntyi (Kuva 1e,f).

(a) MCF7- ja HepG2-soluja transfektoitiin joko kontrolli-siRNA:lla tai DDRGK1:een kohdistuvalla siRNA:lla 72 h. Tämän jälkeen solut värjättiin Annexin V:llä ja PI:llä, ja niille tehtiin virtaussytometrinen analyysi, jonka jälkeen apoptoottisten solujen (Annexin V+) kvantifiointi. (b) Western blot -analyysi PARP:stä ja pilkotusta kaspaasi-3:sta kontrolli- ja DDRGK1-knockdown MCF7- ja HepG2-soluissa, jotka on kuvattu kohdassa a. (c,d) Q-PCR-analyysi BAX:n, BAK:n, NOXA:n, Bid:n, DR-5:n ja Bcl-2:n suhteellisista mRNA:n ilmentymistasoista kontrolli- ja DDRGK1-knockdown MCF7- ja HepG2-soluissa. (e,f) Q-PCR-analyysi BiP:n, HSPA8:n ja CHOP:n suhteellisista mRNA-ekspressiotasoista kontrolli- ja DDRGK1-knockdown MCF7- ja HepG2-soluissa. Kaikki tiedot esitetään kolmen kokeen keskiarvoina±s.d.. *P<0.05, **P<0.01 ja ***P<0.001 Studentin t-testillä.

Vahvistaaksemme edelleen, että DDRGK1 on osallisena ER-stressivasteessa, määrittelimme DDRGK1:n vaikutuksen solujen eloonjäämiskykyyn sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty ER-stressiä indusoivilla aineilla, kuten kapsigaggiinilla (Tg) ja tunikamysiinillä (Tm). DDRGK1:n alasajo lisäsi Tg-käsittelyn aiheuttamaa ER-stressin aiheuttamaa apoptoosia sekä HepG2- että MCF7-soluissa, mitä arvioitiin Annexin V/PI-värjäyksellä ja kaspaasi-3:n ja PARP:n pilkkoutumisella (kuva 2a-c ja täydentävät kuvat 1A-C). Sitä vastoin DDRGK1:n yliekspressio vähensi ER-stressin aiheuttamaa solukuolemaa HepG2-soluissa (Kuva 2d-f). Lisäksi MCF7-solujen elinkelpoisuutta arvioitiin MTT-määrityksellä, ja tulokset osoittivat, että DDRGK1:n tyrmäys teki soluista herkempiä Tg- tai Tm-käsittelylle ja vähensi solujen elinkelpoisuutta (lisäyskuva 1D), kun taas DDRGK1:n yli-ilmentäminen edisti solujen selviytymistä Tg- tai Tm-käsittelyn jälkeen (lisäyskuva 1E). Kaiken kaikkiaan tuloksemme viittaavat siihen, että DDRGK1:llä on elintärkeä rooli ER-homoeostaasin säätelyssä.

(a). HepG2-soluja transfektoitiin kontrolli-siRNA:lla tai DDRGK1:n vastaisella siRNA:lla 72 tunnin ajan, minkä jälkeen soluja käsiteltiin DMSO:lla (Vehikkeli-kontrolli) tai Tg:llä (2,5 μM) 24 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta. Solut värjättiin Annexin V:llä ja PI:llä, minkä jälkeen tehtiin virtaussytometrinen analyysi. (b). Apoptoottisten solujen (Annexin V+) kvantitatiivinen määritys a:ssa. (c) Western blot -analyysi PARP:stä ja pilkotusta kaspaasi-3:sta a:ssa kuvatuissa HepG2-soluissa. (d) HepG2-solut transfektoitiin kontrollivektorilla tai DDRGK1:llä 36 h, ja soluja käsiteltiin DMSO:lla tai Tg:llä (2,5 μM) 24 h ennen sadonkorjuuta. Solut värjättiin Annexin V:llä ja PI:llä, minkä jälkeen tehtiin virtaussytometrinen analyysi. (e) Apoptoottisten solujen (Annexin V+) kvantitatiivinen määritys kohdassa d. (f) Western blot -analyysi PARP:stä ja pilkotusta kaspaasi-3:sta HepG2-soluissa, jotka on kuvattu kohdassa d. Kaikki tiedot on esitetty keskiarvoina±s.d. kolmesta kokeesta. **P<0.01 ja ***P<0.001 Studentin t-testillä.

DDRGK1 moduloi UPR:ää

Ymmärtääksemme, miten DDRGK1 säätelee ER:n homoeostaasia, analysoimme ensin kolmen UPR-sensorin ja niiden myötävirtauskohteiden proteiinipitoisuuksissa tapahtuneita muutoksia DDRGK1:n depletoiduissa soluissa. Tulokset osoittivat, että DDRGK1:n knockdown MCF7- ja HepG2-soluissa vähensi merkittävästi IRE1α:n kokonaistasoja, mutta vähensi heikosti fosforyloidun IRE1α:n (p-IRE1α) tasoja, mikä voi johtua IRE1α:n kokonaistasojen vähenemisestä (Kuva 3a). ATF6:n ja pilkotun ATF6:n tasoihin ei ollut vaikutusta (kuva 3a). Mielenkiintoista on, että DDRGK1:n knockdown ei vaikuttanut PERK:n kokonaistasoihin, mutta fosforyloitujen PERK:n (p-PERK) ja BiP:n tasot kasvoivat merkittävästi (kuva 3a). Tämän jälkeen tutkittiin DDRGK1:n vähentämisen vaikutuksia IRE1α-substraattiin XBP1. Tulokset osoittivat, että XBP1s, XBP1:n splikoitu muoto, väheni merkittävästi DDRGK1:n vähentämisessä MCF7-soluissa ajasta riippuvaisella tavalla (kuva 3b), mikä korreloi IRE1α-proteiinitasojen muutosten kanssa (lisäyskuva 2A). Lisäksi DDRGK1:n vähentäminen lisäsi eIF2α:n fosforylaatiotasoja (p-eIF2α) ja CHOP:n ilmentymistä sekä MCF7- että HepG2-soluissa (Täydentävä kuva 2B). Nämä tulokset osoittavat, että DDRGK1:n köyhdyttäminen tukahduttaa UPR-IRE1α-signalointia ja aktivoi UPR-PERK-apoptoottisen reitin, joka näin ollen käynnistää apoptoosin, kuten kuvissa 1 ja 2 havaittiin. IRE1α:n taso kuitenkin nousi DDRGK1:tä yli-ilmentävissä soluissa annosriippuvaisesti (kuva 3c), kun taas p-PERK:n, PERK:n, ATF6:n, p-IRE1α:n, BiP:n ja XBP1:n splikoidun muodon tasot eivät muuttuneet merkitsevästi (kuva 3c; täydentävät kuvat 2C ja D). Tutkiaksemme DDRGK1:n ja UPR:n välistä toiminnallista suhdetta arvioimme IRE1α:n ja PERK:n dynaamisia muutoksia DDRGK1-knockdown MCF7-soluissa ja kontrollisoluissa Tg-hoidon jälkeen eri ajankohtina. Tg-hoito lisäsi IRE1α:n ja p-IRE1α:n, p-PERK:n ja BiP:n tasoja kontrollisoluissa odotetusti. IRE1α:n kokonaistasot pienenivät kuitenkin merkittävästi (0-24 h), kun taas p-IRE1α:n tasot pienenivät vaatimattomasti (4-24 h) DDRGK1:stä köyhdytetyissä soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuva 3d). Samanaikaisesti XBP1s-taso väheni DDRGK1:stä köyhdytetyissä soluissa verrattuna kontrollisoluihin (4-12 h) (kuva 3e). PERK:n kokonaistasot eivät muuttuneet, mutta p-PERK:n määrä lisääntyi merkittävästi DDRGK1:stä köyhdytetyissä soluissa (0-12 h) (kuva 3d). Samanlaisia tuloksia saatiin HepG2-soluissa (täydentävät kuvat 2E ja F). Kaiken kaikkiaan tuloksemme viittaavat siihen, että DDRGK1:n köyhdyttäminen aiheuttaa IRE1α:n hajoamista ja PERK:n aktivoitumista.

(a) MCF7- ja HepG2-soluja transfektoitiin joko kontrolli-siRNA:lla tai DDRGK1:een kohdistuvalla siRNA:lla 72 h. P-IRE1α:n, IRE1α:n, p-PERK:n, PERK:n, ATF6:n ja BiP:n proteiinipitoisuudet määritettiin western blotilla. (b) MCF7-solut transfektoitiin kontrolli-siRNA:lla tai DDRGK1:tä vastaan suunnatulla siRNA:lla, ja solut kerättiin ilmoitettuina ajankohtina XBP-1:n splikoinnin RT-PCR-analyysia varten. (c) MCF7- ja HepG2-solut transfektoitiin kontrolli- tai DDRGK1-vektoreilla eri annoksilla 36 tunnin ajan. p-IRE1α:n, IRE1α:n, p-PERK:n, PERK:n ja ATF6:n proteiinipitoisuudet määritettiin western blotilla. (d) MCF7-solut transfektoitiin siRNA-kontrollilla tai DDRGK1:een kohdistuvalla siRNA:lla 72 h. Solut kerättiin Western blot -testiin sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty 2,5 μM Tg:llä ilmoitettuina aikoina. (e) RT-PCR-analyysi XBP-1:n splikoitumisesta d. *Kuvastaa epäspesifistä kaistaa.

DDRGK1 säätelee UPR:ää kohdentamalla IRE1α:ta

Er-stressisensorit laukaisevat UPR:n ER-stressin sattuessa ER:n homoeostaasin säätelemiseksi8. On raportoitu, että IRE1α:n hepatosyytti-spesifinen deleetio hiirissä johti UPR-PERK-reitin aktivoitumiseen23. Selvittääksemme, johtuiko DDRGK1-depletoiduissa soluissa havaittu p-PERK:n induktio IRE1α:n alentuneista tasoista, tutkimme p-PERK:n, PERK:n ja sen myötävirran kohteiden tasoja IRE1α-depletoiduissa soluissa. Tulokset osoittivat, että IRE1α:n tyrmäys lisäsi merkittävästi p-PERK:n ja p-eIF2α:n proteiinitasoja sekä MCF7- että HepG2-soluissa (kuva 4a), jotka olivat samankaltaisia kuin ne, jotka havaittiin DDRGK1:stä köyhdytetyissä soluissa (kuva 3a; täydentävä kuva 2B). Nämä tulokset osoittavat, että DDRGK1 säätelee UPR:ää kohdentamalla IRE1α:ta. Tämän jälkeen tutkittiin, miten DDRGK1 säätelee IRE1α:ta. Tuloksemme osoittivat, että IRE1α-proteiinitasot, mutta eivät mRNA-tasot (Täydentävä kuva 3A), pienenivät dramaattisesti DDRGK1-knockdown-soluissa (kuva 3a). Solujen käsittely proteasomin estäjällä MG132 esti DDRGK1-välitteisen IRE1α-proteiinin vähenemisen (Kuva 4b; Täydentävä kuva 3B). Lisäksi havaitsimme, että DDRGK1:n köyhdyttäminen lyhensi dramaattisesti IRE1α:n puoliintumisaikaa sykloheksimidijahdissa (kuva 4c). Näiden havaintojen mukaisesti havaitsimme, että IRE1α:n ektooppinen ilmentyminen paransi solujen eloonjäämistä sekä DDRGK1:stä köyhdytetyissä MCF7- että HepG2-soluissa verrattuna kontrollisoluihin, mikä oli ominaista Annexin V/PI-värjäytymisen ja kaspaasi-3:n aktivoitumisen perusteella (kuvat 4d,e; täydentävät kuvat 3C ja D). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että DDRGK1 säätelee IRE1α:n vakautta ja säätelee siten UPR:ää.

(a). MCF7- ja HepG2-solut transfektoitiin joko kontrolli-siRNA:lla tai IRE1α:aan kohdistuvalla siRNA:lla 72 h. P-PERK:n, PERK:n, p-eIF2α:n ja eIF2α:n proteiinitasot määritettiin western blotilla. (b). IRE1α:n Western blot -analyysi kontrolli- ja DDRGK1-knockdown MCF7-soluissa, joita on käsitelty MG132:lla (20 μM, 8 h) tai ilman sitä. (c). Western blot -analyysi IRE1α:n hajoamisesta kontrolli- ja DDRGK1-knockdown MCF7-soluissa sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty 100 μg ml-1 sykloheksimidillä ilmoitettujen aikojen ajan. Kuvaaja esittää IRE1α-proteiinitasojen kvantifiointia. (d) MCF7-solut transfektoitiin joko kontrolli-siRNA:lla tai DDRGK1:een kohdistuvalla siRNA:lla 72 h. Ennen sadonkorjuuta DDRGK1-knockdown-solut transfektoitiin joko kontrolli- tai IRE1α-vektoreilla 36 h. Tämän jälkeen solut värjättiin Annexin V:llä ja PI:llä ja niille tehtiin virtaussytometrinen analyysi, jonka jälkeen apoptoottisten solujen (Annexin V+) kvantifiointi. Kaikki tiedot esitetään kolmen kokeen keskiarvoina±s.d.. *P<0,05 Studentin t-testillä. (e) IRE1α:n Western blot -analyysi MCF7-soluissa d.

DDRGK1 on vuorovaikutuksessa IRE1α:n kanssa

Ymmärtääksemme, miten DDRGK1 säätelee IRE1α:n stabiilisuutta, testasimme, toimiiko DDRGK1 vuorovaikutuksessa IRE1α:n kanssa vastavuoroisen immunoprecipitaatiomäärityksen (IP-ääritys) avulla HEK293T-soluissa. Tulokset osoittivat, että eksogeenisesti ilmentynyt Flag-IRE1α oli spesifisesti vuorovaikutuksessa endogeenisen DDRGK1:n ja BiP:n kanssa (kuva 5a). Vastaavasti eksogeenisesti ilmentynyt Flag-DDRGK1 oli spesifisessä vuorovaikutuksessa endogeenisen IRE1α:n ja tunnetun DDRGK1-assosioituneen proteiinin C53 kanssa (viite 14). Emme kuitenkaan pystyneet havaitsemaan BiP:tä Flag-DDRGK1-immunoprecipitaateissa (kuva 5b), mikä viittaa siihen, että DDRGK1 ei ehkä ole suoraan vuorovaikutuksessa BiP:n kanssa. IRE1α, joka on endogeeninen ER-assosioituneen hajoamisen (ERAD) substraatti, hajoaa IRE1α:n ja Sel1L-Hrd1 ERAD-kompleksin välisen assosiaation kautta BiP:stä riippuvaisella tavalla24. Tämän vuoksi tutkittiin, osallistuuko BiP DDRGK1:n ja IRE1α:n väliseen vuorovaikutukseen. Tulokset osoittivat, että BiP:n knockdown ei vaikuttanut DDRGK1:n ja IRE1α:n väliseen vuorovaikutukseen (täydentävä kuva 4). DDRGK1:n ja IRE1α:n vuorovaikutuksen vahvistamiseksi edelleen suoritimme immunofluoresenssivärjäyskokeita. Tulokset osoittivat, että nämä kaksi proteiinia olivat yhdessä lokalisoituneet ER:ssä (Kuva 5c). Kartoittaaksemme alueen, joka osallistuu IRE1α:n ja DDRGK1:n vuorovaikutukseen, transfektoimme Flag-IRE1α:n villiä tyyppiä ja typistymämutantteja yhdessä DDRGK1:n kanssa HEK293T-soluihin, ja IP-tulokset osoittivat, että IRE1α:n sytoplasminen kinaasidomeeni oli välttämätön sen vuorovaikutukselle DDRGK1:n kanssa (kuva 5d). DDRGK1:n ja IRE1α:n vuorovaikutuksen dynaamisten muutosten ymmärtämiseksi ER-stressiolosuhteissa HEK293T-solut transfektoitiin Flag-DDRGK1:llä ja niitä käsiteltiin Tg:llä eri ajankohtina. Odotetusti havaitsimme, että IRE1α:n kokonaismäärä, p-IRE1α ja BiP lisääntyivät merkittävästi ER-stressin aikana. Mielenkiintoista oli, että havaitsimme, että DDRGK1 oli spesifisesti vuorovaikutuksessa fosforyloimattoman IRE1α:n, mutta ei p-IRE1α:n kanssa immunoprecipitaateissa (kuva 5e). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DDRGK1 on vuorovaikutuksessa fosforyloimattoman IRE1α:n kanssa ja ylläpitää sen vakautta.

(a). Western blot -analyysi Flag M2 -affiniteettigeelin immunoprecipitaateista HEK293T-soluissa, jotka on transfektoitu Flag-vektorilla tai Flag-IRE1α-vektoreilla 36 h. (b). Western blot -analyysi Flag M2 -affiniteettigeelin immunoprecipitaateista HEK293T-soluissa, jotka on transfektoitu Flag-vektorilla tai Flag-DDRGK1-vektorilla 36 h. (c). MCF7-solut immunovärjättiin kahdesti anti-DDRGK1-vasta-aineella (vihreä) ja anti-IRE1α-vasta-aineella (punainen). Solujen tumat vastavärjättiin DAPI:lla (sininen). Kahden endogeenisen proteiinin, DDRGK1:n ja IIRE1α:n, yhteislokalisaatio näkyy yhdistelmäpaneelissa. Mittakaavapalkki, 20 μm. (d) IRE1α:n villityyppisten ja typistettyjen konstruktioiden kaaviot ja Flag M2 -affiniteettigeelin immunoprecipitaattien western blot -analyysi HEK293T-soluissa, jotka on transfektoitu Flag-vektorilla tai Flag-IRE1α:n villityypillä ja typistyksillä. (e) Western blot -analyysi Flag M2 -affiniteettigeelin immunoprecipitaateista mock- tai Tg-käsitellyissä (2,5 μM) HEK293T-soluissa, jotka ilmentävät Flag-Vektoria tai Flag-DDRGK1:tä.

Ufm1 tarvitaan DDRGK1:n ja IRE1α:n vuorovaikutukseen

Viimeaikaisessa tutkimuksessa osoitettiin, että DDRGK1 on ufmylaatiosubstraatti ja sitä tarvitaan ASC1:n ufmylaatioon15,20. Selvittääksemme, liittyykö ufmylaatio DDRGK1:n harjoittamaan IRE1α:n vakauden säätelyyn, tutkimme, vaikuttaako Ufm1:n köyhdyttäminen IRE1α-proteiinin ilmentymiseen. Samoin kuin DDRGK1:n depletion yhteydessä havaitsimme, että Ufm1:n ilmentymisen tyrmäys vähensi dramaattisesti IRE1α-proteiinin määrää (kuva 6a), mikä osoittaa, että DDRGK1 säätelee IRE1α:ta ufmylaation kautta. Vastaavasti havaitsimme, että DDRGK1:n yliekspressio ei vakauttanut IRE1α-proteiinia Ufm1-knockdown MCF7-soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuva 6b). Lisäksi IRE1α-proteiinipitoisuudet pienenivät dramaattisesti Ufm1-knockdown MCF7-soluissa sekä Tg:n puuttuessa että sen läsnä ollessa (kuva 6c), mikä viittaa siihen, että ufmylaatiota tarvitaan DDRGK1:n suorittamaan IRE1α-proteiinin vakauden säätelyyn. Tämän jälkeen pohdimme, onko IRE1α alttiina ufmylaatiomodifikaatiolle. Tämän kysymyksen ratkaisemiseksi havaitsimme IRE1α:n ufmylaation soluissa, jotka ilmentävät DDRGK1:tä ja Ufm1:tä sekä UBA5:tä (E1), UFC1:tä (E2) ja UFL1:tä (E3), kuten aiemmin on kuvattu20. Emme kuitenkaan pystyneet havaitsemaan IRE1α-proteiinin ufmylaatiota, vaikka DDRGK1-proteiinin ufmylaatio oli helposti havaittavissa, kuten aiemmin on kuvattu (tietoja ei ole esitetty)15,20,25, mikä viittaa siihen, että IRE1α ei ehkä ole ufmylaation kohde. Mielenkiintoista oli, että havaitsimme, että DDRGK1:n ja IRE1α:n välinen assosiaatio väheni merkittävästi Ufm1-knockdown HEK293T-soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuva 6d). Tämän havainnon kanssa sopusoinnussa havaitsimme, että DDRGK1 K267R:n (DDRGK1-mutantti, jonka ufmyloituminen on puutteellista ja jossa lysiinijäännös 267 on korvattu arginiinijäännöksellä)15 vuorovaikutus IRE1α:n kanssa väheni dramaattisesti verrattuna villityyppiseen DDRGK1:een (kuva 6e), mikä osoittaa, että DDRGK1:n ufmyloitumista tarvitaan DDRGK1:n ja IRE1α:n väliselle assosiaatiolle. Lisäksi DDRGK1 K267R ei vakauttanut IRE1α-proteiinia verrattuna villityypin DDRGK1:een (kuva 6f). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että DDRGK1:n ufmylaatio K267:n kohdalla on välttämätöntä sen vuorovaikutukselle IRE1α:n kanssa ja IRE1α-proteiinin vakauden säätelylle.

(a) MCF7-soluja transfektoitiin joko kontrolli-siRNA:lla tai Ufm1:een kohdistuvalla siRNA:lla 72 h. IRE1α:n proteiinipitoisuudet määritettiin western blotilla. (b) IRE1α:n Western blot -analyysi kontrolli- ja Ufm1-knockdown MCF7-soluissa, jotka ilmentävät vektoria tai DDRGK1:tä. (c) IRE1α:n proteiinitaso määritettiin western blotilla kontrolli- ja Ufm1-knockdown MCF7-soluissa sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty 2,5 μM Tg:llä ilmoitettujen aikojen ajan. (d) Western blot -analyysi Flag M2 -affiniteettigeelin immunoprecipitaateista HEK293T-kontrolli- ja Ufm1-knockdown-soluissa, jotka ilmentävät Flag-vektoria tai Flag-DDRGK1:tä. (e) Western blot -analyysi Flag M2 -affiniteettigeelin immunoprecipitaateista HEK293T-soluissa, jotka on transfektoitu Flag-Vectorilla, Flag-DDRGK1 WT:llä tai K267R-mutantilla. (f) IRE1α:n Western blot -analyysi MCF7-soluissa, jotka on transfektoitu Flag-vektorilla, Flag-DDRGK1 WT:llä tai K267R-mutantilla.

DDRGK1:tä tarvitaan HSC:n rekonstituutiokykyyn hiirissä

Viimeisimmässä tutkimuksessa esitettiin, että hematopoieettiset kantasolut (HSC:t) ovat erittäin herkkiä ER-stressille26. Tämä sai meidät arvelemaan, että DDRGK1 saattaa olla kriittinen tekijä HSC:n toiminnassa. Määritimme ensin DDRGK1:n ilmentymistason useissa hematopoieettisissa linjoissa 2 kuukauden ikäisistä villityypin hiiristä. Q-PCR paljasti, että DDRGK1:n ilmentymistaso oli huomattavasti korkeampi HSC:ssä, mukaan lukien pitkäaikaiset HSC:t (LT-HSC:t), lyhytaikaiset HSC:t (ST-HSC:t) ja multipotentit esiasteet (MPP:t) (kuva 7a). Lisäksi DDRGK1:n proteiinitaso ilmentyi voimakkaasti HSC-rikastuneissa Lineage-c-Kit+ luuytimen (BM) soluissa verrattuna Lineage+c-Kit- BM-soluihin (kuva 7b). Nämä havainnot viittaavat DDRGK1:n tärkeään rooliin kantasoluissa. DDRGK1:n roolin tutkimiseksi HSC:n toiminnassa tehtiin kilpailullisia siirtokokeita HSC-soluilla DDRGK1:n lentiviraalisen knockdownin jälkeen (kuva 7c). CD45.1-luovuttajahiiristä saadut Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) -solut transdusoitiin kontrolli- tai DDRGK1-knockdown-lenkkiviruksella ja siirrettiin letaalisesti säteilytettyihin CD45.2-reseptorihiiriin. Virtaussytometrinen analyysi osoitti, että luovuttajalta peräisin olevien perifeerisen veren (PB) solujen prosenttiosuus väheni merkittävästi DDRGK1:n tyrehdyttämisryhmässä kontrolliin verrattuna, mikä osoitti, että DDRGK1:n tyrehdyttäminen heikensi merkittävästi HSC:iden kilpailukykyistä rekonstituutiokykyä (kuva 7d). Vaikka ei-kilpailullisessa elinsiirtokokeessa DDRGK1-knockdown HSC-soluilla siirretyt vastaanottajahiiret olivat edelleen elossa 3 kuukautta elinsiirron jälkeen, tämä viittaa siihen, että DDRGK1:n knockdown vain heikentää HSC-solujen kilpailukykyistä rekonstituutiokykyä. Kohteen ulkopuolisten vaikutusten poissulkemiseksi suunnittelimme toisen DDRGK1:een kohdistuvan shRNA:n ja havaitsimme samankaltaisia tuloksia (täydentävä kuva 5A). Kolme kuukautta elinsiirron jälkeen vastaanottajahiiret lopetettiin BM-analyysiä ja in vitro -pesäkkeiden muodostusmäärityksiä varten. Virtaussytometrinen analyysi osoitti, että DDRGK1:n tyrmäys heikentää dramaattisesti transduktoitujen HSC-solujen ylläpitoa vaikuttamatta niiden linjapotentiaaliin (eli myeloidi-, B-solu- ja T-solulinjoihin), kuten osoitti luovuttajalta peräisin olevien hematopoieettisten kantasolujen ja esisolujen sekä erilaistuneiden hematopoieettisten solujen pienentynyt esiintymistiheys BM:ssä ja PB:ssä (kuva 7e). Samanlainen tulos havaittiin riippumattomassa kokeessa, jossa käytettiin toista DDRGK1:een kohdistuvaa shRNA:ta (täydentävä kuva 5B). Lisäksi eristimme luovuttajalta peräisin olevia CD34-Flt3-LSK-soluja (LT-HSC-solut) vastaanottajahiiristä ja suoritimme yhden solun pesäkkeen muodostusmäärityksen. Tulokset osoittivat, että DDRGK1:n knockdown heikensi HSC-solujen kykyä muodostaa keskikokoisia ja suuria pesäkkeitä (kuva 7f). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että DDRGK1:tä tarvitaan HSC:n toiminnan ylläpitämiseen.

(a) Q-PCR-analyysi DDRGK1:n suhteellisista mRNA-ekspressiotasoista nuorista villityypin hiiristä (2 kk:n ikäiset, n=3) peräisin olevan BM:n ilmoitetuissa osapopulaatioissa. DDRGK1:n suhteellinen ilmentyminen normalisoitiin GAPDH:n suhteen. Tiedot esitetään keskiarvoina±s.d. (b) DDRGK1:n Western blot -analyysi rikastetuissa Lineage+ c-Kit- ja Lineage- c-Kit+ -soluissa nuorista villityypin hiiristä (2 kuukauden ikäiset). (c) Kokeellinen kaaviokuva rekonstituutiotestistä. (d) Edustava FACS-kuvio, joka osoittaa GFP-positiivisten solujen prosenttiosuuden luovuttajalta peräisin olevissa kontrollisoluissa (sh-vektori) tai DDRGK1-knockdown (sh-DDRGK1) PB-soluissa (vasen paneeli). Arvot edustavat luovuttajalta peräisin olevien GFP+-solujen normalisoituja prosentuaalisia osuuksia kokonaissiirrosta (oikea paneeli, n=3). Tiedot esitetään keskiarvoina±s.d. **P<0.01 ja ***P<0.001 Studentin t-testillä. (e) Arvot edustavat luovuttajalta peräisin olevien GFP+-solujen prosenttiosuuksia LT-HSC:ssä (CD34-Flt3- LSK), ST-HSC:ssä (CD34+Flt3- LSK), MPP:ssä (CD34+Flt3+ LSK), CMP:ssä (CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B-, T- ja myelooisen linjan solupopulaatiot primaaristen vastaanottajahiirien BM:ssä 12 viikkoa siirron jälkeen (n=3). Tiedot esitetään keskiarvoina±s.d. ***P<0.001 Studentin t-testillä. (f) Yksittäiset luovuttajalta peräisin olevat GFP+ LT-HSC:t vastaanottajahiiristä lajiteltiin 96-kuoppalevyihin ja niitä viljeltiin 14 päivän ajan in vitro. Pesäkkeiden prosenttiosuus laskettiin jakamalla pesäkkeiden lukumäärä kylvettyjen yksittäisten solujen alkuperäisellä määrällä. Tiedot esitetään keskiarvoina±s.d. **P<0.01 Studentin t-testillä.

Tutkittaessa, johtuiko heikentynyt HSC-toiminta heikentyneestä homing-tehokkuudesta, merkitsimme kontrolli- tai sh-DDRGK1-lentsiviraalilla transdusoituja, 2 kuukauden ikäisistä hiiristä puhdistettuja LSK-soluja fluoresoivalla väriaineella (violetilla) ja ruiskutimme ne letaalisesti säteilytettyihin vastaanottajiin. Merkittyjen LSK-solujen prosenttiosuus vastaanottajan BM:ssä 18 tuntia siirron jälkeen analysoitiin virtaussytometrialla. Tulokset osoittivat, että DDRGK:ta alentavien LSK-solujen kotiutumiskyky oli verrattavissa kontrollisolujen kykyyn (täydentävät kuvat 6A ja B). Määrittääksemme, oliko DDRGK1:n tyrmäyksellä vaikutusta LSK-solujen solusyklin tilaan, värjäsimme luovuttajalta peräisin olevat kontrolli- ja DDRGK1-knockdown LSK-solut proliferaatiomarkkerilla Ki67 ja DAPI:lla ja havaitsimme, että DDRGK1-knockdown HSC-solujen ja kontrolli HSC-solujen solusykliprofiileissa ei ollut merkittävää eroa (lisäyskuva 7A). Tämän jälkeen tarkasteltiin DDRGK1-knockdownin vaikutusta HSC-solujen apoptoosiin käyttämällä Annexin V -värjäystä ja havaittiin, että luovuttajalta peräisin olevissa DDRGK1-knockdownin LSK-soluissa apoptoosin esiintymistiheys oli merkittävästi korkeampi kuin kontrollin LSK-soluissa; tämä ilmiö havaittiin molemmilla DDRGK1:een kohdistuvilla shRNA:illa (kuva 8a; täydentävä kuva 7B). Seuraavaksi tutkittiin reaktiivisten happilajien (ROS) tasoja transduktoiduissa HSC-soluissa. Tulokset osoittivat, että ROS-taso oli vertailukelpoinen kontrolli- ja DDRGK1-knockdown-ryhmien välillä (täydentävä kuva 7C). Edellä esitettyjen havaintojen perusteella päättelimme, että DDRGK1:n knockdown HSC:ssä indusoi apoptoottista solukuolemaa ja heikentää siten HSC:n toimintaa.

(a) Edustava FACS-kuvio, joka osoittaa Annexin V-positiivisten solujen prosentuaalisen osuuden luovuttajalta peräisin olevissa kontrolli- ja DDRGK1-knockdown LSK-soluissa siirron jälkeen (vasen paneeli). Pylväsdiagrammi osoittaa Annexin V-positiivisten solujen prosenttiosuuden LSK-soluissa (oikea paneeli, n=3). Tiedot esitetään keskiarvoina±s.d. *P<0.05 Studentin t-testillä. (b) Q-PCR-analyysi DDRGK1:n, BiP:n ja CHOP:n suhteellisista mRNA-ekspressiotasoista luovuttajalta peräisin olevissa kontrollisoluissa ja DDRGK1-knockdown LSK-soluissa siirron jälkeen (n=3). Tiedot esitetään keskiarvoina±s.d. **P<0.01 ja ***P<0.001 Studentin t-testillä. (c) Western blot -analyysi p-IRE1α:sta, IRE1α:sta, p-PERK:sta, PERK:sta ja ATF6:sta luovuttajalta peräisin olevissa GFP+Lineage-c-Kit+-soluissa, jotka on rikastettu kontrolli- tai DDRGK1-knockdown-vastaanottajahiiristä. *Kuvastaa epäspesifistä kaistaa. (d) RT-PCR-analyysi XBP-1:n splikoinnista luovuttajalta peräisin olevissa kontrolli- ja DDRGK1-knockdown LSK-soluissa siirron jälkeen. Tg-käsiteltyjä MEF-soluja käytettiin XBP-1-splikoinnin kontrollina.

Tutkiaksemme, johtuiko heikentynyt HSC-toiminta ER-stressivasteen aktivoitumisesta DDRGK1-knockdown HSC-soluissa, analysoimme BiP:n ja CHOP:n ilmentymistasot Q-PCR:llä kontrolloiduissa ja DDRGK-knockdown-yksilöityneissä siirretyissä HSC-soluissa, tulokset osoittivat, että BiP:n ja CHOP:n mRNA-tasot kasvoivat merkitsevästi DDRGK1-knockdown-yksilöityneissä HSC:issä (Kuvio 8b). Lisäksi tutkittiin ER-stressisensoreiden proteiinitasoja kontrolli- ja DDRGK-knockdown Lineage-c-Kit+ BM-soluissa. Syöpäsolulinjoissa tehdyn havainnon mukaisesti DDRGK1:n knockdown osoitti IRE1α:n ja p-IRE1α:n alentuneita proteiinitasoja ja p-PERK:n lisääntynyttä tasoa, kun taas ATF6-tasot eivät eronneet kontrolli- ja DDRGK1-knockdown-ryhmissä (kuva 8c). Vastaavasti XBP1s:n taso laski luovuttajalta peräisin olevissa DDRGK1-knockdown LSK-soluissa (kuva 8d). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että DDRGK1:n knockdown heikentää IRE1α-signalointia, mutta aktivoi PERK-reitin, ja tukevat entisestään sitä, että DDRGK1 on kriittinen ER-homeoostaasin asianmukaisen ylläpidon kannalta ja siten välttämätön HSC:iden selviytymisen ja ylläpidon kannalta.